Summary
Fjerning av øynene, også kalt enucleation, gir en nyttig strategi for å studere aspekter av visuell, kryss-modal og utviklings plastisitet langs pattedyr visuelle systemet siden det fremkaller irreversibel delvis (monocular) eller fullstendig (kikkerten) synstap. Her beskriver vi en svært reproduserbare og grei tilnærming til å utføre in vivo enucleation.
Abstract
Utskraping eller kirurgisk fjerning av et øye, kan generelt betraktes som en modell for nerve deafferentation. Det gir et verdifullt verktøy for å studere ulike aspekter av visuell, kryss-modal og utviklings plastisitet langs pattedyr visuelle systemet 1-4.
Her kan vi vise en elegant og enkel teknikk for fjerning av ett eller begge øyne hos mus, som er validert i mus av 20 dager gamle inntil voksne. I korthet blir en desinfiserte buet pinsett brukes til å klemme den optiske nerven bak øyet. Deretter er sirkulære bevegelser utført for å innsnevre synsnerven og fjerne øyeeplet. Fordelen med denne teknikken er høy reproduserbarhet, minimal til ingen blødning, hurtig postoperative og en meget lav terskel for læring experimenter. Derfor kan en stor mengde av dyrene bli manipulert, og bearbeidet med minimal anstrengelse. Naturen av teknikken kan indusere svak skadenetthinnen i løpet av prosedyren. Denne bivirkningen gjør denne metoden mindre egnet i forhold til Mahajan et al. (2011) 5 hvis målet er å samle inn og analysere retinal vev. Dessuten er vår metode begrenset til post-øye åpning aldre (mus: P10 - 13 og utover) siden øyeeplet må fortrenges fra stikkontakten uten å fjerne øyelokkene. In vivo enucleation teknikk beskrevet i dette manuskriptet har nylig blitt brukt med mindre endringer i rotter og synes nyttig å studere afferent visuelle vei av gnagere generelt.
Introduction
Fjerne et øye og dermed irreversibelt ødeleggende sensoriske receptor overflate (retina), pålegger et betydelig tap av sanseinntrykk langs den visuelle veien. Den enucleation modellen i juvenil og voksen visuelle systemet har vist seg å være verdifulle i å forstå utvikling, plastisitet og funksjon av ulike visuelle sentre 1-4. De molekylære, cellulære og fysiologiske konsekvensene av denne sensorisk deprivasjon kan gi innsikt i hvordan normal utvikling er regulert og hvor etablert cortical kretser håndtere og endre sin struktur og funksjon som svar på en slik omfattende endring i opplevelsen.
Ulike metoder for visuell deprivasjon finnes og de har alle sine spesifikke fordeler i visjon relatert forskning. For eksempel mørk oppdragelse spesielt eliminerer visuelt drevet aktivitet, men det påvirker ikke den spontane retinal aktivitet. Tilsvarende lokk sting eller øyelapper fjerne mønstret visual inngang uten å forstyrre spontan aktivitet, men de tillater spredt lys penetrasjon gjennom lukkede øyne. Disse metoder er reversible og har vist seg å være verdifulle i å forstå rollen til mønstrede syn-og lav-nivå korrelasjon av binokulære innganger i forme kortikale kretser under utvikling 6-8. I glaukom forskning, har den optiske nerven knuse modell hos voksne dyr blitt mye brukt fordi det etablerer et progressivt tap av netthinnens ganglion celle innganger som utgjør den optiske nerven 9,10. På den annen side, enucleation, hvor blikket og dermed netthinnen er helt og umiddelbart fjernet, er det hensiktsmessig valg av deprivasjon når målet er å irreversibelt fjerne både spontan og mønstret syn på en gang. Det induserer også en robust intraokulært aktivitet ubalanse som kan forbedre signal til støyforhold i aktivitet kartleggingsstudier 11,12. Sammenligning av funksjonelle og strukturelle endringer i respons til enucleation med those etter deprivasjon av mindre drastiske metoder som lokk sutur for eksempel, kan også utsette ny innsikt i rollen som spontan retinal aktivitet både homeostatiske og synaptiske typer plastisitet.
Enucleation utløser et tap av trofiske påvirkninger i direkte retinal mål. For eksempel er BDNF nivåer betydelig nedregulert i den laterale geniculate nucleus (LGN) og overlegen colliculus av voksne utskrapte rotter 13. Reaktive oksygenforbindelser, som fungerer som budbringermolekyler å megle strukturelle ombygging, ble også påvist i subkortikale strukturer i voksen rotte visuelle system 14. Videre microglial og astroglial aktivering tvers av ulike subkortikale visuelle målet strukturer i musen oppstå i en bestemt post-enucleation tidsramme på én uke 15.. Sammen optiske deafferentation resultater i ulike subkortikale svar på glial, strukturelle og molekylnivå. Til tross for disse subcorticaleffekter, betyr det ikke nødvendigvis implisere effekter ved kortikale nivå 16. Verdt å merke seg, kryss-modal kortikal plastisitet, inkludert modifikasjoner i andre sensoriske områder ved siden av styrking av ikke-visuelle input til fratatt visuell cortex oppstå etter både monocular (ME) 3,4,17,18 og kikkert (BE) 1,17 enucleation.
Bortsett fra å bidra til visuell nevro kan enucleation som en type deafferentation brukes til å studere forholdet mellom neurobeskyttende 19 og neurodegenerative 20-22 egenskaper av det sentrale nervesystemet.
Forskjellige fremgangsmåter til å utføre enucleation er allerede beskrevet i litteraturen. Enkelte metoder for in vivo ME hos rotter og mus er mindre grei grunn unødvendig seksjonering av orbital muskler og vev 23-25. Andre publikasjoner som Mahajan et al. (2011) 5 gir en detaljert protokoll ved hjelp stump disseksjon for en high-throughput samling av øynene for å studere genotype-fenotype korrelasjoner, trolig post-mortem. For sitt formål, er metoden enkel og rask. Imidlertid er denne fremgangsmåte lite egnet for in vivo enucleation når en velger å studere afferent visuell vei å følge enucleation (i levende dyr) i stedet for selve øyet. I en slik setting, er post-enucleation overlevelse av høy viktighet. Også minimal in vivo skader og bevaring av synsnerven og orbital vev er gunstig. Her presenterer vi en alternativ enucleation metode, mer lik den beskrevet av Faguet et al (2008) 26, som gir visse fordelaktige egenskaper:. Det er forbundet med en rask postoperative og er preget av en svært lav læringsterskel for forskere. Generelt, forskjellige metoder er komplementære, avhengig av fokus for senere forskning: eye morfologi eller visuell pathway forskning.
ve_content "> I sum kan enucleation brukes fra visjon forskningen mot undersøkelser av homeostatic og kryss-modal hjernens plastisitet, glial responsegenskaper, og axon stabilitet. I denne visualisert artikkelen, vi demonstrere en gjennomførbar og pålitelig metode for in vivo øye enucleation i musen.Protocol
Alle forsøkene ble godkjent av forskningsetisk komité av KU Leuven og var i henhold til den europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 22. september-2010 (2010/63 / EU) og med den belgiske lovgivning (KB av 29. mai 2013). Hver mulig innsats ble gjort for å minimalisere dyr lidelse, og for å redusere antallet av dyr.
1. DYR og Anesthetics
- Anesthetize mus med en intraperitoneal injeksjon av en blanding av ketamin-hydroklorid (75 mg / ml) og medetomidin hydroklorid (1 mg / kg) i saltløsning.
- Sjekk reflekser ved å knipe tærne med en tang for å sikre musen er helt bedøvet.
- Påfør 70% etanol for å desinfisere øyelokkene og regionen rundt øyet med en bomullspinne. Sjekk øyelokket refleks å vurdere i tillegg graden av sedasjon.
2. Fjerne Eye
- Sørg for at dyret ligger på et flatt, tørt ogglatt overflate.
- Sterilisere en tang med en buet, taggete spissen (foretrukket spiss størrelse: 0,5 x 0,4 mm).
- Trykk forsiktig på canthus (hjørnet av øyet) med pinsett til øyeeplet er fordrevet fra stikkontakten og synsnerven kan nås.
- Veilede tang bak øyet. Trykk og hold den optiske nerven godt, helst med begynnelsen av kurven og ikke helt i spissen av pinsett. Dette vil bidra til å løfte verden ut av stikkontakten og å klemme komplett synsnerven.
- Lag sirkulære bevegelser med hånden som holder tangen i retning med minst motstand, mens mus forblir på den flate overflate. Musen vil svinge langs overflaten i henhold til retningen av håndbevegelsen.
- Utføre denne handlingen med gradvis økende hastighet til synsnerven blir innsnevret i to (vanligvis mellom 7 til 15 sirkulære bevegelser, omtrent en halv til en hel omdreining per sekund). Derfor er det frittliggende øyeepletfjernet.
3. postoperativ omsorg
- Ved blødninger (sjelden), fyll bane med en tyktflytende koagulerer og hemostatisk agent.
- Reversere anestesi ved å injisere 1 mg / kg av atipamezol hydroklorid i saltvann intraperitonealt.
- Administrer 1 mg / kg av Meloxicam intraperitonealt hver 24. time for å lindre smerte.
- Påfør øyensalve til den gjenværende øye for å hindre dehydrering av hornhinnen.
- La dyret komme på en varmeplate eller vikle dyret i isolerende materiale i et eget bur for å kontrollere kroppstemperatur.
- Mål vekten av mus hver dag i minst 2 dager. Tap av vekt kan indikere lidelse og i dette tilfellet, fortsetter Meloxicam behandling før dyret er fullstendig restituert.
Representative Results
Figur 1 illustrerer en vellykket fjerning av øyet ved hjelp av den beskrevne protokoll og er karakterisert ved fravær av blødning eller noen tilsynelatende fysisk skade på vev eller orbital øyehulen (figurene 1A, 1B). Videre har fjernet øyet en glatt hornhinnen, årehinnen og optisk disk, indikativ for en fullstendig intakt globus (figur 1C). Siden våre protokoll omfatter klemming av synsnerven bak øyet og mekanisk dreining, er den optiske nerven av den fjernede øyet innsnevret i bunnen av netthinnen (figur 1D). Utføre de beskrevne prosedyren gir en clean-cut synsnerven uten skade på omliggende hjerneområde (figur 1E).
Monokulært enucleation, i kombinasjon med aktivitet kartlegging (figur 2), kan en for å skarpt avgrense de funksjonelle eller øye spesifikke inngangs regioner i det kontralaterale visual cortex av musen 12,27 eller okulær dominans kolonner i høyere orden pattedyr som aper 28.
I forsøk med mus, fjerning av en (ME) eller begge øyne (BE) kombinert med målrettet visuell stimulering, og påvisning av zif268 mRNA eller c-Fos protein uttrykk nivåer ble anvendt til å avdekke regional neuronal aktivering i den visuelle cortex 12,27 . I motsetning til visuelt stimulerte kontroller (figur 2A), BE mus viste basal aktivitet i den visuelle cortex skyldes fullstendig mangel på visuell inngang (figur 2B). Som sådan, ble grensene mellom visuell med ikke-visuelle cortex (ie. Somatosensoriske cortex på flere fremre seksjoner og auditiv cortex i flere posteriore seksjoner) avdekket. Resultater fra ME mus med en ukes overlevelsestiden visualisert øyet konkrete innspill regioner i kontralateral visuelle cortex. De to monocularly drevet regioner var hemmet og ligger medial og sideveis av det sentrale binokulær sone (figur 2C).
Figur 1. kvalitativ vurdering av den etter enucleation tilstand av øyehulen, den fjernede øye og synsnerven. Etter fjerning av øyet med en buet pinsett (A) ingen blødning eller skade er observert i øyehulen (B). Den fjernede øyet er helt intakt som reflekteres av en normalt utseende av hornhinnen og årehinnen (C, D). Den optiske nerven er innsnevret ved optisk plate hvor den forlater øyet (D). Undersøkelse av den ventrale delen av hjernen avslører et rent kutt synsnerven (asterisk) og ingen åpenbar skade på andre strukturer (E). Scale barer i C, D: 1 mm. Scale bar i E: 5 mm. A: anterior; L: left; P: posterior; R: høyre.
Figur 2. Funksjonelle øye-inngang spesifikke underavdelinger i musen visuelle cortex som avslørt av enucleation. Svart og grå linjer som kobler øynene og cortex representerer krysset over av netthinnens afferenter og øyet konkrete innspill regioner. Nevrale aktiviteten er visualisert på koronale deler av kontroll (A), BE (B), og ME (C) mus ved radioaktiv in situ hybridisering (ISH) for zif268 (gråskala) rundt Bregma nivå -3,40 mm. I kontrolldyrene (A), den visuelle cortex i begge halvkuler uttrykker høy aktivitet etter visuell stimulering. Når ett eller begge øyne (e) er utryddet, er en klar reduksjon i aktiviteten signalet synlig i tilsvarende belastede kortikale regioner. Monocularly enucleated (C) mus viser en sone med høy aktihet på binokulær sone av den visuelle cortex omgitt av et redusert signal i monokulære soner kontralaterale til den fjernede øyet. Målestokk: 2 mm. Gjengitt med tillatelse fra Van Brussel et al 12.
Discussion
For å utføre en vellykket enucleation ifølge vår metode, de mest kritiske skritt for å vurdere er: 1) ved hjelp av en pinsett med buet og taggete spissen av passende størrelse; 2) som utfører enucleation på en glatt og tørr overflate; og 3) gradvis påskynde de sirkulære bevegelser i retning med den minste friksjon.
For en effektiv utfall er det viktig å bruke en passende tang preget av en buet og taggete tips (foretrukket spiss størrelse: mus: 0,5 x 0,4 mm, rotte: 2.15 x 1.3 mm). Krumningen gir en enkel tilgang til synsnerven etter øyeeplet fortrengning og er nødvendig for riktig håndplassering når du utfører de sirkulære bevegelser. Glatte tips anbefales ikke, fordi de mangler den nødvendige grep når du holder den optiske nerven. Unnlatelse av å holde den optiske nerven riktig under de sirkulære bevegelser resulterer i brudd av den oftalmiske arterie, dårlig løsgjøring av øyet og følgelig dårlig reproduserbarhet.Derfor anbefales det å første trening denne teknikken på avlives dyr for optimalisering av pinsett håndtering for å sikre maksimal dyrevelferd når bruk av metoden in vivo. Vellykket øye enucleation har nylig også blitt utført i rotte i vårt laboratorium ved bruk av den samme teknikk med unntak for dreining av dyrekroppen manuelt og holde den stasjonære tang.
En begrensning av teknikken er at det muligens kunne skade netthinnen. Derfor er denne fremgangsmåte er mindre egnet for oppsamling av netthinnene til å utføre 5 histologi. Dessuten er vår metode begrenset til å legge øynene åpne aldre siden øyeeplet må fortrenges fra stikkontakten uten å fjerne eller kutte øyelokkene.
Øyen enucleation i forskjellige arter, inkludert gnagere blir rutinemessig utført ved å bruke alternative metoder, som ofte innebære fjerning av øyelokkene og kutte den optiske nerven 18,23-25. Disse methods har en tendens til å være mer invasive og har en høyere lærekurve enn den teknikk som er beskrevet her. Uten behov for å fjerne eller sy øyelokkene, er innlegget kirurgi utvinning tid minimeres, noe som resulterer i høyere dyrevelferd og mer reproduserbare resultater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride (Anesketin) | Dechra Veterinary Products (Eurovet) | BE-V136516 | |
| Medetomidine hydrochloride (Domitor) | Orion Corporation (Janssen Animal Health) | BE-V151742 | |
| Atipamezol hydrochloride (Antisedan) | Orion Corporation (Elanco Animal Health) | BE-V153352 | |
| Antibiotics (cefazolin, Kefzol) | Eurocept Pharmaceuticals | BE 106267 | |
| Eye ointment (Fucithalmic) | Leo Pharma nv-sa | BE 144654 | |
| Moria MC31 Forceps - Serrated Curved | Fine Science Tools | 11370-31 | For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
| Narrow Pattern Forceps - curved | Fine Science Tools | 11003-13 | For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
| Hemostatic cotton wool | Qualiphar | N/A | Other hemostatic agents are equally suitable (e.g., Viscostat, #649, Ultradent Products) |
References
- Toldi, J., Fehér, O., Wolff, J. R. Neuronal plasticity induced by neonatal monocular (and binocular) enucleation. Progress in Neurobiology. 48 (3), 191-218 (1996).
- Steeves, J. K. E., González, E. G., Steinbach, M. J. Vision with one eye: a review of visual function following unilateral enucleation. Spatial vision. 21 (6), 509-529 (2008).
- Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. Evidence for cross-modal plasticity in adult mouse visual cortex following monocular enucleation. Cerebral Cortex. 21 (9), 2133-2146 (2011).
- Nys, J., Aerts, J., Ytebrouck, E., Vreysen, S., Laeremans, A., Arckens, L. The cross-modal aspect of mouse visual cortex plasticity induced by monocular enucleation is age-dependent. Journal of Comparative Neurology. 522 (4), 950-970 (2014).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e57 (2011).
- Morales, B., Choi, S. -Y., Kirkwood, A. Dark rearing alters the development of GABAergic transmission in visual cortex. Journal of Neuroscience. 22 (18), 8084-8090 (2002).
- Chen, X. J., Rasch, M. J., Chen, G., Ye, C. Q., Wu, S., Zhang, X. H. Binocular input coincidence mediates critical period plasticity in the mouse primary visual cortex. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2940-2955 (2014).
- Konur, S., Yuste, R. Developmental regulation of spine and filopodial motility in primary visual cortex: Reduced effects of activity and sensory deprivation. Journal of Neurobiology. 59 (2), 236-246 (2004).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: A comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
- Galindo-Romero, C., et al. Axotomy-induced retinal ganglion cell death in adult mice: Quantitative and topographic time course analyses. Experimental Eye Research. 92 (5), 377-387 (2011).
- Kanold, P. O., Kim, Y. A., GrandPre, T., Shatz, C. J. Co-regulation of ocular dominance plasticity and NMDA receptor subunit expression in glutamic acid decarboxylase-65 knock-out mice. The Journal of Physiology. 587 (12), 2857-2867 (2009).
- Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. Identification and localization of functional subdivisions in the visual cortex of the adult mouse. Journal of Comparative Neurology. 514 (1), 107-116 (2009).
- Avwenagha, O., Bird, M. M., Lieberman, A. R., Yan, Q., Campbell, G. Patterns of expression of brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase B mRNAs and distribution and ultrastructural localization of their proteins in the visual pathway of the adult rat. Neuroscience. 140 (3), 913-928 (2006).
- Hernandes, M. S., Britto, L. R. G., Real, C. C., Martins, D. O., Lopes, L. R. Reactive oxygen species and the structural remodeling of the visual system after ocular enucleation. Neuroscience. 170 (4), 1249-1260 (2010).
- Cuyvers, A., Paulussen, M., Smolders, K., Hu, T. -T., Arckens, L. Local cell proliferation upon enucleation in direct retinal brain targets in the visual system of the adult mouse. Journal of Experimental Neuroscience. 4, 1-15 (2010).
- Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. Experience-dependent binocular competition in the visual cortex begins at eye opening. Nature Neuroscience. 10 (3), 370-375 (2007).
- Toldi, J., Farkas, T., Völgyi, B. Neonatal enucleation induces cross-modal changes in the barrel cortex of rat. A behavioural and electrophysiological study. Neuroscience Letters. 167 (1-2), 1-4 (1994).
- Newton, J. R., Sikes, R. W., Skavenski, A. A. Cross-modal plasticity after monocular enucleation of the adult rabbit. Experimental Brain Research. 144 (4), 423-429 (2002).
- Lalonde, J., Chaudhuri, A. Dynamic changes in CREB phosphorylation and neuroadaptive gene expression in area V1 of adult monkeys after monocular enucleation. Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (1), 24-37 (2007).
- You, Y., Gupta, V. K., Graham, S. L., Klistorner, A. Anterograde degeneration along the visual pathway after optic nerve injury. PLoS ONE. 7 (12), e52061 (2012).
- Kelly, K. R., McKetton, L., Schneider, K. A., Gallie, B. L., Steeves, J. K. E. Altered anterior visual system development following early monocular enucleation. NeuroImage: Clinical. 4, 72-81 (2014).
- Chow, A. M., Zhou, I. Y., Fan, S. J., Chan, K. W. Y., Chan, K. C., Wu, E. X. Metabolic changes in visual cortex of neonatal monocular enucleated rat: a proton magnetic resonance spectroscopy study. International Journal of Developmental Neuroscience. 29 (1), 25-30 (2011).
- Dyer, R. S., Hammond, M. Effects of enucleation in retinal degenerate mice. Physiology & behavior. 14 (2), 207-210 (1975).
- Smith, S. A., Bedi, K. S. Unilateral eye enucleation in adult rats causes neuronal loss in the contralateral superior colliculus. Journal of Anatomy. 190 (4), 481-490 (1997).
- Gonzalez, D., et al. Effects of monocular enucleation on calbindin-D 28k and c-Fos expression in the lateral geniculate nucleus in rats. Okajimas folia anatomica Japonica. 82 (1), 9-18 (2005).
- Faguet, J., Maranhao, B., Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. Ipsilateral eye cortical maps are uniquely sensitive to binocular plasticity. Journal of Neurophysiology. 101 (2), 855-861 (2008).
- Van der Gucht, E., Hof, P. R., Van Brussel, L., Burnat, K., Arckens, L. Neurofilament protein and neuronal activity markers define regional architectonic parcellation in the mouse visual cortex. Cerebral Cortex. 17 (12), 2805-2819 (2007).
- Chaudhuri, A., Matsubara, J. A., Cynader, M. S. Neuronal activity in primate visual cortex assessed by immunostaining for the transcription factor Zif268. Visual Neuroscience. 12 (1), 35-50 (1995).
