Summary
Fjernelsen af øjne, også kaldet enucleation, giver en nyttig strategi til at studere aspekter af visuel, cross-modal, og udviklingsmæssige plasticitet langs pattedyr visuelle system, da det inducerer irreversibel partiel (monokulære) eller fuldstændig (kikkert) synstab. Her beskriver vi en meget reproducerbar og enkel tilgang til at udføre in vivo enucleation.
Abstract
Enucleation eller kirurgisk fjernelse af et øje kan generelt betragtes som en model for nerve deafferentiering. Det giver et værdifuldt værktøj til at studere de forskellige aspekter af visuel, cross-modal og udviklingsmæssige plasticitet langs pattedyr visuelle system 1-4.
Her vil vi demonstrere en elegant og enkel teknik til fjernelse af den ene eller begge øjne i musen, som er valideret i mus af 20 dage gamle, op til voksne. Kort fortalt er en desinficerede buet pincet bruges til at klemme synsnerven bag øjet. Efterfølgende cirkulære bevægelser udføres for at snøre synsnerven og fjern øjeæblet. Fordelene ved denne teknik er høj reproducerbarhed, minimal eller ingen blødning, hurtig postoperative forløb og en meget lav tærskel læring for forsøgslederen. Derfor kan en stor mængde af dyr manipuleret og behandles med minimal indsats. Arten af teknikken kan fremkalde mindre beskadigelsenethinden under proceduren. Denne bivirkning gør denne metode mindre egnet i forhold til Mahajan et al. (2011) 5, hvis målet er at indsamle og analysere retinavæv. Desuden er vores metode er begrænset til post-øjenåbnende aldre (mus: P10 - 13 og fremefter), da øjeæblet skal fortrænges fra stikkontakten uden at fjerne øjenlåg. In vivo enucleation teknikken beskrevet i dette manuskript er for nylig blevet anvendt med succes med mindre modifikationer i rotter og synes nyttigt at studere afferente visuelle pathway gnavere i almindelighed.
Introduction
Fjernelse af et øje og derved uigenkaldeligt destructing den sensoriske receptor overflade (nethinden), pålægger et betydeligt tab af sanseindtryk ad visuel vej. Den enucleation model i unge og voksne visuelle system har vist sig at være værdifulde i at forstå udviklingen, plasticitet og funktion af forskellige visuelle centre 1-4. De molekylære, cellulære og fysiologiske konsekvenser af denne sensoriske afsavn kan give indsigt i, hvordan en normal udvikling er reguleret, og hvor der er etableret kortikale kredsløb klare og ændre deres struktur og funktion som reaktion på en så omfattende ændring i erfaring.
Der findes forskellige metoder til visuel afsavn og de har alle deres særlige fordele i synet-relateret forskning. For eksempel mørk opdræt specifikt eliminerer visuelt drevet aktivitet endnu påvirker det ikke den spontane retinal aktivitet. Ligeledes låg suturer eller eye patches fjern mønstrede udstyr og forretnil input uden at forstyrre spontan aktivitet, men de tillader spredte lys indtrængen gennem de lukkede øjne. Disse metoder er reversible og har vist sig at være værdifulde i at forstå den rolle, mønstrede vision og lavt niveau korrelation af binokulære inputs sculpting kortikale kredsløb under udviklingen 6-8. I glaukom forskning har synsnerven knuse model i voksne dyr er ofte blevet brugt, fordi det etablerer en fremadskridende tab af retinale ganglieceller indgange, der udgør synsnerven 9,10. På den anden side, enucleation, hvor øjet og dermed nethinden er fuldstændigt og øjeblikkeligt fjernet, er et passende valg af afsavn, når målet er at irreversibelt at fjerne både spontan og mønstret syn på én gang. Det inducerer også en robust aktivitet ubalance intraokulært som kan øge signal-støj-forholdet i aktivitet kortlægningsundersøgelser 11,12. Sammenligning funktionelle og strukturelle ændringer som reaktion på enucleation med thOSE efter afsavn ved mindre drastiske metoder såsom låg sutur for eksempel, kan også udsætte nye indsigter i den rolle, spontan retinal aktivitet i både homeostatiske og synaptiske typer af plasticitet.
Enucleation udløser et tab af trofiske påvirkninger i direkte retinale mål. For eksempel er BDNF niveauer betydeligt nedreguleret i lateral geniculate nucleus (LGN) og overlegen colliculus af voksne udkernet rotter 13. Reaktive ilt arter, der fungerer som messenger-molekyler til at mediere strukturelle ombygninger, blev også påvist i subkortikale strukturer voksne rotter visuelle system 14. Desuden mikroglial og astroglial aktivering på tværs af forskellige subkortikale visuelle målstrukturerne i musen forekomme i en bestemt stilling-enucleation tidsramme på en uge 15. Sammen optiske deafferentiering resultater i forskellige subkortikale reaktioner på glia, strukturelle og molekylære niveau. Trods disse subkortikaleffekter, er det ikke nødvendigvis implicere virkninger på det kortikale niveau 16. Bemærkelsesværdigt, cross-modal kortikal plasticitet, herunder ændringer i andre sensoriske områder ved siden af en styrkelse af ikke-visuelle input til frataget visuelle cortex opstå efter både monokulære (ME) 3,4,17,18 og kikkert (BE) 1,17 enucleation.
Bortset fra at bidrage til visuel neuroscience kan enucleation som en slags deafferentiering anvendes til at studere ligevægt mellem neurobeskyttende 19 og neurodegenerative 20-22 egenskaber i det centrale nervesystem.
Forskellige procedurer til at udføre enucleation er allerede beskrevet i litteraturen. Visse metoder til in vivo mig i rotter og mus er mindre ligetil på grund af unødvendigt sektionering af positionsressourcer muskler og væv 23-25. Andre publikationer såsom Mahajan mfl. (2011) 5 giver en detaljeret protokol hjælp stump dissektion for en high-throughput samling af øjnene for at studere genotype-fænotype korrelationer, sandsynligvis efter slagtning. For deres formål, metoden er praktisk og hurtig. Men denne metode er mindre egnet til in vivo enucleation når man vælger at studere afferente visuel vej efter enucleation (levende dyr) snarere end selve øjet. I sådan en indstilling, post-enucleation overlevelse er af stor betydning. Også minimal in vivo skader og bevarelse af synsnerven og orbital væv er gunstig. Her præsenteres en alternativ enucleation metode, mere ligner den beskrevet af Faguet et al (2008) 26, der tilbyder visse fordelagtige egenskaber:. Det er forbundet med en hurtig postoperative forløb og er kendetegnet ved en meget lav tærskel læring for forskere. I almindelighed forskellige metoder supplerer hinanden, afhængigt af fokus for efterfølgende forskning: øje morfologi eller visuel vej forskning.
ve_content "> Sammenfattende kan enucleation anvendes fra vision forskning mod undersøgelser af homeostatisk og tværs modal hjernens plasticitet, gliøse respons egenskaber og Axon stabilitet. I denne visualiseret artikel viser vi en realistisk og pålidelig metode til in vivo øje enucleation i musen.Protocol
Alle forsøg blev godkendt af den etiske forskning udvalg af KU Leuven og var i nøje overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers direktiv af 22. september 2010 (2010/63 / EU) og med den belgiske lovgivning (KB af 29. maj 2013). Enhver mulig indsats blev gjort for at minimere dyrenes lidelser, og for at reducere antallet af dyr.
1. DYR og narkotiske midler
- Bedøver mus med en intraperitoneal injektion af en blanding af ketamin-hydrochlorid (75 mg / ml) og medetomidinhydrochlorid (1 mg / kg) i saltvand.
- Kontroller reflekser ved at klemme tæerne med en pincet til at forsikre musen er helt bedøvet.
- Anvend 70% ethanol for at desinficere øjenlåg og området omkring øjet ved hjælp af en vatpind. Kontroller øjenlåget refleks til yderligere vurdere graden af sedation.
2. Fjernelse af Eye
- Sørg for, at dyret er bosat på en flad, tør ogglat overflade.
- Sterilisere en pincet med en buet, savtakket spids (foretrukken dysestørrelse: 0,5 x 0,4 mm).
- Tryk forsigtigt på øjenkrog (hjørnet af øjet) med pincet, indtil øjeæblet er fordrevet ud af stikkontakten og synsnerven kan nås.
- Guide pincet bag øjet. Tryk og hold den optiske nerve fast, helst med begyndelsen af kurven og ikke selve spidsen af tangen. Dette vil bidrage til at løfte hele kloden ud af stikkontakten og at klemme den komplette synsnerven.
- Gør cirkulære bevægelser med hånd, der holder tangen i retningen med mindst modstand, mens musen forbliver på flad overflade. Musen svinger langs overfladen ifølge retningen af håndbevægelse.
- Udfør denne handling med gradvist stigende hastighed, indtil synsnerven indsnævres i to (normalt mellem 7 til 15 cirkulære bevægelser, cirka en halv til en hel omgang pr sekund). Derfor er den fritliggende øjeæble erfjernes.
3. Postoperativ pleje
- I tilfælde af blødning (sjælden), fylde bane med en tyktflydende koagulerer, og hæmostatisk middel.
- Reverse anæstesi ved injektion 1 mg / kg af atipamezol hydrochlorid i saltopløsning intraperitonealt.
- Administrer 1 mg / kg af Meloxicam intraperitonealt hver 24 timer til at lindre smerter.
- Anvend øjensalve til det resterende øje for at undgå dehydrering af hornhinden.
- Lad dyret komme på en varmeplade eller pak dyret i isolerende materiale i et separat bur til at styre kroppens temperatur.
- Måle vægten af musen hver dag i mindst 2 dage. Tab af vægt kan indikere lidelser og i dette tilfælde fortsætte Meloxicam behandling, indtil dyret er fuldt tilbagebetalt.
Representative Results
Figur 1 illustrerer vellykket fjernelse af øjet ved hjælp af den beskrevne protokol og er kendetegnet ved fraværet af blødning eller en tilsyneladende fysisk skade på den orbitale væv eller øjenhulen (figur 1A, 1B). Desuden fjernes øje har en glat hornhinde, årehinden og optisk disk, indikativt for en helt intakt globus (figur 1C). Da vores protokol omfatter fastspænding af synsnerven bag øjet og mekanisk drejning, synsnerven det fjernede øje er indsnævret i bunden af nethinden (figur 1D). Udførelse af de beskrevne procedure resulterer i en ren-cut synsnerven uden nogen skader på det omgivende hjerneområde (figur 1E).
Monokulært enucleation i kombination med aktivitet kortlægning (figur 2), gør det muligt at skarpt afgrænse de funktionelle eller øje specifikke input regioner i den kontralaterale udstyr og forretnil cortex af musen 12,27 eller endog okulære dominans kolonner i højere orden pattedyr som aber 28.
I forsøg med mus, fjernelse af en (ME) eller begge øjne (BE) kombineret med målrettet visuel stimulering og påvisning af Zif268 mRNA eller c-Fos protein ekspressionsniveauer blev anvendt til at afdække regionale neuronale aktivering i den visuelle cortex 12,27 . I modsætning til visuelt stimulerede kontroller (figur 2A), viste BE mus basale aktivitet i den visuelle cortex på grund af fuldstændig mangel på visuelt input (figur 2B). Som sådan blev grænserne mellem visuel med ikke-visuelle cortex (dvs.. Somatosensoriske cortex på flere forreste sektioner og auditive cortex i flere bageste sektioner) udækket. Resultater fra ME mus med en uges overlevelse tid visualiseret øjet specifikke input regioner i den kontralaterale visuelle cortex. De to monocularly drevne regioner var hypoaktiv og placeret medial og lateral den centrale kikkerten zone (figur 2C).
Figur 1. kvalitativ evaluering af post-enucleation tilstand af øjenhulen, fjernet øjet og synsnerven. Efter fjernelse af øjet med en buet pincet (A) er ikke observeret nogen blødning eller skader i øjenhulen (B). Det fjernede øje er fuldstændig intakt som afspejlet ved et normalt udseende af hornhinden og årehinden (C, D). Synsnerven indsnævres på den optiske disk, hvor den forlader øjet (D). Undersøgelse af den ventrale del af hjernen viser et rent snit synsnerven (stjerne) og ingen synlige skader på andre strukturer (E). Skalapanelerne i C, D: 1 mm. Målestokken i E: 5 mm. A: anterior; L: venstre; P: bageste; R: højre.
Figur 2. Funktionelle øje input bestemte underafsnit i musen visuelle cortex som afsløret ved enucleation. Sorte og grå linjer, der forbinder de øjne og cortex repræsenterer passage løbet af retinale afferenter og øjet specifikke input regioner. Neural aktivitet er visualiseret på kronafsnit for kontrol (A), BE (B) og ME (C) mus ved radioaktiv in situ-hybridisering (ISH) for Zif268 (gråtoneskala) omkring Bregma niveau -3,40 mm. I kontroldyr (A), den visuelle cortex i begge halvkugler udtrykker høj aktivitet efter visuel stimulation. Når den ene eller begge øjne (e) er udryddet, et klart fald i aktiviteten signal er synligt i tilsvarende berøvet kortikale områder. Monocularly tømte (C) mus viser en zone med høj aktivity i kikkerten zone af den visuelle cortex omgivet af en nedsat signal i monokulære zoner kontralaterale til den fjernede øjet. Målestok: 2 mm. Genoptrykt med tilladelse fra Van Brussel m.fl. 12.
Discussion
For at udføre en vellykket enucleation ifølge vores metode, de mest kritiske skridt til at overveje, er: 1) ved hjælp af en pincet med en buet og savtakket spids af passende størrelse; 2) udførelse af enucleation på en glat og tør overflade; og 3) gradvis at fremskynde de cirkulære bevægelser i retning med den mindste friktion.
For en effektiv resultat er det vigtigt at bruge en passende tang kendetegnet ved en buet og savtakket spids (foretrukken spids størrelse: mus: 0,5 x 0,4 mm, rotte: 2.15 x 1,3 mm). Krumningen giver mulighed for en nem adgang til synsnerven efter øjeæblet fordrivelse og er nødvendig for korrekt hånd placering, når du udfører de cirkulære bevægelser. Glatte tip er ikke anbefales, da de mangler den nødvendige greb, når du holder den optiske nerve. Manglende holde synsnerven korrekt under de cirkulære bevægelser resulterer i bristning af den ophthalmiske arterie, dårlig frigørelse af øjet og dermed dårlig reproducerbarhed.Det anbefales derfor at første praksis denne teknik på aflivet dyr til optimering af tangen håndtering for at sikre maksimal dyrevelfærd, når anvendelse af den metode in vivo. Vellykket øje enucleation er for nylig også blevet udført på rotter i vores laboratorium under anvendelse af samme teknik, undtagen at dreje dyrekroppen manuelt og holde pincet stille.
En begrænsning af den teknik er, at det muligvis kunne beskadige nethinden. Derfor er denne metode mindre egnet til opsamling nethinder at udføre histologi 5. Desuden er vores metode er begrænset til at sende øjenåbnende aldre siden øjeæblet skal fortrænges fra stikkontakten uden at fjerne eller skære øjenlågene.
Eye enucleation i forskellige arter, herunder gnavere, udføres rutinemæssigt ved hjælp af alternative metoder, som ofte medfører fjernelse af øjenlåg og skære synsnerven 18,23-25. Disse methods tendens til at være mere invasive og har en højere indlæringskurve end den her beskrevne teknik. Uden behov for at fjerne eller suturering øjenlågene, er postoperativt inddrivelse tid minimeres, hvilket resulterer i højere dyrevelfærd og mere reproducerbare resultater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride (Anesketin) | Dechra Veterinary Products (Eurovet) | BE-V136516 | |
| Medetomidine hydrochloride (Domitor) | Orion Corporation (Janssen Animal Health) | BE-V151742 | |
| Atipamezol hydrochloride (Antisedan) | Orion Corporation (Elanco Animal Health) | BE-V153352 | |
| Antibiotics (cefazolin, Kefzol) | Eurocept Pharmaceuticals | BE 106267 | |
| Eye ointment (Fucithalmic) | Leo Pharma nv-sa | BE 144654 | |
| Moria MC31 Forceps - Serrated Curved | Fine Science Tools | 11370-31 | For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
| Narrow Pattern Forceps - curved | Fine Science Tools | 11003-13 | For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
| Hemostatic cotton wool | Qualiphar | N/A | Other hemostatic agents are equally suitable (e.g., Viscostat, #649, Ultradent Products) |
References
- Toldi, J., Fehér, O., Wolff, J. R. Neuronal plasticity induced by neonatal monocular (and binocular) enucleation. Progress in Neurobiology. 48 (3), 191-218 (1996).
- Steeves, J. K. E., González, E. G., Steinbach, M. J. Vision with one eye: a review of visual function following unilateral enucleation. Spatial vision. 21 (6), 509-529 (2008).
- Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. Evidence for cross-modal plasticity in adult mouse visual cortex following monocular enucleation. Cerebral Cortex. 21 (9), 2133-2146 (2011).
- Nys, J., Aerts, J., Ytebrouck, E., Vreysen, S., Laeremans, A., Arckens, L. The cross-modal aspect of mouse visual cortex plasticity induced by monocular enucleation is age-dependent. Journal of Comparative Neurology. 522 (4), 950-970 (2014).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e57 (2011).
- Morales, B., Choi, S. -Y., Kirkwood, A. Dark rearing alters the development of GABAergic transmission in visual cortex. Journal of Neuroscience. 22 (18), 8084-8090 (2002).
- Chen, X. J., Rasch, M. J., Chen, G., Ye, C. Q., Wu, S., Zhang, X. H. Binocular input coincidence mediates critical period plasticity in the mouse primary visual cortex. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2940-2955 (2014).
- Konur, S., Yuste, R. Developmental regulation of spine and filopodial motility in primary visual cortex: Reduced effects of activity and sensory deprivation. Journal of Neurobiology. 59 (2), 236-246 (2004).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: A comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
- Galindo-Romero, C., et al. Axotomy-induced retinal ganglion cell death in adult mice: Quantitative and topographic time course analyses. Experimental Eye Research. 92 (5), 377-387 (2011).
- Kanold, P. O., Kim, Y. A., GrandPre, T., Shatz, C. J. Co-regulation of ocular dominance plasticity and NMDA receptor subunit expression in glutamic acid decarboxylase-65 knock-out mice. The Journal of Physiology. 587 (12), 2857-2867 (2009).
- Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. Identification and localization of functional subdivisions in the visual cortex of the adult mouse. Journal of Comparative Neurology. 514 (1), 107-116 (2009).
- Avwenagha, O., Bird, M. M., Lieberman, A. R., Yan, Q., Campbell, G. Patterns of expression of brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase B mRNAs and distribution and ultrastructural localization of their proteins in the visual pathway of the adult rat. Neuroscience. 140 (3), 913-928 (2006).
- Hernandes, M. S., Britto, L. R. G., Real, C. C., Martins, D. O., Lopes, L. R. Reactive oxygen species and the structural remodeling of the visual system after ocular enucleation. Neuroscience. 170 (4), 1249-1260 (2010).
- Cuyvers, A., Paulussen, M., Smolders, K., Hu, T. -T., Arckens, L. Local cell proliferation upon enucleation in direct retinal brain targets in the visual system of the adult mouse. Journal of Experimental Neuroscience. 4, 1-15 (2010).
- Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. Experience-dependent binocular competition in the visual cortex begins at eye opening. Nature Neuroscience. 10 (3), 370-375 (2007).
- Toldi, J., Farkas, T., Völgyi, B. Neonatal enucleation induces cross-modal changes in the barrel cortex of rat. A behavioural and electrophysiological study. Neuroscience Letters. 167 (1-2), 1-4 (1994).
- Newton, J. R., Sikes, R. W., Skavenski, A. A. Cross-modal plasticity after monocular enucleation of the adult rabbit. Experimental Brain Research. 144 (4), 423-429 (2002).
- Lalonde, J., Chaudhuri, A. Dynamic changes in CREB phosphorylation and neuroadaptive gene expression in area V1 of adult monkeys after monocular enucleation. Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (1), 24-37 (2007).
- You, Y., Gupta, V. K., Graham, S. L., Klistorner, A. Anterograde degeneration along the visual pathway after optic nerve injury. PLoS ONE. 7 (12), e52061 (2012).
- Kelly, K. R., McKetton, L., Schneider, K. A., Gallie, B. L., Steeves, J. K. E. Altered anterior visual system development following early monocular enucleation. NeuroImage: Clinical. 4, 72-81 (2014).
- Chow, A. M., Zhou, I. Y., Fan, S. J., Chan, K. W. Y., Chan, K. C., Wu, E. X. Metabolic changes in visual cortex of neonatal monocular enucleated rat: a proton magnetic resonance spectroscopy study. International Journal of Developmental Neuroscience. 29 (1), 25-30 (2011).
- Dyer, R. S., Hammond, M. Effects of enucleation in retinal degenerate mice. Physiology & behavior. 14 (2), 207-210 (1975).
- Smith, S. A., Bedi, K. S. Unilateral eye enucleation in adult rats causes neuronal loss in the contralateral superior colliculus. Journal of Anatomy. 190 (4), 481-490 (1997).
- Gonzalez, D., et al. Effects of monocular enucleation on calbindin-D 28k and c-Fos expression in the lateral geniculate nucleus in rats. Okajimas folia anatomica Japonica. 82 (1), 9-18 (2005).
- Faguet, J., Maranhao, B., Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. Ipsilateral eye cortical maps are uniquely sensitive to binocular plasticity. Journal of Neurophysiology. 101 (2), 855-861 (2008).
- Van der Gucht, E., Hof, P. R., Van Brussel, L., Burnat, K., Arckens, L. Neurofilament protein and neuronal activity markers define regional architectonic parcellation in the mouse visual cortex. Cerebral Cortex. 17 (12), 2805-2819 (2007).
- Chaudhuri, A., Matsubara, J. A., Cynader, M. S. Neuronal activity in primate visual cortex assessed by immunostaining for the transcription factor Zif268. Visual Neuroscience. 12 (1), 35-50 (1995).
