의 미세 주입을위한 방법<em> Patiria의 minata</em> 접합자
Summary
morphant 배아를 생성하는 방법은 발달 메커니즘과 유전자 규제 네트워크를 연구하는 것이 필수적이다. 바다 스타 Patiria miniata는 이러한 연구에 대한 새로운 모델 시스템입니다. 여기서 우리는 배아의 문화를, 배우자를 얻기 생산을위한 프로토콜,이 종 접합자의 빠른 미세 주입을 제시한다.
Abstract
극피 동물은 긴 유전자 조절 및 개발 프로세스의 진화의 연구를 위해 최근 재생 및 개발 연구에 좋아하는 모델 시스템되어하고있다. 바다 스타, Patiria miniata는 이전에 성게, Strongylocentrotus의 purpuratus 및 Lytechinus의 variegatus에 거의 독점적으로 수행 된 이러한 유형의 연구를위한 모델 시스템으로 유행을 얻고있다. 이러한 모델 시스템의 장점은 어떤 특정 유전자, 또는 하향 조절 최대 인 셀 그룹 라벨링, 또는 리포터 유전자 도입 배아 변경됨 제조 용이성이다. 단일 마이크로 인젝션 법은 변형 된 배아의 다양한을 생성 할 수있다. 여기서는 P.에서 생식 세포를 얻기위한 방법을 제시 miniata,이 배아를 생산하고, 미세 주입을 통해가 혼란 시약을 도입. 건강 morphant 배아는 이후 GE의 양적 및 질적 연구에 고립 아르네브라스카 기능. 이 유기체의 게놈 및 사체 데이터의 가용성을 수행하고이를 실행의 용이성되는 연구의 종류가 증가하고있다.
Introduction
(일반적으로 박쥐 스타로 알려진) 바다 스타, Patiria miniata는 6-8 진화 4,5 발달 세포 1 세의 다양한, 그리고 생태 학적 연구 9 11에 대한 재미 있고 다양한 모델 시스템으로 부상하고있다. 성인 P. miniata 바하 캘리포니아 12 싯카, 알래스카의 태평양 해안을 따라 분포하고 쉽게 해양 수족관에서 유지됩니다. 난 모세포를 얻을 연중 각 여성 수십 계란의 수천을 흘리다 수 있습니다. 난 모세포 쉽게 성숙 외부 13 기름지게한다. 생성 된 배아는 쉽게 관찰을 가능하게 투명; 그들은 기적으로 개발하고, 개발을 위해 만들어진 프로그램 만 바다 물을 필요로합니다. 전체 게놈 조립 및 여러 transcriptomes도 P. 사용할 수 있습니다 miniata ( Echinobase.org ). 이러한 장점은 연구의 범위에 이상적및 교육 목적.
최근, P. miniata 발달 유전자 규제 네트워크에 대한 모델 시스템은 14 – 16를 분석되고있다. 이러한 연구의 목표는 조절 유전자의 전체 칭찬을 식별하고 그들의 상호 작용 네트워크를 결정하는 것이다. 이 작업의 대부분은 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 체외 합성의 mRNA의 도입을 통해 섭동 유전자 발현을 수반한다. 또한, 규제 시스 분석 규제 DNA (15)의 기능을 특성화하는 데 사용된다. 이러한 분석은 교란 시약 및 / 또는 DNA 기자 배아에 구축의 도입이 필요합니다. 또한, 이들 섭동의 하류 효과를 특성화하기 위해, 하나의 잠재적 인 표적 유전자 발현의 변화를 위해 많은 배아 세이한다. 접합자의 수백의 미세 주입하는 기술이 작업 중심입니다.
P. 포함 극피 동물, miniata </엠>, 성적 성숙에 도달하기 위해 몇 달이 필요합니다. 이 때문에 개발 및 실험에 대한 이들 동물의 유전자 변형 라인을 유지하는 것은 일반적으로 실용적이지 않다. 따라서, 유전자 변형 성인의 번식을 효율적으로 배아를 수정 만들 수 없습니다. 대신, 교란은 미세 주입을 통해 새로이 발생해야합니다. 미세 주입 세포 투과하지 않은 약으로 배아를 수정할 수있는 기회를 제공합니다. 다음 프로토콜은 한 2 ~ 3 시간이 미세 주입을 통해 앉아 수정란의 수백 DNA, mRNA의 세포 추적자, 및 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 소개하는 방법을 설명합니다. 이 포함 하류 다양한 실험에 충분한 재료를 생산하고 있지만, 현장 하이브리드, RNA-SEQ, 서부 모래 바닥에, qPCR에 바, 이에 한정되지는 않는다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기술의 초보 사용자 어렵지만 성공적으로 morphant 배아를 만들기위한 필수적인 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 성숙하고 적절하게 비옥 것이다 건강한 난자를 선택하는 것입니다. 배양 정상적인 발달의 비율이 계절에 따라, 동물의 건강과 난자들이 단일 개별에서 수확 된 횟수. 난 모세포 월 ~ 10 년 4 ~ 더 나은 품질의 경향이있다. 그것은 대부분의 그림 2A보다는 그림 2B처?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) IOS 0,844,948 및 1,024,811 IOS에 의해 지원되었다
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader Tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
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