Summary
Avlägsnandet av ögon, även kallad enucleation, ger en användbar strategi för att studera aspekter av visuell, cross-modal, och utvecklande plasticitet längs däggdjur visuella systemet, eftersom den leder till irreversibel partiell (lupp) eller fullständigt (binokulärt) synförlust. Här beskriver vi en mycket reproducerbar och enkel metod för att utföra in vivo enucleation.
Abstract
Enucleation eller kirurgiskt avlägsnande av ett öga kan i allmänhet betraktas som en modell för nerv deafferentation. Det ger ett värdefullt verktyg för att studera olika aspekter av visuell, cross-modal och utvecklande plasticitet längs däggdjur visuella systemet 1-4.
Här visar vi en elegant och enkel teknik för avlägsnande av ett eller båda ögonen hos mus, som är validerad i möss av 20 dagar gamla upp till vuxna. I korthet är en desinficerad böjd pincett som används för att klämma synnerven bakom ögat. Därefter cirkelrörelser utföras för att sammandra synnerven och avlägsna ögongloben. Fördelarna med denna teknik är hög reproducerbarhet, minimal eller ingen blödning, snabb postoperativ återhämtning och en mycket låg tröskel lärande för försöksledaren. Därför kan en stor mängd djur manipuleras och bearbetas med minimal ansträngning. Den typ av teknik kan inducera svag skada pånäthinnan under förfarandet. Denna biverkan gör denna metod mindre lämplig jämfört med Mahajan et al. (2011) 5 om målet är att samla in och analysera näthinnans vävnad. Dessutom är vår metod begränsad till efterögonöppnings åldrar (mus: P10 - 13 och framåt) eftersom ögongloben behöver förskjutas från sockeln utan att ta bort ögonlocken. In vivo enucleation teknik som beskrivs i detta manuskript har nyligen med framgång tillämpats med mindre modifikationer på råttor och bedöms vara av värde att studera afferenta visuella vägen för gnagare i allmänhet.
Introduction
Ta bort ett öga och därmed oåterkalleligt destruktion den sensoriska receptorytan (näthinnan), innebär en betydande förlust av sinnesintryck längs siktvägen. Den enucleation modellen i juvenil och adult visuella systemet har visat sig vara värdefull för att förstå utveckling, plasticitet och funktion olika visuella centra 1-4. De molekylära, cellulära och fysiologiska konsekvenser av denna sensorisk deprivation kan ge insikter i hur normal utveckling regleras och hur etablerad kortikala kretsar klara och ändra sin struktur och funktion som svar på en så omfattande förändring i erfarenhet.
Olika metoder för visuell deprivation existerar och de har alla sina specifika fördelar syn relaterad forskning. Till exempel mörk uppfödning specifikt eliminerar visuellt driven aktivitet men det påverkar inte den spontana retinal aktivitet. På samma sätt lock suturer eller ögonlapp ta bort mönstrad videoanläggningl-ingång utan att störa spontan aktivitet, men de tillåter spridda ljuspenetration genom slutna ögon. Dessa metoder är reversibla och har visat sig vara värdefulla för att förstå betydelsen av mönstrade vision och lågaktivt korrelation av kikare ingångar i skulptera kortikala kretsar under utveckling 6-8. I glaukom forskning har synnerven krossa modell hos vuxna djur använts i stor utsträckning för att det upprättas en progressiv förlust av retinala ganglion cellingångar som utgör synnerven 9,10. Å andra sidan, enucleation, där ögat och därmed näthinnan är helt och omedelbart tas bort, är det lämpligt val av deprivation när syftet är att irreversibelt bort både spontan och mönstrade syn på en gång. Det framkallar också en robust intraokulära aktivitets obalans som kan förbättra signal-brusförhållandet i aktivitetskartläggningsstudier 11,12. Jämföra funktionella och strukturella förändringar som svar på enucleation med those efter deprivation genom mindre drastiska metoder såsom lock sutur exempelvis även kan utsätta nya insikter i den roll som spontan retinal aktivitet i både homeostatiska och synaptiska typer av plasticitet.
Enucleation utlöser en förlust av trofiska influenser i direkta retinala mål. Till exempel är BDNF nivåer betydligt nedregleras i den laterala kärnan geniculate (LGN) och överlägsen colliculi av vuxna enukleerade råttor 13. Reaktiva syreradikaler, som fungerar som budbärarmolekyler att förmedla strukturell ombyggnad, har också upptäckts i subkortikala strukturer vuxen råtta visuella systemet 14. Dessutom microglial och astrogliala aktivering i olika subkortikala visuella målstrukturer i musen ske i ett visst efter enucleation tidsram på en vecka 15. Tillsammans optiska deafferentation ger olika subkortikala svar på gliaceller, strukturell och molekylär nivå. Trots dessa subkortikaleffekter, inte nödvändigtvis implicerade effekter på kortikal nivå 16. Anmärkningsvärt, cross-modal kortikal plasticitet, inbegripet ändringar i andra sensoriska områden bredvid förstärkning av icke-visuella ingångar till berövade syncentrum inträffar efter både lupp (ME) 3,4,17,18 och kikare (BE) 1,17 enucleation.
Utöver att bidra till visuell neuroscience, kan enucleation som en typ av deafferentation användas för att studera balansen mellan neuroskyddande 19 och neurodegenerativa 20-22 egenskaperna hos det centrala nervsystemet.
Olika förfaranden för att utföra enucleation redan beskrivits i litteraturen. Vissa metoder för in vivo ME hos råttor och möss är mindre enkelt på grund av onödig sektione i omloppsbanor muskler och vävnad 23-25. Andra publikationer såsom Mahajan et al. (2011) 5 ge ett detaljerat protokoll med hjälp av dissektion för en hög genomströmning samling ögon att studera genotyp-fenotyp korrelationer, sannolikt efter slakt. För deras syfte är metoden bekvämt och snabbt. Emellertid är denna metod mindre lämplig för in vivo enucleation när man väljer att studera afferenta visuella vägen efter enukleation (i levande djur) snarare än själva ögat. I en sådan miljö är efter enucleation överlevnad av stor betydelse. Även minimala in vivo skador och bevarande av synnerven och orbital vävnad är gynnsam. Här presenterar vi ett alternativt enucleation metod, mer liknar den som beskrivs av Faguet et al (2008) 26, som erbjuder vissa fördelaktiga egenskaper:. Den är associerad med en snabb postoperativ återhämtning och kännetecknas av en tröskel mycket låg inlärnings för forskare. I allmänhet olika metoder kompletterar varandra beroende på inriktning senare forskning: ögon morfologi eller visuell väg forskning.
ve_content "> Sammanfattningsvis kan enucleation tillämpas från vision forskning mot undersökningar av homeostatiska och tvär modal hjärnans plasticitet, gliaceller svar egenskaper, och Axon stabilitet. Här visualiseras artikeln visar vi en genomförbar och tillförlitlig metod för in vivo ögon enucleation i musen.Protocol
Alla experiment har godkänts av etisk forskning kommitté av KU Leuven och var helt i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv av den 22 september 2010 (2010/63 / EU) och med den belgiska lagstiftningen (KB av den 29 maj 2013). Alla möjliga ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande och för att minska antalet djur.
1 Animal Treatment och bedövningsmedel
- Bedöva musen med en intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin-hydroklorid (75 mg / ml) och medetomidin-hydroklorid (1 mg / kg) i saltlösning.
- Kontrollera reflexer genom att klämma tårna med en pincett för att säkerställa musen är helt sövd.
- Applicera 70% etanol för att desinficera ögonlocken och området kring ögat med hjälp av en bomullsspets. Kontrollera ögonlocksreflexen att dessutom fastställa graden av sedering.
2 Ta bort Eye
- Se till att djuret befinner sig på en plan, torr ochslät yta.
- Sterilisera en pincett med en böjd, tandad spets (drog tip storlek: 0,5 x 0,4 mm).
- Tryck försiktigt på ögonvrå (ögonvrån) med pincett tills ögongloben har fördrivits från sockeln och synnerven är nåbar.
- Guide pincetten bakom ögat. Tryck och håll synnerven ordentligt, helst med början av kurvan och inte den yttersta spetsen av tången. Detta kommer att hjälpa till att lyfta klot från uttaget och för att klämma den kompletta synnerven.
- Gör cirkelrörelser med handen håller tången i riktning med minsta motstånd när musen kvar på den plana ytan. Musen kommer att svänga utmed ytan i enlighet med riktningen av handrörelse.
- Utför denna åtgärd med gradvis ökande hastighet tills synnerven är förträngd i två (vanligtvis mellan 7 till 15 cirkelrörelser, ungefär ett halvt till ett helt varv per sekund). Således är friliggande eyeballavlägsnas.
3. Postoperativ vård
- Vid blödning (sällsynt), fyll bana med en trögflytande koagulera och hemostatikum.
- Omvänd anestesi genom att injicera 1 mg / kg av atipamezol hydroklorid i saltlösning intraperitonealt.
- Administrera 1 mg / kg av Meloxicam intraperitonealt varje 24 timmar för att lindra smärta.
- Applicera ögonsalva till det återstående ögat för att förhindra uttorkning av hornhinnan.
- Låt djuret återhämta sig på en värmeplatta eller linda djuret i isolerande material i en separat bur för att reglera kroppstemperaturen.
- Mät vikt av mus varje dag under minst två dagar. Viktminskning kan tyda lidande och i detta fall, fortsätt Meloxicam behandlingen till dess att djuret återhämtat sig helt.
Representative Results
Figur 1 illustrerar det framgångsrika avlägsnandet av ögat med användning av den beskrivna protokollet och kännetecknas av frånvaro av blödning eller någon uppenbar fysisk skada på den orbitala vävnaden eller ögonhålan (figurerna 1A, 1B). Vidare har avlägsnats ögat en slät hornhinna, åderhinnan och optisk skiva, indikativ för en helt intakt klot (Figur 1C). Eftersom våra protokoll omfattar kläm av synnerven bakom mekanisk svarvning ögat och är synnerven av det borttagna ögat trängd vid basen av näthinnan (Figur 1D). Utföra de beskrivna förfarande resulterar i en ren skuren synnerven utan några skador på den omgivande hjärnområdet (figur 1E).
Monokulära enucleation, i kombination med aktivitetskartläggning (figur 2), gör att man kan skarpt avgränsa de funktionella eller ögonspecifika inmatningsområden i kontravideoanläggningl cortex på musen 12,27 eller okulära dominans kolumner i högre ordningens däggdjur som apor 28.
I experiment med möss, avlägsnande av en (ME) eller båda ögonen (BE) i kombination med riktad visuell stimulans och upptäckt av Zif268 mRNA eller c-Fos proteinexpressionsnivåer tillämpades för att avslöja den regionala neuronal aktivering i syncentrum 12,27 . Till skillnad visuellt stimulerade kontroller (Figur 2A), BE möss visade basal aktivitet i syncentrum grund slutföra brist på visuell ingång (Figur 2B). Som sådan var gränserna mellan visuellt med icke-visuella cortex (dvs.. Somatosensoriska cortex fler främre avsnitt och hörselbarken på fler bakre avsnitt) avslöjats. Resultat från ME möss med en veckas levnadstid visualiseras ögonspecifika ingångsregioner i den kontra syncentrum. De två monocularly drivna områden var hypoactive och ligger medial och sidled av den centrala binokulär zon (figur 2C).
Figur 1 Kvalitativ utvärdering av post-enucleation tillståndet i ögonhålan, den borttagna ögat och synnerven. Efter avlägsnande av ögat med en böjd pincett (A) ingen blödning eller skada observeras i ögonhålan (B). Den borttagna ögat är helt intakt som reflekteras av ett normalt utseende av hornhinnan och åderhinnan (C, D). Synnerven är förträngd vid synnervspapillen där den lämnar ögat (D). Undersökning av den ventrala delen av hjärnan avslöjar ett rent snitt synnerven (asterisk) och ingen uppenbar skada på andra strukturer (E). Skala barer i C, D: 1 mm. Scale bar in E: 5 mm. A: anterior; L: vänster; P: posterior; R: höger.
Figur 2. Funktionella ögoninsatsspecifika underavdelningar i mus syncentrum som påvisades vid enucleation. Svarta och grå linjer som ansluter ögon och cortex representerar korsningen över av retinala afferenter och ögonspecifika inmatningsområden. Neural aktivitet visualiseras på koronala sektioner av kontrollen (A), BE (B) och ME (C) möss genom radioaktivt in situ hybridisering (ISH) för Zif268 (gråskala) runt Bregma nivå -3,40 mm. I kontrolldjur (A), syncentrum i båda hemisfärer uttrycker hög aktivitet efter visuell stimulering. När en eller båda ögonen (s) är utrotas, är en klar minskning i aktivitetssignalen syns i motsvarande eftersatta kortikala regioner. Monocularly enucleated (C)-möss uppvisar en zon med hög activitet i kikare zon syncentrum omgiven av en minskad signal i de monokulära zonerna kontra till den borttagna ögat. Skala bar: 2 mm. Återges med tillstånd från Van Brussel m.fl. 12.
Discussion
För att utföra en framgångsrik enucleation enligt vår metod, de mest kritiska stegen för att tänka på är: 1) med hjälp av en tång med en böjd och tandad spets av lämplig storlek; 2) utför enucleation på en jämn och torr yta; och 3) gradvis påskynda de cirkulära rörelser i riktning med minsta friktion.
För ett effektivt resultat är det viktigt att använda en lämplig tång som kännetecknas av en böjd och tandad spets (drog tips Storlek: mus: 0,5 x 0,4 mm, råtta: 2,15 x 1,3 mm). Krökn möjliggör en enkel tillgång till synnerven efter ögongloben förskjutning och är nödvändig för korrekt handen placering när du utför de cirkulära rörelser. Släta spetsar rekommenderas inte eftersom de saknar den nödvändiga grepp när man håller synnerven. Underlåtenhet att hålla synnerven på rätt sätt under de cirkulära rörelser resulterar i ruptur av den oftalmiska artären, dålig avlossning av ögat och därmed dålig reproducerbarhet.Därför rekommenderas att först praktiken teknik på euthanized djur för optimering av tången hantering för att garantera maximal djurskydd gång tillämpa metoden in vivo. Framgångsrik öga enucleation har nyligen också utförts i råtta i vårt labb med samma teknik med undantag för att vrida på djurkroppen manuellt och hålla pincett stationärt.
En begränsning av tekniken är att det möjligen kan skada näthinnan. Därför denna metod är mindre lämplig för att samla näthinnor att utföra histologi 5. Dessutom är vår metod begränsas för att posta ögonöppnings åldrar eftersom ögongloben behöver förskjutas från sockeln utan att ta bort eller skära ögonlocken.
Ögon enucleation i olika arter, inklusive gnagare, rutinmässigt utförs med hjälp av alternativa metoder, som ofta innebär borttagning av ögonlocken och skära synnerven 18,23-25. Dessa metods tenderar att vara mer invasiva och har en högre inlärningskurva än den teknik som beskrivs här. Utan behov av att ta bort eller suturering ögonlocken, är återhämtningstiden efter operationen minimeras, vilket resulterar i högre djurskydd och mer reproducerbara resultat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride (Anesketin) | Dechra Veterinary Products (Eurovet) | BE-V136516 | |
| Medetomidine hydrochloride (Domitor) | Orion Corporation (Janssen Animal Health) | BE-V151742 | |
| Atipamezol hydrochloride (Antisedan) | Orion Corporation (Elanco Animal Health) | BE-V153352 | |
| Antibiotics (cefazolin, Kefzol) | Eurocept Pharmaceuticals | BE 106267 | |
| Eye ointment (Fucithalmic) | Leo Pharma nv-sa | BE 144654 | |
| Moria MC31 Forceps - Serrated Curved | Fine Science Tools | 11370-31 | For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
| Narrow Pattern Forceps - curved | Fine Science Tools | 11003-13 | For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
| Hemostatic cotton wool | Qualiphar | N/A | Other hemostatic agents are equally suitable (e.g., Viscostat, #649, Ultradent Products) |
References
- Toldi, J., Fehér, O., Wolff, J. R. Neuronal plasticity induced by neonatal monocular (and binocular) enucleation. Progress in Neurobiology. 48 (3), 191-218 (1996).
- Steeves, J. K. E., González, E. G., Steinbach, M. J. Vision with one eye: a review of visual function following unilateral enucleation. Spatial vision. 21 (6), 509-529 (2008).
- Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. Evidence for cross-modal plasticity in adult mouse visual cortex following monocular enucleation. Cerebral Cortex. 21 (9), 2133-2146 (2011).
- Nys, J., Aerts, J., Ytebrouck, E., Vreysen, S., Laeremans, A., Arckens, L. The cross-modal aspect of mouse visual cortex plasticity induced by monocular enucleation is age-dependent. Journal of Comparative Neurology. 522 (4), 950-970 (2014).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e57 (2011).
- Morales, B., Choi, S. -Y., Kirkwood, A. Dark rearing alters the development of GABAergic transmission in visual cortex. Journal of Neuroscience. 22 (18), 8084-8090 (2002).
- Chen, X. J., Rasch, M. J., Chen, G., Ye, C. Q., Wu, S., Zhang, X. H. Binocular input coincidence mediates critical period plasticity in the mouse primary visual cortex. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2940-2955 (2014).
- Konur, S., Yuste, R. Developmental regulation of spine and filopodial motility in primary visual cortex: Reduced effects of activity and sensory deprivation. Journal of Neurobiology. 59 (2), 236-246 (2004).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: A comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
- Galindo-Romero, C., et al. Axotomy-induced retinal ganglion cell death in adult mice: Quantitative and topographic time course analyses. Experimental Eye Research. 92 (5), 377-387 (2011).
- Kanold, P. O., Kim, Y. A., GrandPre, T., Shatz, C. J. Co-regulation of ocular dominance plasticity and NMDA receptor subunit expression in glutamic acid decarboxylase-65 knock-out mice. The Journal of Physiology. 587 (12), 2857-2867 (2009).
- Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. Identification and localization of functional subdivisions in the visual cortex of the adult mouse. Journal of Comparative Neurology. 514 (1), 107-116 (2009).
- Avwenagha, O., Bird, M. M., Lieberman, A. R., Yan, Q., Campbell, G. Patterns of expression of brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase B mRNAs and distribution and ultrastructural localization of their proteins in the visual pathway of the adult rat. Neuroscience. 140 (3), 913-928 (2006).
- Hernandes, M. S., Britto, L. R. G., Real, C. C., Martins, D. O., Lopes, L. R. Reactive oxygen species and the structural remodeling of the visual system after ocular enucleation. Neuroscience. 170 (4), 1249-1260 (2010).
- Cuyvers, A., Paulussen, M., Smolders, K., Hu, T. -T., Arckens, L. Local cell proliferation upon enucleation in direct retinal brain targets in the visual system of the adult mouse. Journal of Experimental Neuroscience. 4, 1-15 (2010).
- Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. Experience-dependent binocular competition in the visual cortex begins at eye opening. Nature Neuroscience. 10 (3), 370-375 (2007).
- Toldi, J., Farkas, T., Völgyi, B. Neonatal enucleation induces cross-modal changes in the barrel cortex of rat. A behavioural and electrophysiological study. Neuroscience Letters. 167 (1-2), 1-4 (1994).
- Newton, J. R., Sikes, R. W., Skavenski, A. A. Cross-modal plasticity after monocular enucleation of the adult rabbit. Experimental Brain Research. 144 (4), 423-429 (2002).
- Lalonde, J., Chaudhuri, A. Dynamic changes in CREB phosphorylation and neuroadaptive gene expression in area V1 of adult monkeys after monocular enucleation. Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (1), 24-37 (2007).
- You, Y., Gupta, V. K., Graham, S. L., Klistorner, A. Anterograde degeneration along the visual pathway after optic nerve injury. PLoS ONE. 7 (12), e52061 (2012).
- Kelly, K. R., McKetton, L., Schneider, K. A., Gallie, B. L., Steeves, J. K. E. Altered anterior visual system development following early monocular enucleation. NeuroImage: Clinical. 4, 72-81 (2014).
- Chow, A. M., Zhou, I. Y., Fan, S. J., Chan, K. W. Y., Chan, K. C., Wu, E. X. Metabolic changes in visual cortex of neonatal monocular enucleated rat: a proton magnetic resonance spectroscopy study. International Journal of Developmental Neuroscience. 29 (1), 25-30 (2011).
- Dyer, R. S., Hammond, M. Effects of enucleation in retinal degenerate mice. Physiology & behavior. 14 (2), 207-210 (1975).
- Smith, S. A., Bedi, K. S. Unilateral eye enucleation in adult rats causes neuronal loss in the contralateral superior colliculus. Journal of Anatomy. 190 (4), 481-490 (1997).
- Gonzalez, D., et al. Effects of monocular enucleation on calbindin-D 28k and c-Fos expression in the lateral geniculate nucleus in rats. Okajimas folia anatomica Japonica. 82 (1), 9-18 (2005).
- Faguet, J., Maranhao, B., Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. Ipsilateral eye cortical maps are uniquely sensitive to binocular plasticity. Journal of Neurophysiology. 101 (2), 855-861 (2008).
- Van der Gucht, E., Hof, P. R., Van Brussel, L., Burnat, K., Arckens, L. Neurofilament protein and neuronal activity markers define regional architectonic parcellation in the mouse visual cortex. Cerebral Cortex. 17 (12), 2805-2819 (2007).
- Chaudhuri, A., Matsubara, J. A., Cynader, M. S. Neuronal activity in primate visual cortex assessed by immunostaining for the transcription factor Zif268. Visual Neuroscience. 12 (1), 35-50 (1995).
