morphant 배아를 생성하는 방법은 발달 메커니즘과 유전자 규제 네트워크를 연구하는 것이 필수적이다. 바다 스타 Patiria miniata는 이러한 연구에 대한 새로운 모델 시스템입니다. 여기서 우리는 배아의 문화를, 배우자를 얻기 생산을위한 프로토콜,이 종 접합자의 빠른 미세 주입을 제시한다.
극피 동물은 긴 유전자 조절 및 개발 프로세스의 진화의 연구를 위해 최근 재생 및 개발 연구에 좋아하는 모델 시스템되어하고있다. 바다 스타, Patiria miniata는 이전에 성게, Strongylocentrotus의 purpuratus 및 Lytechinus의 variegatus에 거의 독점적으로 수행 된 이러한 유형의 연구를위한 모델 시스템으로 유행을 얻고있다. 이러한 모델 시스템의 장점은 어떤 특정 유전자, 또는 하향 조절 최대 인 셀 그룹 라벨링, 또는 리포터 유전자 도입 배아 변경됨 제조 용이성이다. 단일 마이크로 인젝션 법은 변형 된 배아의 다양한을 생성 할 수있다. 여기서는 P.에서 생식 세포를 얻기위한 방법을 제시 miniata,이 배아를 생산하고, 미세 주입을 통해가 혼란 시약을 도입. 건강 morphant 배아는 이후 GE의 양적 및 질적 연구에 고립 아르네브라스카 기능. 이 유기체의 게놈 및 사체 데이터의 가용성을 수행하고이를 실행의 용이성되는 연구의 종류가 증가하고있다.
(일반적으로 박쥐 스타로 알려진) 바다 스타, Patiria miniata는 6-8 진화 4,5 발달 세포 1 세의 다양한, 그리고 생태 학적 연구 9 11에 대한 재미 있고 다양한 모델 시스템으로 부상하고있다. 성인 P. miniata 바하 캘리포니아 12 싯카, 알래스카의 태평양 해안을 따라 분포하고 쉽게 해양 수족관에서 유지됩니다. 난 모세포를 얻을 연중 각 여성 수십 계란의 수천을 흘리다 수 있습니다. 난 모세포 쉽게 성숙 외부 13 기름지게한다. 생성 된 배아는 쉽게 관찰을 가능하게 투명; 그들은 기적으로 개발하고, 개발을 위해 만들어진 프로그램 만 바다 물을 필요로합니다. 전체 게놈 조립 및 여러 transcriptomes도 P. 사용할 수 있습니다 miniata ( Echinobase.org ). 이러한 장점은 연구의 범위에 이상적및 교육 목적.
최근, P. miniata 발달 유전자 규제 네트워크에 대한 모델 시스템은 14 – 16를 분석되고있다. 이러한 연구의 목표는 조절 유전자의 전체 칭찬을 식별하고 그들의 상호 작용 네트워크를 결정하는 것이다. 이 작업의 대부분은 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 체외 합성의 mRNA의 도입을 통해 섭동 유전자 발현을 수반한다. 또한, 규제 시스 분석 규제 DNA (15)의 기능을 특성화하는 데 사용된다. 이러한 분석은 교란 시약 및 / 또는 DNA 기자 배아에 구축의 도입이 필요합니다. 또한, 이들 섭동의 하류 효과를 특성화하기 위해, 하나의 잠재적 인 표적 유전자 발현의 변화를 위해 많은 배아 세이한다. 접합자의 수백의 미세 주입하는 기술이 작업 중심입니다.
P. 포함 극피 동물, miniata </엠>, 성적 성숙에 도달하기 위해 몇 달이 필요합니다. 이 때문에 개발 및 실험에 대한 이들 동물의 유전자 변형 라인을 유지하는 것은 일반적으로 실용적이지 않다. 따라서, 유전자 변형 성인의 번식을 효율적으로 배아를 수정 만들 수 없습니다. 대신, 교란은 미세 주입을 통해 새로이 발생해야합니다. 미세 주입 세포 투과하지 않은 약으로 배아를 수정할 수있는 기회를 제공합니다. 다음 프로토콜은 한 2 ~ 3 시간이 미세 주입을 통해 앉아 수정란의 수백 DNA, mRNA의 세포 추적자, 및 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 소개하는 방법을 설명합니다. 이 포함 하류 다양한 실험에 충분한 재료를 생산하고 있지만, 현장 하이브리드, RNA-SEQ, 서부 모래 바닥에, qPCR에 바, 이에 한정되지는 않는다.
이 기술의 초보 사용자 어렵지만 성공적으로 morphant 배아를 만들기위한 필수적인 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 성숙하고 적절하게 비옥 것이다 건강한 난자를 선택하는 것입니다. 배양 정상적인 발달의 비율이 계절에 따라, 동물의 건강과 난자들이 단일 개별에서 수확 된 횟수. 난 모세포 월 ~ 10 년 4 ~ 더 나은 품질의 경향이있다. 그것은 대부분의 그림 2A보다는 그림 2B처?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) IOS 0,844,948 및 1,024,811 IOS에 의해 지원되었다
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
Microloader Tips | Eppendorf | 5242 956.003 |