Summary
Het verwijderen van de ogen, ook wel enucleatie, een bruikbare strategie om aspecten van de visuele, cross-modale en ontwikkelingsplasticiteit bestuderen langs de zoogdieren visuele systeem is omdat het leidt tot onomkeerbare gedeeltelijke (monoculair) of volledige (binoculair) verlies van gezichtsvermogen. Hier beschrijven we een zeer reproduceerbare en duidelijke aanpak om te presteren in vivo enucleatie.
Abstract
Enucleatie of de chirurgische verwijdering van een oog kan in het algemeen worden beschouwd als een model voor zenuw deafferentatie. Het biedt een waardevol hulpmiddel om de verschillende aspecten van de visuele, cross-modale en ontwikkelingsplasticiteit bestuderen langs de zoogdieren visuele systeem 1-4.
Hier tonen we een elegante en eenvoudige techniek voor het verwijderen van een of beide ogen in de muis, die wordt gevalideerd in muizen van 20 dagen oud tot volwassenen. In het kort wordt een gedesinfecteerde gebogen pincet gebruikt om de oogzenuw achter het oog klemmen. Vervolgens worden cirkelvormige bewegingen uitgevoerd aan de oogzenuw vernauwen en verwijder de oogbol. De voordelen van deze techniek zijn hoge reproduceerbaarheid, weinig tot geen bloeden, snelle post-operatief herstel en een zeer lage leerdrempel voor de experimentator. Derhalve kan een grote hoeveelheid dieren worden gemanipuleerd en verwerkt met minimale inspanning. De aard van de techniek lichte schade veroorzakenhet netvlies tijdens de procedure. Deze bijwerking is deze methode minder geschikt ten opzichte Mahajan et al. (2011) 5 als het doel is het verzamelen en analyseren van retinale weefsel. Ook is onze methode beperkt tot post-eye opening leeftijden (muis: P10 - 13 en verder), omdat de oogbol moet worden verplaatst uit het stopcontact, zonder het verwijderen van de oogleden. De in vivo enucleatie techniek dit manuscript beschreven is onlangs succesvol toegepast met kleine modificaties in ratten en nuttig lijkt de afferente gezichtsbaan knaagdieren studie in het algemeen.
Introduction
Een oog verwijderen en daarmee onherroepelijk vernietigende de receptor oppervlak zintuiglijke (retina), legt een aanzienlijk verlies van zintuiglijke input langs de visuele banen. De enucleatie model in de juveniele en volwassen visuele systeem is nuttig gebleken om inzicht in de ontwikkeling, plasticiteit en functie van verschillende visuele centra 1-4 zijn. De moleculaire, cellulaire en fysiologische gevolgen van deze sensorische deprivatie kan inzicht in hoe de normale ontwikkeling is geregeld en hoe gevestigde corticale circuits omgaan en hun structuur en functie te veranderen in reactie op een dergelijk ingrijpende verbouwing in ervaring te bieden.
Verschillende methoden van visuele deprivatie bestaan en ze hebben allemaal hun specifieke voordelen in visie-gerelateerd onderzoek. Bijvoorbeeld donkere opfok specifiek elimineert visueel gedreven activiteit nog is het niet van invloed op de spontane retinale activiteit. Ook deksel hechtingen of oogkleppen verwijderen patroon Visual ingang zonder spontane activiteit te storen, maar ze laten verspreide lichtinval door de gesloten ogen. Die methoden zijn omkeerbaar en is aangetoond waardevol in het begrijpen van de rol van patroon visie en low-level correlatie van binoculair ingangen in beeldhouwen corticale circuits tijdens de ontwikkeling 6-8 te zijn. In glaucoom onderzoek heeft de oogzenuw verpletteren model volwassen dieren veel gebruikt omdat het wordt een progressief verlies van retinale ganglioncellen ingangen met oogzenuw 9,10 opleveren. Anderzijds, enucleatie, waar het oog en dus de retina volledig en onmiddellijk verwijderd, is de geschikte keuze van deprivatie wanneer het de bedoeling is irreversibel verwijderen zowel spontaan gevormde visie tegelijk. Het induceert ook een sterke intraoculaire activiteit onbalans die de signaal-ruisverhouding in activiteit cognitieve experimenten 11,12 kan verbeteren. Het vergelijken van de functionele en structurele veranderingen in reactie op enucleatie met those na ontbering minder drastische methoden zoals deksel hechtdraad kan bijvoorbeeld ook nieuwe inzichten in de rol van spontane retinale activiteit zowel homeostatische en synaptische plasticiteit soorten bloot.
Enucleatie veroorzaakt een verlies van trofische invloeden direct retinale targets. Zo worden BDNF significant neerwaarts gereguleerd in de laterale geniculate nucleus (LGN) en superieure colliculus van volwassen ratten ontkernde 13. Zuurstofradicalen, die fungeren als boodschapper moleculen structurele verbouwing bemiddelen, werden ook aangetroffen in subcorticale structuren van de volwassen rat visuele systeem 14. Bovendien, microglia en astrogliale activatie over verschillende subcorticale visuele doelwit structuren in de muis zich voordoen in een specifieke post-enucleatie tijdsbestek van een week 15. Samen optische deafferentatie resultaten in verschillende subcorticale reacties op de gliacellen, structurele en moleculair niveau. Ondanks deze subcorticaleeffecten, is het niet per se impliceren effecten op de corticale niveau 16. Opmerkelijk, cross-modale corticale plasticiteit, met inbegrip van wijzigingen in andere zintuiglijke gebieden naast de versterking van de niet-visuele input voor de kansarme visuele cortex optreden na zowel monoculair (ME) 3,4,17,18 en binoculair (BE) 1,17 enucleatie.
Naast de bijdrage aan visuele neurologie, kan enucleatie als type deafferentatie worden om de balans tussen neuroprotectieve 19 en neurodegeneratieve 20-22 eigenschappen van het centrale zenuwstelsel te onderzoeken.
Verschillende procedures tot enucleatie voeren zijn reeds beschreven in de literatuur. Bepaalde methoden voor in vivo ME bij ratten en muizen zijn minder eenvoudig als gevolg van onnodige snijden van orbitale spieren en weefsel 23-25. Andere publicaties zoals Mahajan et al. (2011) 5 een gedetailleerd protocol gebruikt stompe dissectie voor een high-throughput verzameling van ogen voor de genotype-fenotype correlaties waarschijnlijk post-mortem onderzoek. Voor hun doel, de methode is handig en snel. Deze methode is minder geschikt voor in vivo enucleatie wanneer men kiest voor de afferente gezichtsbaan volgende enucleatie (in levende dieren) in plaats van het oog zelf. In een dergelijke omgeving, post-enucleatie overleven is van groot belang. Ook minimaal in vivo schade en het behoud van de oogzenuw en orbitale weefsel is gunstig. Hier presenteren we een alternatieve methode enucleatie, meer vergelijkbaar met die beschreven door Faguet et al (2008) 26, dat bepaalde voordelige eigenschappen heeft:. Het wordt geassocieerd met een snelle post-operatief herstel en wordt gekenmerkt door een zeer lage leerdrempel voor onderzoekers. In het algemeen zijn verschillende methoden zijn complementair, afhankelijk van de focus van het daaropvolgende onderzoek: oog morfologie of visuele pathway onderzoek.
ve_content "> Samenvattend kan enucleatie worden toegepast vanaf vision onderzoek naar onderzoek van homeostatische en cross-modale plasticiteit van het brein, gliale respons eigenschappen, en axon stabiliteit. In dit gevisualiseerd artikel tonen we een haalbare en betrouwbare methode voor in vivo oog enucleatie in de muis.Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie van onderzoek van de KU Leuven en werden in strikte overeenstemming met de Europese Gemeenschappen Richtlijn van de Raad van 22 september 2010 (2010/63 / EU) en de Belgische wetgeving (KB van 29 mei 2013). Alles in het werk werd gesteld om het lijden van dieren zoveel mogelijk te beperken en om het aantal dieren te verminderen.
1 Animal Treatment en anesthetica
- Verdoven van de muis met een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine hydrochloride (75 mg / ml) en medetomidine hydrochloride (1 mg / kg) in zoutoplossing.
- Controleer de reflexen door te knijpen de tenen met een tang om te verzekeren van de muis is volledig verdoofd.
- Van toepassing 70% ethanol aan de oogleden en het gebied rondom de ogen met behulp van een wattenstaafje te desinfecteren. Controleer het ooglid reflex om de mate van sedatie extra beoordelen.
2 Het verwijderen van de ogen
- Zorg ervoor dat het dier zich op een vlakke, droge englad oppervlak.
- Steriliseren een pincet met een gebogen, gekartelde tip (voorkeur tip grootte: 0,5 x 0,4 mm).
- Druk voorzichtig op de ooghoek (hoek van het oog) met de tang totdat de oogbol wordt verplaatst uit het stopcontact en de oogzenuw is bereikbaar.
- Leid de tang achter het oog. Houd de oogzenuw stevig, bij voorkeur met het begin van de curve en niet het uiterste puntje van de tang. Dit zal helpen om de wereld uit het stopcontact op te heffen en om de complete optische zenuw klem.
- Maak cirkelvormige bewegingen met de hand die de forceps in de richting met de minste weerstand terwijl de muis blijft op het vlakke oppervlak. De muis weer beweegt langs het oppervlak volgens de richting van de beweging.
- Voer deze actie met geleidelijk toenemende snelheid tot de oogzenuw wordt ingesnoerd in twee (meestal tussen 7 tot 15 rondgaande bewegingen, ongeveer een halve tot een volledige omwenteling per seconde). Vandaar dat de vrijstaande oogbolverwijderd.
3 Post-operatieve Zorg
- In het geval van een bloeding (zeldzaam), vul de baan met een stroperige stollen en hemostatische middel.
- Reverse anesthesie door injectie 1 mg / kg atipamezol hydrochloride in zoutoplossing intraperitoneaal.
- Dien 1 mg / kg intraperitoneaal Meloxicam elke 24 uur om pijn te verlichten.
- Breng oogzalf de resterende oog om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
- Laat het dier terug op een verwarmingsplaat of wikkel het dier isolatiemateriaal in een aparte kooi lichaamstemperatuur regelen.
- Meet het gewicht van de muis elke dag gedurende ten minste 2 dagen. Gewichtsverlies kan lijden aangeven en in dit geval verder Meloxicam behandeling tot het dier volledig is hersteld.
Representative Results
Figuur 1 illustreert de succesvolle verwijdering van het oog met de beschreven protocol en wordt gekenmerkt door de afwezigheid van bloeden of enige zichtbare schade aan de orbitale weefsel of oogkas (Figuren 1A, 1B). Bovendien, de verwijderde oog heeft een gladde cornea, choroidea en optische schijf, indicatief voor een volledig intact bol (figuur 1C). Aangezien ons protocol omvat het klemmen van de oogzenuw achter het oog en mechanische draaien, de optische zenuw van het oog verwijderd is vernauwd bij de basis van de retina (Figuur 1D). Het uitvoeren van de procedure resulteert in een schone snede oogzenuw zonder enige schade aan het omliggende hersengebied (figuur 1E).
Monoculaire enucleatie, in combinatie met de activiteit in kaart brengen (figuur 2), maakt het mogelijk om scherp af te bakenen van de functionele of eye specifieke inbreng regio's in de contralaterale Visual cortex van de muis 12,27 of zelfs oculaire dominantie kolommen in een hogere orde zoogdieren als apen 28.
In experimenten met muizen, de verwijdering van een (ME) of beide ogen (BE) gecombineerd met gerichte visuele stimulatie en detectie van Zif268 mRNA of c-Fos-eiwit expressieniveaus werd op regionale neuronale activatie blootleggen van de visuele cortex 12,27 . In tegenstelling visueel gestimuleerde controles (Figuur 2A), BE muizen vertoonden basale activiteit in de visuele cortex door gebrek aan visuele input (figuur 2B) te voltooien. Als zodanig werden de grenzen tussen beeldende met niet-visuele cortex (dwz. Somatosensorische cortex bij meer anterieure secties en auditieve cortex in meer posterieure delen) blootgelegd. Resultaten van ME muizen met een week overlevingstijd gevisualiseerd het oog specifieke invoer gebieden in de contralaterale visuele cortex. De twee monoculair gedreven regio waren hypoactive en gelegen medial en lateraal van de centrale binoculaire zone (figuur 2C).
Figuur 1 kwalitatieve evaluatie van de post-enucleatie toestand van de oogkas, de ogen verwijderd en de oogzenuw. Na verwijdering van het oog met een gebogen pincet (A) geen bloeden of schade wordt waargenomen in de oogkas (B). Het verwijderde oog volledig intact blijkt uit een normaal uiterlijk van de cornea en vaatvlies (C, D). De oogzenuw ingesnoerd op de optische schijf, waar hij het oog (D) verlaat. Onderzoek van het ventrale deel van de hersenen onthult een schone snede oogzenuw (asterisk) en geen zichtbare schade aan andere structuren (E). Schaalbalken in C, D: 1 mm. Schaalbalk in E: 5 mm. A: anterior; L: links; P: het achterste; R: rechts.
Figuur 2 Functionele eye-ingang gegeven deelsectoren in de muis visuele cortex zoals blijkt uit enucleatie. Zwarte en grijze lijnen die de ogen en de cortex verbinden vertegenwoordigen de oversteek van retinale afferentia en het oog specifieke inbreng regio's. Neurale Activiteit gevisualiseerd op coronale secties van de controle (A), BE (B) en ME (C) muizen door radioactieve in situ hybridisatie (ISH) voor zif268 (grijstinten) rond Bregma niveau -3,40 mm. In controledieren (A), de visuele cortex in beide hemisferen expressie hoogactieve volgende visuele stimulatie. Wanneer een of beide ogen (s) worden uitgeroeid, een duidelijke afname van de activiteit signaal is zichtbaar in de overeenkomstige ontnomen corticale gebieden. Monoculair enucleated (C) muizen vertonen een zone van hoge activiteit in het binoculaire gebied van de visuele cortex omgeven door een afgenomen signaal in de monoculaire zones contralateraal van de verwijderde oog. Schaal bar: 2 mm. Overgenomen met toestemming van Van Brussel et al 12.
Discussion
Om een succesvolle enucleatie voeren volgens onze werkwijze, de meest kritische stappen te overwegen zijn: 1) met een tang met een gebogen en gekartelde uiteinde van de juiste grootte; 2) het uitvoeren van de enucleatie op een glad en droog oppervlak; en 3) geleidelijk versnellen van de cirkelvormige bewegingen in de richting met de minste wrijving.
Voor een effectief resultaat is het essentieel om een geschikte forceps gekenmerkt door een gebogen en gekartelde punt gebruiken (tip Gewenst: muis: 0.5 x 0.4 mm, rat: 2.15 x 1.3 mm). De kromming maakt een eenvoudige toegang tot de oogzenuw na eyeball verplaatsing en is nodig voor een juiste plaatsing van de hand bij het uitvoeren van de cirkelvormige beweging. Gladde tips worden niet aanbevolen, omdat zij niet over de nodige grip bij het vasthouden van de oogzenuw. Als de oogzenuw goed houden tijdens het cirkelvormige bewegingen resulteert in breuk van de oftalmische arterie, slecht loslaten van het oog en dus slechte reproduceerbaarheid.Daarom wordt aanbevolen om eerst praktijk deze techniek op euthanized dieren voor optimalisering van de forceps hanteren om maximale dierenwelzijn garanderen zodra toepassing van de werkwijze in vivo. Succesvolle eye enucleatie is onlangs ook uitgevoerd in de rat in ons laboratorium met behulp van dezelfde techniek, behalve voor het handmatig draaien van de dierlijke lichaam en houden van de forceps stilstaat.
Een beperking van de techniek is dat het mogelijk de retina beschadigen. Daarom is deze methode minder geschikt voor het verzamelen netvlies histologie 5 uitgevoerd. Bovendien is onze werkwijze beperkt tot opening eye leeftijden onderbrengen omdat de oogbol moet worden verplaatst uit het stopcontact zonder het verwijderen of afsnijden van de oogleden.
Eye enucleatie in verschillende soorten, waaronder knaagdieren, wordt routinematig uitgevoerd met behulp van alternatieve werkwijzen, die vaak leiden tot de verwijdering van de oogleden en snijden van de oogzenuw 18,23-25. Deze methods de neiging om meer invasieve te zijn en hebben een hogere leercurve dan de hier beschreven techniek. Zonder de noodzaak voor het verwijderen van of het hechten van de oogleden, is het na de operatie hersteltijd tot een minimum beperkt, wat resulteert in een beter welzijn van dieren en meer reproduceerbare resultaten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride (Anesketin) | Dechra Veterinary Products (Eurovet) | BE-V136516 | |
| Medetomidine hydrochloride (Domitor) | Orion Corporation (Janssen Animal Health) | BE-V151742 | |
| Atipamezol hydrochloride (Antisedan) | Orion Corporation (Elanco Animal Health) | BE-V153352 | |
| Antibiotics (cefazolin, Kefzol) | Eurocept Pharmaceuticals | BE 106267 | |
| Eye ointment (Fucithalmic) | Leo Pharma nv-sa | BE 144654 | |
| Moria MC31 Forceps - Serrated Curved | Fine Science Tools | 11370-31 | For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
| Narrow Pattern Forceps - curved | Fine Science Tools | 11003-13 | For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
| Hemostatic cotton wool | Qualiphar | N/A | Other hemostatic agents are equally suitable (e.g., Viscostat, #649, Ultradent Products) |
References
- Toldi, J., Fehér, O., Wolff, J. R. Neuronal plasticity induced by neonatal monocular (and binocular) enucleation. Progress in Neurobiology. 48 (3), 191-218 (1996).
- Steeves, J. K. E., González, E. G., Steinbach, M. J. Vision with one eye: a review of visual function following unilateral enucleation. Spatial vision. 21 (6), 509-529 (2008).
- Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. Evidence for cross-modal plasticity in adult mouse visual cortex following monocular enucleation. Cerebral Cortex. 21 (9), 2133-2146 (2011).
- Nys, J., Aerts, J., Ytebrouck, E., Vreysen, S., Laeremans, A., Arckens, L. The cross-modal aspect of mouse visual cortex plasticity induced by monocular enucleation is age-dependent. Journal of Comparative Neurology. 522 (4), 950-970 (2014).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e57 (2011).
- Morales, B., Choi, S. -Y., Kirkwood, A. Dark rearing alters the development of GABAergic transmission in visual cortex. Journal of Neuroscience. 22 (18), 8084-8090 (2002).
- Chen, X. J., Rasch, M. J., Chen, G., Ye, C. Q., Wu, S., Zhang, X. H. Binocular input coincidence mediates critical period plasticity in the mouse primary visual cortex. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2940-2955 (2014).
- Konur, S., Yuste, R. Developmental regulation of spine and filopodial motility in primary visual cortex: Reduced effects of activity and sensory deprivation. Journal of Neurobiology. 59 (2), 236-246 (2004).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: A comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
- Galindo-Romero, C., et al. Axotomy-induced retinal ganglion cell death in adult mice: Quantitative and topographic time course analyses. Experimental Eye Research. 92 (5), 377-387 (2011).
- Kanold, P. O., Kim, Y. A., GrandPre, T., Shatz, C. J. Co-regulation of ocular dominance plasticity and NMDA receptor subunit expression in glutamic acid decarboxylase-65 knock-out mice. The Journal of Physiology. 587 (12), 2857-2867 (2009).
- Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. Identification and localization of functional subdivisions in the visual cortex of the adult mouse. Journal of Comparative Neurology. 514 (1), 107-116 (2009).
- Avwenagha, O., Bird, M. M., Lieberman, A. R., Yan, Q., Campbell, G. Patterns of expression of brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase B mRNAs and distribution and ultrastructural localization of their proteins in the visual pathway of the adult rat. Neuroscience. 140 (3), 913-928 (2006).
- Hernandes, M. S., Britto, L. R. G., Real, C. C., Martins, D. O., Lopes, L. R. Reactive oxygen species and the structural remodeling of the visual system after ocular enucleation. Neuroscience. 170 (4), 1249-1260 (2010).
- Cuyvers, A., Paulussen, M., Smolders, K., Hu, T. -T., Arckens, L. Local cell proliferation upon enucleation in direct retinal brain targets in the visual system of the adult mouse. Journal of Experimental Neuroscience. 4, 1-15 (2010).
- Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. Experience-dependent binocular competition in the visual cortex begins at eye opening. Nature Neuroscience. 10 (3), 370-375 (2007).
- Toldi, J., Farkas, T., Völgyi, B. Neonatal enucleation induces cross-modal changes in the barrel cortex of rat. A behavioural and electrophysiological study. Neuroscience Letters. 167 (1-2), 1-4 (1994).
- Newton, J. R., Sikes, R. W., Skavenski, A. A. Cross-modal plasticity after monocular enucleation of the adult rabbit. Experimental Brain Research. 144 (4), 423-429 (2002).
- Lalonde, J., Chaudhuri, A. Dynamic changes in CREB phosphorylation and neuroadaptive gene expression in area V1 of adult monkeys after monocular enucleation. Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (1), 24-37 (2007).
- You, Y., Gupta, V. K., Graham, S. L., Klistorner, A. Anterograde degeneration along the visual pathway after optic nerve injury. PLoS ONE. 7 (12), e52061 (2012).
- Kelly, K. R., McKetton, L., Schneider, K. A., Gallie, B. L., Steeves, J. K. E. Altered anterior visual system development following early monocular enucleation. NeuroImage: Clinical. 4, 72-81 (2014).
- Chow, A. M., Zhou, I. Y., Fan, S. J., Chan, K. W. Y., Chan, K. C., Wu, E. X. Metabolic changes in visual cortex of neonatal monocular enucleated rat: a proton magnetic resonance spectroscopy study. International Journal of Developmental Neuroscience. 29 (1), 25-30 (2011).
- Dyer, R. S., Hammond, M. Effects of enucleation in retinal degenerate mice. Physiology & behavior. 14 (2), 207-210 (1975).
- Smith, S. A., Bedi, K. S. Unilateral eye enucleation in adult rats causes neuronal loss in the contralateral superior colliculus. Journal of Anatomy. 190 (4), 481-490 (1997).
- Gonzalez, D., et al. Effects of monocular enucleation on calbindin-D 28k and c-Fos expression in the lateral geniculate nucleus in rats. Okajimas folia anatomica Japonica. 82 (1), 9-18 (2005).
- Faguet, J., Maranhao, B., Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. Ipsilateral eye cortical maps are uniquely sensitive to binocular plasticity. Journal of Neurophysiology. 101 (2), 855-861 (2008).
- Van der Gucht, E., Hof, P. R., Van Brussel, L., Burnat, K., Arckens, L. Neurofilament protein and neuronal activity markers define regional architectonic parcellation in the mouse visual cortex. Cerebral Cortex. 17 (12), 2805-2819 (2007).
- Chaudhuri, A., Matsubara, J. A., Cynader, M. S. Neuronal activity in primate visual cortex assessed by immunostaining for the transcription factor Zif268. Visual Neuroscience. 12 (1), 35-50 (1995).
