Summary
यह भी स्पष्टीकरण बुलाया आंखों को हटाने, यह अपरिवर्तनीय आंशिक (आँख) या पूर्ण (दूरबीन) दृष्टि हानि लाती बाद स्तनधारी दृश्य प्रणाली साथ दृश्य, पार मोडल, और विकास plasticity के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी रणनीति प्रदान करता है. यहाँ हम विवो स्पष्टीकरण में प्रदर्शन करने के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और ईमानदार दृष्टिकोण का वर्णन.
Abstract
स्पष्टीकरण या एक आंख की शल्य हटाने आम तौर पर तंत्रिका deafferentation के लिए एक मॉडल के रूप में माना जा सकता है. यह स्तनधारी दृश्य प्रणाली 1-4 साथ दृश्य, पार मोडल और विकास plasticity के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है.
यहाँ, हम वयस्कों के लिए 20 दिन पुराने के चूहों में मान्य है जो माउस में एक को हटाने या दोनों आंखों के लिए एक सुंदर और सरल तकनीक का प्रदर्शन. संक्षेप में, एक कीटाणुरहित घुमावदार संदंश आंख के पीछे ऑप्टिक तंत्रिका शिकंजा कसने के लिए प्रयोग किया जाता है. बाद में, परिपत्र आंदोलनों ऑप्टिक तंत्रिका कसना और नेत्रगोलक को हटाने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. इस तकनीक का लाभ नहीं रक्तस्राव को कम से कम उच्च reproducibility, तेजी से पोस्ट ऑपरेटिव वसूली और प्रयोगकर्ता के लिए एक बहुत कम सीखने की दहलीज हैं. इसलिए, जानवरों की एक बड़ी राशि चालाकी और प्रयास की न्यूनतम राशि के साथ कार्रवाई की जा सकती है. तकनीक की प्रकृति को मामूली क्षति उत्पन्न हो सकता हैप्रक्रिया के दौरान रेटिना. महाजन एट अल की तुलना में इस पक्ष प्रभाव इस विधि कम उपयुक्त बनाता है. (2011) 5 लक्ष्य को इकट्ठा करने और रेटिना ऊतक का विश्लेषण करने के लिए है. नेत्रगोलक पलकों को हटाने के बिना सॉकेट से विस्थापित किए जाने की आवश्यकता के बाद से -: इसके अलावा, हमारे विधि के बाद आंख खोलने उम्र (13 के बाद P10 माउस) तक सीमित है. इस पांडुलिपि में वर्णित में विवो स्पष्टीकरण तकनीक हाल ही में सफलतापूर्वक चूहों में मामूली संशोधनों के साथ लागू किया है और सामान्य रूप में कृन्तकों के अभिवाही दृश्य मार्ग का अध्ययन करने के लिए उपयोगी प्रतीत होता है किया गया है.
Introduction
एक आँख निकाल रहा है और इस तरह अचल संवेदी रिसेप्टर सतह (रेटिना) destructing, दृश्य मार्ग के साथ संवेदी इनपुट की काफी हानि लगाता है. किशोर और वयस्क दृश्य प्रणाली में स्पष्टीकरण मॉडल अलग दृश्य केन्द्रों 1-4 के विकास, plasticity और समारोह को समझने में मूल्यवान साबित हो गया है. इस संवेदी अभाव की, आणविक सेलुलर और शारीरिक परिणाम कॉर्टिकल सर्किट निपटने और अनुभव में इस तरह के एक व्यापक परिवर्तन के जवाब में उनकी संरचना और समारोह बदल कैसे सामान्य विकास नियंत्रित किया जाता है और कैसे स्थापित में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
दृश्य अभाव के विभिन्न तरीकों मौजूद हैं और वे सभी दृष्टि से संबंधित अनुसंधान के क्षेत्र में उनके विशिष्ट लाभ है. उदाहरण के अंधेरे पालन विशेष रूप से नेत्रहीन गतिविधि संचालित समाप्त लिए अभी तक यह सहज रेटिना गतिविधि को प्रभावित नहीं करता. इसी तरह, ढक्कन टांके या आँख पैच नमूनों हटाने visuaएल इनपुट सहज गतिविधि परेशान बिना लेकिन वे बंद आँखों के माध्यम से छितरी प्रकाश प्रवेश की अनुमति है. उन तरीकों प्रतिवर्ती हैं और विकास 6-8 के दौरान कॉर्टिकल सर्किट sculpting में दूरबीन आदानों के नमूनों दृष्टि और निम्न स्तर के सहसंबंध की भूमिका को समझने में बहुमूल्य होना दिखाया गया है. यह ऑप्टिक तंत्रिका 9,10 गठन कि रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल आदानों की एक प्रगतिशील नुकसान स्थापित करता है क्योंकि मोतियाबिंद अनुसंधान में, वयस्क जानवरों में ऑप्टिक तंत्रिका क्रश मॉडल व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है. उद्देश्य अचल बार में सहज और नमूनों दोनों दृष्टि को हटाना है, जब आँख और इस तरह रेटिना पूरी तरह से और तुरंत निकाल दिया जाता है, जहां दूसरी ओर, स्पष्टीकरण, पर, अभाव के उपयुक्त विकल्प है. यह भी गतिविधि मानचित्रण पढ़ाई 11,12 में शोर अनुपात करने के लिए संकेत वृद्धि कर सकते हैं जो एक मजबूत intraocular गतिविधि असंतुलन लाती है. वें के साथ स्पष्टीकरण के जवाब में कार्यात्मक और संरचनात्मक परिवर्तनों की तुलनाOSE ऐसे उदाहरण के लिए ढक्कन सीवन के रूप में कम कठोर तरीकों से वंचित करने के बाद भी plasticity के दोनों समस्थिति और synaptic प्रकार में सहज रेटिना गतिविधि की भूमिका में नए अंतर्दृष्टि का पर्दाफाश हो सकता है.
स्पष्टीकरण प्रत्यक्ष रेटिना लक्ष्य में पौष्टिकता संबंधी प्रभावों का नुकसान हो सके. उदाहरण के लिए, BDNF का स्तर काफी पार्श्व जानुवत नाभिक (LGN) और वयस्क enucleated चूहों 13 की बेहतर colliculus में downregulated रहे हैं. संरचनात्मक remodeling मध्यस्थता दूत अणुओं के रूप में कार्य जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों,, भी वयस्क चूहे दृश्य प्रणाली 14 की subcortical संरचनाओं में पाया गया. इसके अलावा, माउस में अलग subcortical दृश्य लक्ष्य संरचनाओं भर microglial और astroglial सक्रियण एक सप्ताह में 15 की एक विशिष्ट के बाद स्पष्टीकरण समय सीमा में होते हैं. साथ में, glial, संरचनात्मक और आणविक स्तर पर अलग subcortical प्रतिक्रियाओं में ऑप्टिक deafferentation परिणाम है. इन subcortical बावजूदप्रभाव, यह जरूरी कॉर्टिकल स्तर 16 पर प्रभाव फंसाना नहीं करता है. अगले वंचित दृश्य प्रांतस्था के लिए गैर दृश्य आदानों के सुदृढ़ीकरण के लिए अन्य संवेदी क्षेत्रों में संशोधनों सहित उल्लेखनीय, पार मोडल कॉर्टिकल plasticity, दोनों एक आँख के बाद हो (इ) 3,4,17,18 और दूरबीन 1,17 (इ) स्पष्टीकरण.
इसके अलावा दृश्य तंत्रिका विज्ञान के लिए योगदान से, deafferentation के एक प्रकार के रूप में स्पष्टीकरण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के 19 न्यूरोप्रोटेक्टिव और neurodegenerative 20-22 गुणों के बीच संतुलन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
स्पष्टीकरण प्रदर्शन करने के लिए विभिन्न प्रक्रियाओं पहले से ही साहित्य में वर्णित हैं. चूहों और चूहों में vivo में मेरे लिए कुछ तरीके के कारण कक्षीय मांसपेशियों और ऊतकों को 23-25 से अनावश्यक सेक्शनिंग को कम सीधा कर रहे हैं. ऐसे महाजन एट अल के रूप में अन्य प्रकाशनों. (2011) 5 का उपयोग कर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान जीनोटाइप-phenotype सहसंबंध, संभावना पोस्टमार्टम अध्ययन करने के लिए आंखों की एक उच्च throughput संग्रह के लिए कुंद विच्छेदन. अपने उद्देश्य के लिए, विधि सुविधाजनक और तेज है. एक नहीं बल्कि आँखों से ही (जीवित पशुओं में) स्पष्टीकरण निम्नलिखित अभिवाही दृश्य मार्ग का अध्ययन करने के लिए opts हालांकि, जब इस विधि में विवो स्पष्टीकरण के लिए कम उपयुक्त है. इस तरह के एक स्थापित करने में, बाद के स्पष्टीकरण अस्तित्व उच्च महत्व का है. इसके अलावा, विवो क्षति और ऑप्टिक तंत्रिका के संरक्षण और कक्षीय ऊतक में कम से कम अनुकूल है. यहाँ, हम FAGUET एट अल द्वारा वर्णित एक करने के लिए, और इसी तरह एक वैकल्पिक स्पष्टीकरण विधि प्रस्तुत (2008) 26, कि कुछ लाभदायक गुण प्रदान करता है:. यह एक तेजी से पोस्ट ऑपरेटिव वसूली के साथ जुड़ा हुआ है और एक बहुत ही कम सीखने की सीमा की विशेषता है शोधकर्ताओं के लिए. आँख आकारिकी या दृश्य मार्ग अनुसंधान: सामान्य में, विभिन्न तरीकों बाद में अनुसंधान का फोकस के आधार पर पूरक हैं.
संक्षेप में ve_content ">, स्पष्टीकरण समस्थिति और पार मोडल मस्तिष्क plasticity, glial प्रतिक्रिया गुण, और अक्षतंतु स्थिरता की जांच की दिशा दृष्टि अनुसंधान से लागू किया जा सकता है. इस कल्पना अनुच्छेद में, हम इन विवो आंख स्पष्टीकरण के लिए एक व्यावहारिक और विश्वसनीय पद्धति में प्रदर्शन माउस.Protocol
सभी प्रयोगों के यू लोवेन का नैतिक अनुसंधान समिति ने मंजूरी दे दी है और यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक के साथ सख्त अनुसार थे 22 सितंबर 2010 (2010/63 / ईयू) और बेल्जियम के कानून के साथ (KB 29 मई 2013). हर संभव प्रयास पशु पीड़ा को कम करने के लिए और जानवरों की संख्या कम करने के लिए बनाया गया था.
1 पशु उपचार और anesthetics
- Ketamine हाइड्रोक्लोराइड (75 मिलीग्राम / एमएल) और खारा में medetomidine हाइड्रोक्लोराइड (1 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण का एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ माउस anesthetize.
- माउस पूरी तरह से बेहोश है आश्वस्त करने के लिए एक संदंश के साथ पैर की उंगलियों pinching द्वारा सजगता की जाँच करें.
- पलकें और एक कपास टिप का उपयोग आंख के आसपास के क्षेत्र कीटाणुरहित 70% इथेनॉल लागू करें. इसके अतिरिक्त बेहोश करने की क्रिया की डिग्री का आकलन करने के लिए पलक पलटा जाँच करें.
2 नेत्र निकाल रहा है
- सुनिश्चित करें कि पशु रहता है पर एक फ्लैट, सूखा औरचिकनी सतह.
- एक घुमावदार, दाँतेदार टिप (: 0.5 x 0.4 मिमी पसंदीदा टिप आकार) के साथ एक संदंश जीवाणुरहित.
- धीरे नेत्रगोलक सॉकेट से विस्थापित और ऑप्टिक तंत्रिका पहुँच से बाहर है जब तक संदंश के साथ नेत्रकोण (आँख के कोने) पर दबाएँ.
- आंख के पीछे संदंश गाइड. प्रेस और बेहतर वक्र की शुरुआत और संदंश का नहीं बहुत टिप के साथ, मजबूती से ऑप्टिक तंत्रिका पकड़. इस सॉकेट से दुनिया लिफ्ट करने के लिए और पूरी ऑप्टिक तंत्रिका शिकंजा कसने में मदद मिलेगी.
- माउस सपाट सतह पर बनी हुई है, जबकि हाथ से कम प्रतिरोध के साथ दिशा में संदंश धारण साथ परिपत्र आंदोलनों. माउस हाथ आंदोलन की दिशा के अनुसार सतह के साथ स्विंग होगी.
- ऑप्टिक तंत्रिका दो में constricted है जब तक धीरे धीरे बढ़ती गति के साथ यह क्रिया (आमतौर पर 7 से 15 परिपत्र आंदोलनों के बीच, लगभग एक आधा प्रति सेकंड एक पूर्ण बारी करने के लिए). इसलिए, अलग नेत्रगोलक हैहटा.
3 पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल
- (दुर्लभ) खून बह रहा है के मामले में, एक चिपचिपा जमना और hemostatic एजेंट के साथ कक्षा भरें.
- Intraperitoneally खारा में atipamezol हाइड्रोक्लोराइड की 1 मिलीग्राम / किग्रा इंजेक्शन द्वारा संज्ञाहरण उल्टा.
- दर्द को दूर करने के लिए intraperitoneally हर 24 घंटा meloxicam की 1 मिलीग्राम / किग्रा प्रशासन.
- कॉर्निया की निर्जलीकरण को रोकने के लिए शेष आँख के लिए आँख मरहम लागू करें.
- पशु एक हीटिंग थाली पर ठीक हो या शरीर के तापमान को नियंत्रित करने के लिए एक अलग पिंजरे में सामग्री इन्सुलेट में पशु लपेट दें.
- कम से कम 2 दिनों के लिए प्रत्येक दिन माउस के वजन को मापने. वजन में कमी पीड़ा से संकेत मिलता है और जानवर पूरी तरह से ठीक है जब तक इस मामले में, meloxicam उपचार जारी रख सकते हैं.
Representative Results
चित्रा 1 वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग आंख के सफल हटाने दिखाता है और रक्तस्राव के अभाव या कक्षीय ऊतक या थैली (आंकड़े 1 ए, 1 बी) के लिए किसी भी स्पष्ट शारीरिक क्षति की विशेषता है. इसके अलावा, हटाया आंख एक पूरी तरह से बरकरार ग्लोब (चित्रा 1C) के लिए संकेत एक चिकनी कॉर्निया, रंजित और ऑप्टिकल डिस्क, है. हमारे प्रोटोकॉल आंख और यांत्रिक मोड़ के पीछे ऑप्टिक तंत्रिका के clamping शामिल के बाद से, हटाया आंख की ऑप्टिक तंत्रिका रेटिना (चित्रा -1) के आधार पर constricted है. आसपास के मस्तिष्क क्षेत्र (चित्रा 1E) के लिए किसी भी क्षति के बिना एक स्वच्छ कट ऑप्टिक तंत्रिका में वर्णित प्रक्रिया के परिणाम प्रदर्शन.
आँख का स्पष्टीकरण, गतिविधि मानचित्रण (चित्रा 2) के साथ संयोजन में, एक तेजी से contralateral visua में कार्यात्मक या आंख विशिष्ट इनपुट क्षेत्रों को चित्रित करने के लिए अनुमति देता हैबंदरों 28 की तरह उच्च आदेश स्तनधारियों में माउस 12,27 या यहां तक कि आंख का प्रभुत्व कॉलम के एल प्रांतस्था.
चूहों के साथ प्रयोगों, एक को हटाने (इ) या दोनों आंखों में लक्षित दृश्य उत्तेजना और zif268 mRNA या C-Fos प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने के साथ संयुक्त (इ) दृश्य प्रांतस्था 12,27 में क्षेत्रीय न्यूरोनल सक्रियण को उजागर करने के लिए लागू किया गया था . नेत्रहीन प्रेरित नियंत्रण (2A चित्रा) के विपरीत, इ चूहों दृश्य इनपुट (चित्रा 2B) की कमी को पूरा करने के कारण दृश्य प्रांतस्था में बेसल गतिविधि देखी गई. जैसे, गैर दृश्य प्रांतस्था (यानी. अधिक पूर्वकाल वर्गों और अधिक पीछे वर्गों में श्रवण प्रांतस्था में somatosensory प्रांतस्था) के साथ दृश्य के बीच सीमाओं का पर्दाफाश किया गया. एक एक सप्ताह के अस्तित्व समय के साथ मुझे चूहों से परिणाम contralateral दृश्य प्रांतस्था में आँख विशिष्ट इनपुट क्षेत्रों कल्पना. दो monocularly संचालित क्षेत्रों hypoactive थे और दवा स्थितअल और केंद्रीय दूरबीन क्षेत्र (चित्रा -2) के पार्श्व.
थैली, हटाया आंख और ऑप्टिक तंत्रिका के बाद स्पष्टीकरण राज्य की चित्रा 1 गुणात्मक मूल्यांकन. एक घुमावदार संदंश (ए) कोई खून बह रहा है या नुकसान थैली (बी) में मनाया जाता है के साथ आंख निकालने के बाद. कॉर्निया और रंजित (सी, डी) की एक सामान्य रूप से परिलक्षित के रूप में हटाया आंख पूरी तरह से बरकरार है. ऑप्टिक तंत्रिका यह आंख (डी) छोड़ देता है जहां ऑप्टिक डिस्क पर constricted है. मस्तिष्क के उदर भाग की परीक्षा एक साफ काट ऑप्टिक तंत्रिका (तारांकन) और अन्य संरचनाओं (ई) के लिए कोई स्पष्ट क्षति का पता चलता है. सी, डी में स्केल सलाखों: 1 मिमी. ई में स्केल बार: 5 मिमी. एक: पूर्वकाल; एल: वाम; पी: पीछे; आर: ठीक है.
चित्रा स्पष्टीकरण से पता चला माउस दृश्य प्रांतस्था में 2 कार्यात्मक आंख इनपुट विशिष्ट उप विभाजनों. आंखों और प्रांतस्था कनेक्ट कि काले और भूरे रंग लाइनों रेटिना afferents और आंख विशिष्ट इनपुट क्षेत्रों के पार का प्रतिनिधित्व करते हैं. तंत्रिका गतिविधि नियंत्रण (ए) के राज्याभिषेक वर्गों पर कल्पना है, (बी) हो, और zif268 (ग्रे स्केल) के लिए स्वस्थानी संकरण (ISH) में रेडियोधर्मी ने मुझे (सी) चूहों शीर्षस्थान स्तर के आसपास -3.40 मिमी. नियंत्रण जानवरों (ए) में, दोनों गोलार्द्धों में दृश्य प्रांतस्था दृश्य उत्तेजना के बाद उच्च गतिविधि व्यक्त करता है. एक या दोनों आंख (ओं) extirpated रहे हैं, गतिविधि संकेत में एक स्पष्ट कमी वंचित cortical क्षेत्रों इसी में दिखाई देता है. Monocularly (सी) चूहों उच्च acti के एक क्षेत्र को दिखाने enucleatedहटाया आंख को contralateral आँख क्षेत्रों में एक कम संकेत से घिरे दृश्य प्रांतस्था की दूरबीन क्षेत्र में vity. स्केल बार: 2 मिमी. वान ब्रसेल्स एट अल 12 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित.
Discussion
हमारे विधि के अनुसार एक सफल स्पष्टीकरण को करने के लिए विचार करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) उचित आकार का एक घुमावदार और दाँतेदार टिप के साथ एक संदंश का उपयोग; 2) एक चिकनी और शुष्क सतह पर स्पष्टीकरण प्रदर्शन; और 3) धीरे धीरे कम से कम घर्षण के साथ दिशा में परिपत्र आंदोलनों को तेज.
एक प्रभावी परिणाम के लिए यह एक घुमावदार और दाँतेदार टिप द्वारा विशेषता एक उपयुक्त संदंश का उपयोग करने के लिए आवश्यक है (: माउस: वरीय टिप आकार 0.5 x 0.4 मिमी, चूहा: 2.15 x 1.3 मिमी). वक्रता नेत्रगोलक विस्थापन के बाद ऑप्टिक तंत्रिका के लिए एक आसान पहुँच के लिए अनुमति देता है और परिपत्र आंदोलनों प्रदर्शन जब सही हाथ नियुक्ति के लिए आवश्यक है. ऑप्टिक तंत्रिका पकड़े जब वे आवश्यक पकड़ की कमी के बाद से चिकना सुझावों की सिफारिश नहीं कर रहे हैं. परिपत्र आंदोलनों के दौरान ठीक से ऑप्टिक तंत्रिका पकड़ करने में विफलता नेत्र धमनी, आंख की गरीब टुकड़ी और इसलिए गरीब reproducibility का टूटना में यह परिणाम है.इसलिए यह विवो में विधि लागू करने के लिए एक बार अधिक से अधिक पशु कल्याण की गारंटी करने के क्रम में निपटने संदंश के अनुकूलन के लिए euthanized जानवरों पर पहले अभ्यास करने के लिए इस तकनीक की सिफारिश की है. सफल आंख स्पष्टीकरण हाल ही में भी मैन्युअल पशु शरीर मोड़ और संदंश स्थिर रखने के अलावा एक ही तकनीक का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में चूहे में प्रदर्शन किया गया है.
तकनीक की एक सीमा है कि यह संभवतः रेटिना को नुकसान पहुंचा सकता है. इसलिए इस विधि ऊतक विज्ञान 5 प्रदर्शन करने retinas इकट्ठा करने के लिए कम उपयुक्त है. इसके अलावा, हमारे विधि नेत्रगोलक को हटाने या पलकों को काटने के बिना सॉकेट से विस्थापित होने की जरूरत है, क्योंकि आंख खोलने उम्र पोस्ट करने के लिए सीमित है.
कृन्तकों सहित विभिन्न प्रजातियों में आई स्पष्टीकरण, नियमित अक्सर पलकों को हटाने करना पड़ेगा जो वैकल्पिक तरीकों का उपयोग करते हुए और ऑप्टिक तंत्रिका 18,23-25 काटने प्रदर्शन किया है. इन methoडी एस अधिक आक्रामक हो जाते हैं और यहाँ वर्णित तकनीक की तुलना में अधिक सीखने की अवस्था है. हटाने या पलकों suturing की आवश्यकता के बिना, के बाद सर्जरी वसूली समय उच्च पशु कल्याण और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों में जिसके परिणामस्वरूप कम से कम है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride (Anesketin) | Dechra Veterinary Products (Eurovet) | BE-V136516 | |
| Medetomidine hydrochloride (Domitor) | Orion Corporation (Janssen Animal Health) | BE-V151742 | |
| Atipamezol hydrochloride (Antisedan) | Orion Corporation (Elanco Animal Health) | BE-V153352 | |
| Antibiotics (cefazolin, Kefzol) | Eurocept Pharmaceuticals | BE 106267 | |
| Eye ointment (Fucithalmic) | Leo Pharma nv-sa | BE 144654 | |
| Moria MC31 Forceps - Serrated Curved | Fine Science Tools | 11370-31 | For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
| Narrow Pattern Forceps - curved | Fine Science Tools | 11003-13 | For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
| Hemostatic cotton wool | Qualiphar | N/A | Other hemostatic agents are equally suitable (e.g., Viscostat, #649, Ultradent Products) |
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