Summary
또한 안구 적출술라는 눈의 제거는, 그것은 돌이킬 수없는 부분 (단안) 또는 전체 (쌍안) 시력 손실을 유발하기 때문에 포유류의 시각 시스템에 따라 시각, 크로스 모달, 발달 가소성의 측면을 연구하기위한 유용한 전략을 제공합니다. 여기에서 우리는 생체 안구 적출술에서 수행 할 수있는 높은 재현성 및 간단한 방법을 설명합니다.
Abstract
적출술 또는 눈의 수술 제거는 일반적으로 신경 deafferentation 모델로 간주 될 수있다. 그것은 포유류의 시각 시스템 1-4를 따라 시각적, 크로스 모달 발달 가소성의 다양한 측면을 연구하는 유용한 도구를 제공합니다.
여기서 우리는 성인 20 일 이전의 마우스에서 확인 된 마우스에서 하나의 제거 또는 양쪽 눈을위한 우아하고 간단한 기술을 보여줍니다. 간단히, 소독 곡선 포셉은 눈 뒤에있는 시신경을 고정하는 데 사용됩니다. 그 후, 원형 운동은 시신경을 수축하고 안구를 제거하기 위해 수행된다. 이 기술의 장점은 어떤 출혈을 최소화 재현성, 빠른 수술 후 회복과 실험에 대한 매우 낮은 학습 임계 값입니다. 따라서, 동물의 다량 조작과 노력을 최소한으로 처리 될 수있다. 기술의 성격에 약간의 손상을 야기 할 수 있음절차를 수행하는 동안 망막. 마하 잔 등이에 비해 부작용이있어서 덜 적합하다. (2011) 5 골 수집하고 망막 조직을 분석하는 경우. 안구가 눈꺼풀을 제거하지 않고 소켓에서 변위 될 필요가 있기 때문에 - : 또한, 우리의 방법은 후 눈을 열어 세 (13 년 이후 P10 마우스)로 제한됩니다. 이 논문에 기술 된 생체 안구 적출 기술은 최근에 성공적으로 쥐에 약간의 수정을 적용 일반적으로 설치류의 심성 시각 경로를 연구하기 위해 유용 표시되었습니다.
Introduction
눈을 제거함으로써 비가 역적 감각 수용체 표면 (망막)을 파괴한다, 시각적 통로를 따라 감각 입력의 상당한 손실을 부과한다. 청소년 및 성인의 시각 시스템에 적출술 모델은 다른 비주얼 센터 1-4의 개발, 가소성 및 기능을 이해하는데 유용한 것으로 입증되었다. 이 감각 박탈, 분자 세포 및 생리 학적 결과는 대뇌 피질 회로 대처 경험 등 광범위한 변화에 대한 응답으로 자신의 구조와 기능을 변경하는 방법을 정상적인 발달 규제 방법과 설립에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
시각 박탈의 다른 방법이 존재하고 그들 모두는 비전 관련 연구의 특정 장점이있다. 예를 들어 어두운 양육 특별히 시각적으로 활동을 구동 없애 아직 그것은 자연 망막 활동에 영향을주지 않습니다. 마찬가지로, 뚜껑 봉합 또는 눈 패치 패턴 삭제 visua리터 입력 자발적인 활동을 방해하지 않고 있지만 닫힌 눈을 통해 분산 된 빛이 침투 할 수 있습니다. 이러한 방법은 가역적이며 개발 중에 6-8 피질 회로 조각에서 양안 시력의 입력 패턴 및 낮은 수준의 상관 관계의 역할을 이해하는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 이 시신경 9,10 구성 망막 신경절 세포의 진보적 입력 손실을 설정하기 때문에 녹내장 연구에서는 성인 동물에서 시신경 크러쉬 모델은 광범위하게 사용되어왔다. 목표는 비가 역적으로 한번에 자발 패터닝 모두 비전을 제거 할 때 눈의 망막은 이와 완전히 즉시 제거 한편, 적출에, 박탈의 적절한 선택이다. 또한 활동 맵핑 연구 11,12에서 신호 대 잡음비를 향상시킬 수있는 강력한 안압 활동 불균형을 유도한다. 번째로 적출에 응답 기능적, 구조적 변화를 비교OSE 예컨대 뚜껑 봉합사 덜 과감한 방법으로 박탈 한 후, 또한 소성 모두 항상성 및 시냅스 종류 망막 자발 활동의 역할에 새로운 통찰력을 노출시킬.
탈핵 직접 망막 대상에서 영양 영향의 손실을 트리거합니다. 예를 들어, BDNF 수준이 크게 좌우 geniculate 핵 (LGN) 및 성인 적출 래트 (13)의 우수한 둔덕에 하향 조절된다. 구조적 리모델링을 중재하는 메신저 분자로서 기능 활성 산소 종은 또한 성인 쥐의 시각 시스템 (14)의 피질 하 구조에서 검출된다. 더욱이, 마우스의 시각 피질 상이한 타겟 구조 및 소교 걸쳐 astroglial 활성화 일주 (15)의 특정 후 적출 시간 프레임에서 발생한다. 함께, 아교, 구조 및 분자 수준에서 서로 다른 피질 반응에서 광학 deafferentation 결과. 이러한 피질에도 불구하고효과, 그것은 반드시 대뇌 피질의 레벨 16에서 효과를 연루되지 않습니다. 다음 박탈 시각 피질에 시각이 아닌 입력의 강화에 다른 감각 영역에서 수정을 포함하여 주목할만한 크로스 모달 피질 가소성이 두 단안 이후에 발생 (ME)는 3,4,17,18 및 양안 1,17 (BE) 안구 적출술.
선정한 시각 신경에 기여에서, deafferentation의 유형으로 적출술은 중추 신경계의 퇴행성 신경 19 20-22 특성 간의 균형을 연구하는데 사용될 수있다.
안구 적출술을 수행 할 수있는 다른 절차는 이미 문헌에 설명되어 있습니다. 쥐와 생쥐의 생체 ME에 대한 특정 방법으로 인해 궤도 근육과 조직 23-25 불필요한 절편 덜 간단합니다. 이러한 마하 잔 등과 같은 다른 서적. (2011) 5 사용하여 상세한 프로토콜을 제공 유전자형 - 표현형의 상관 관계 가능성이 사후를 연구하는 눈의 높은 처리량 수집을 위해 무딘 절개. 자신의 목적을 위해,이 방법은 편리하고 빠르다. 하나가 아니라 눈 자체보다 (살아있는 동물에서) 핵의 제거 다음 심성 시각 경로를 연구하기 위해 옵트 그러나,이 방법은 생체 안구 적출술 덜 적합하다. 이러한 설정에서, 후 안구 적출 생존율은 높은 중요하다. 또한, 생체 손상 및 시신경의 보존 및 안와 조직에서 최소한이 바람직하다. 여기서는 Faguet 등에 의해 설명 된 것과 더 유사한 대안 적출술 방법을 제시한다 (2008) 26, 즉 특정한 유리한 특성을 제공한다 :.가 빠른 수술 후의 회복과 연관되어 매우 낮은 학습 임계 특징 연구원. 눈의 형태 나 시각 통로 연구 : 일반적으로, 다른 방법은 후속 연구의 초점에 따라 상호 보완 적이다.
요컨대 ve_content은 ">, 안구 적출술은 항상성 및 크로스 모달 뇌 가소성, 아교 응답 특성 및 축삭 안정성 조사 향해 비전 연구에서 적용 할 수 있습니다.이 가시화 문서에서는, 우리는 생체 내 눈 안구 적출술을위한 실현 가능한 신뢰할 수 방법을 보여 마우스.Protocol
모든 실험은 KU 루뱅의 윤리적 연구위원회의 승인과 유럽 공동체위원회 지침을 엄격히 준수했다되었다 2010년 9월 22일 (63분의 2,010 / EU)과 벨기에 법령 (KB (29)의 2013 년 5 월). 가능한 모든 노력은 동물의 고통을 최소화하고 동물의 수를 줄이기 위해 제출되었다.
1 동물 치료 및 마취제
- 케타민 하이드로 클로라이드 (75 ㎎ / ㎖) 및 식염수 medetomidine 염산염 (1 ㎎ / ㎏)의 혼합물을 복강 내 주사하여 마우스를 마취.
- 마우스가 완전히 진정되고 보장하기 위해 집게 발가락을 곤란하게하여 반사를 확인합니다.
- 눈꺼풀 및면 팁을 사용하여 눈 주변 지역을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 적용합니다. 또한 진정 작용의 정도를 평가하기 위해 눈꺼풀의 반사를 확인합니다.
2 눈을 제거
- 확인 동물이있는에, 평면 건조하고매끄러운 표면.
- 곡선, 톱니 모양의 팁 (: 0.5 × 0.4 mm 선호 팁 크기)과 집게를 소독.
- 조심스럽게 안구가 소켓에서 변위 및 시신경에 도달 할 때까지 집게로 눈구석 (눈의 코너)에 키를 누릅니다.
- 눈 뒤에 집게를 안내합니다. 눌러 바람직 곡선의 시작과 집게 아닌 매우 끝이 단단히 시신경을 누르고 있습니다. 이 소켓에서 지구를 해제 하 고 전체 시신경을 고정하는 데 도움이 될 것입니다.
- 마우스가 평평한 표면에 남아있는 동안 손이 최소한의 저항 방향으로 집게를 들고 원형의 움직임을 확인합니다. 마우스는 손 운동의 방향에 따라 표면을 따라 요동한다.
- 시신경이 두 수축 될 때까지 점차적으로 증가 속도로이 작업을 수행합니다 (일반적으로 7-15 원형 운동 사이의 약 0.5 초마다 하나의 전체 회전에). 따라서, 안구는 떨어져제거.
3 수술 후 케어
- (드문) 출혈시, 점착성 응고 지혈제와 궤도를 채운다.
- 복강 식염수에 atipamezol 염산염 1 ㎎ / ㎏을 주입하여 마취를 반전합니다.
- 통증을 완화하기 위해 복강 매 24 시간 멜 록시 캄의 1 ㎎ / ㎏을 관리 할 수 있습니다.
- 각막의 탈수를 방지하기 위해 나머지 눈에 눈 연고를 적용합니다.
- 동물이 가열판에 복구 또는 체온을 제어하는 별도의 장에 절연 재료에 동물을 래핑하자.
- 적어도 2 일간 매일 마우스의 무게를 측정한다. 무게의 손실은 고통을 표시하고 동물이 완전히 회복 될 때까지이 경우, 멜 록시 캄의 치료를 계속할 수 있습니다.
Representative Results
도 1은 설명 된 프로토콜을 이용하여 눈의 성공적인 제거를 도시하고 출혈의 부재 또는 안와 조직 또는 눈구멍 (도 1A, 1B)에 대한 물리적 손상이 명백한 특징으로한다. 또한, 제거 눈은 완전히 그대로 세계 (그림 1C)에 대한 나타내는 부드러운 각막, 맥락막 및 광학 디스크를 가지고 있습니다. 우리 프로토콜 눈 및 기계적 회동 뒤에 시신경의 클램핑을 포함하기 때문에, 제거 된 눈의 시신경은 망막 (도 1D)의베이스에 잘록한이다. 주변 뇌 영역 (그림 1E)에 손상없이 깨끗한 컷 시신경의 설명 프로 시저를 수행하면.
단안 안구 적출술은 활동 매핑 (그림 2)와 함께, 하나가 급격히 반대쪽 visua의 기능 또는 눈 특정 입력 영역을 묘사 할 수 있습니다원숭이 (28)와 같은 고차 포유 동물에서 마우스 12,27 또는 눈 우성 열 리터 피질.
쥐 실험, 하나의 제거 (ME) 또는 양안 타겟팅 시각적 자극 zif268의 mRNA 또는 C-에 Fos 단백 발현 량의 검출과 조합 (BE하는) 시각 피질 12,27 지역적 신경 활성화를 밝히기 위해서인가 . 시각 자극 제어 (도 2a)과는 대조적으로, BE 마우스 입력 시각 (도 2b)의 부족을 완료 할 예정 시각 피질 기저 활성을 보였다. 이와 같이, 비 시각 피질 (예. 더 전방 부보다 후방 부분에서 청각 피질에서 체성 감각 피질)과 시각 사이의 경계가 발견되었다. 일주일 생존 시간과 ME 생쥐의 결과는 반대측 시각 피질에 눈 소정의 입력 영역을 가시화. 이 monocularly 구동 영역은 감퇴했고, 메디칼에 위치Al 및 중앙 영역 쌍 (도 2c)의 횡.
눈구멍, 제거 눈 및 시신경의 사후 적출술 상태의도 1 정성 평가. 곡선 포셉 (A)에는 출혈이나 손상 눈구멍 (B)에서 관찰되지와 눈의 제거 후. 각막과 맥락막 (C, D)의 정상적인 외관에 의해 반영된 바와 같이 눈이 완전히 제거 된 그대로이다. 시신경은 (는) 눈 (D)를 잎 시신경 유두에 수축된다. 뇌의 복부 부분의 시험은 깨끗한 컷 시신경 (별표)와 다른 구조 (E)에 뚜렷한 손상을 알 수있다. C, D의 스케일 바 : 1mm. E의 스케일 바 : 5mm. A : 전방; L : 왼쪽; P : 후방; R : 오른쪽.
그림 안구 적출술에 의해 계시 된 마우스 시각 피질에서 2 기능 눈길을 입력 특정 세분. 눈과 대뇌 피질을 연결하는 검은 색과 회색 선은 망막 신경 섬유와 눈 특정 입력 영역을 통해 교차를 나타낸다. 신경 활동이 제어 (A)의 관상 부분에 가시화, (B), 그리고 zif268 (그레이 스케일)에 대한 현장 하이브리드 (ISH)에서 방사성하여 ME (C) 쥐 브레 그마 수준 주위 -3.40 mm. 대조군 (A), 두 반구의 시각 피질은 시각적 자극 다음 높은 활성을 표현한다. 한쪽 또는 양쪽 눈 (들) extirpated되면 활성 신호에 명확한 감소가 박탈 피질 영역에 대응하는 볼. Monocularly은 (C) 생쥐는 높은 맛보게의 영역을 보여 적출제거 된 눈에 반대편 단안 영역의 감소 신호에 의해 둘러싸인 시각 피질의 양안 영역에서 vity. 스케일 바 : 2mm. 반 브뤼셀 등 12의 허가 재판.
Discussion
우리의 방법에 따라 성공적으로 적출술을 수행하기 위해 고려해야 할 가장 중요한 단계는 다음과 같다 : 1) 적절한 크기의 만곡 및 톱니 끝과 집게를 사용; 2) 건조 매끄러운 표면 적출술을 수행하는 단계; 3) 서서히 적어도 마찰 방향의 원형 움직임을 가속화.
효과적인 결과를 들어이 곡선 및 톱니 모양의 팁을 특징으로 적절한 집게를 사용하는 것이 필수적입니다 (: 마우스 : 선호 팁 크기 0.5 × 0.4 mm를, 쥐 : 2.15 X 1.3 mm). 곡률이 안구 변위 후의 시신경에 쉽게 액세스 할 수 있고 회전 동작을 수행 할 때 올바른 손 배치 할 필요가있다. 시신경을 들고 때 필요한 그립이 부족하기 때문에 부드러운 팁은 권장되지 않습니다. 원형의 움직임 동안 올바르게 시신경을 보유하지 않으면 안과 동맥, 눈의 가난한 분리 따라서 가난한 재현성 파열 발생합니다.따라서이 생체 내에서 방법을 적용하면 최대 동물 복지를 보장하기 위해 처리 포셉의 최적화를 위해 안락사 동물에 첫 번째 연습에이 방법을 권장합니다. 성공적인 눈 적출술 최근 수동 동물 신체를 선회하고 겸자를 고정 유지하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 사용하여 실험실에서 우리 래트에서 수행되었다.
기술의 한 가지 제한은 가능성이 망막에 손상을 줄 수 있다는 것입니다. 따라서이 방법은 5 조직학을 수행하는 망막 수집 덜 적합하다. 또한, 우리의 방법은 안구를 제거하거나 눈꺼풀을 절단하지 않고 소켓에서 변위 될 필요가 있기 때문에 눈을 열어 세를 게시 제한됩니다.
설치류 등 다양한 종의 눈 안구 적출술은 일상적으로 자주 눈꺼풀의 제거를 수반하는 다른 방법을 사용하여 시신경 18,23-25 절단이 수행됩니다. 이러한 방식 운전 방식DS보다 침습적 경향 여기 기재된 기술보다 더 높은 학습 곡선이있다. 제거 또는 눈꺼풀을 봉합 할 필요없이 수술 후 회복 시간이 높은 동물 보호 및 재현성 귀결 최소화된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride (Anesketin) | Dechra Veterinary Products (Eurovet) | BE-V136516 | |
| Medetomidine hydrochloride (Domitor) | Orion Corporation (Janssen Animal Health) | BE-V151742 | |
| Atipamezol hydrochloride (Antisedan) | Orion Corporation (Elanco Animal Health) | BE-V153352 | |
| Antibiotics (cefazolin, Kefzol) | Eurocept Pharmaceuticals | BE 106267 | |
| Eye ointment (Fucithalmic) | Leo Pharma nv-sa | BE 144654 | |
| Moria MC31 Forceps - Serrated Curved | Fine Science Tools | 11370-31 | For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
| Narrow Pattern Forceps - curved | Fine Science Tools | 11003-13 | For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
| Hemostatic cotton wool | Qualiphar | N/A | Other hemostatic agents are equally suitable (e.g., Viscostat, #649, Ultradent Products) |
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