Summary
Aqui nós descrevemos um protocolo que os casais duas técnicas proteômicas, ou seja, 2-dimensional Eletroforese (2DE) e Espectrometria de Massa (MS), para identificar diferencialmente expressos / proteínas pós-traducionais modificados entre dois ou mais grupos de amostras primárias. Esta abordagem, em conjunto com ensaios funcionais, permite a identificação e caracterização de marcadores / alvos terapêuticos prognósticos.
Abstract
A identificação de moléculas envolvidas na iniciação e progressão tumoral é fundamental para a biologia da doença compreensão e, como conseqüência, para o manejo clínico dos pacientes. No presente trabalho, vamos descrever uma abordagem proteómica optimizado para a identificação de moléculas envolvidas na progressão da leucemia linfocítica crónica (CLL). Em detalhe, os lisados de células leucémicas são resolvidos por 2-dimensional Electrophoresis (2DE) e visualizada como "manchas" nos géis 2DE. A análise comparativa de mapas de proteómica permite a identificação de proteínas diferencialmente expressas (em termos de abundância e modificações pós-tradução), que são escolhidos, isolados e identificados por espectrometria de massa (MS). A função biológica dos candidatos identificados podem ser testados por ensaios diferentes (isto é, migração, adesão e polimerização de F-actina), que optimizaram para células leucémicas primárias.
Introduction
Leucemia Linfocítica Crônica (LLC), a leucemia em adultos mais comum nos países ocidentais, deriva do acúmulo de linfócitos CD5 + B neoplásicas monoclonais e é clinicamente muito heterogêneo. Pode estar presente como uma forma de pré-leucémicas, definido como linfoma de células B monoclonais (MBL) 1,2,3. Em outros casos, a doença pode aparecer com um curso clínico indolente, que pode permanecer estável durante anos antes de precisar de tratamento, ou como uma doença chemorefractory progressiva com prognóstico sombrio, apesar da terapêutica. Finalmente, pode evoluir para um linfoma de alto grau freqüentemente letal (Síndrome de Richter-RS) 2,3,4. Os pacientes são geralmente classificados em dois subgrupos principais: bom e mau prognóstico, com base em um conjunto de fatores prognósticos que fornece informações complementares sobre preditores de prognóstico da doença e sobrevivência. A heterogeneidade clínica provavelmente reflete a heterogeneidade biológica. Um número de genética, microambiental e cellular factores têm sido mostrados para concorrer para a patogênese da doença, embora não há mecanismos unificadores foram encontrados 5. Em detalhe, vários estudos têm demonstrado que as diferenças no curso clínico da doença pode ser parcialmente explicado pela presença (ou ausência) de alguns marcadores biológicos que têm um valor 6,7,8 prognóstico. Estes dados demonstram que uma melhor compreensão da biologia da doença poderia fornecer dicas adicionais para o manejo clínico da patologia, através da identificação de ambos os marcadores prognósticos e alvos terapêuticos.
O objetivo do presente trabalho é mostrar como a combinação de diferentes técnicas proteômicas pode ser utilizado para a identificação de proteínas envolvidas no aparecimento e progressão CLL. Nossa abordagem demonstra que é possível juntar proteômica juntos básica e dados clínicos 5.
No presente do fluxo de trabalho, as células leucêmicas primários de pacientes selecionados(Bom contra o mau prognóstico) são isoladas e lisados celulares são usados para obter mapas de proteômica. 2DE permite caracterizar o perfil de proteómica de uma população de células, incluindo modificações pós-tradução, assim dando informações indirectas sobre a actividade biológica de cada proteína. Os lisados celulares totais são resolvidos por uma primeira dimensão de execução com base no ponto isoeléctrico, seguido por uma segunda dimensão corridos num gel de poliacrilamida que resolve as proteínas com base no seu peso molecular. A análise comparativa de mapas de proteómica permite a identificação de proteínas diferencialmente expressas (tanto em termos de abundância e modificações pós-tradução), como pontos do gel que podem ser cortados e analisados por Espectrometria de Massa. O papel de cada candidato pode ser explorado em seguida, por diferentes ensaios.
Esta abordagem, restrito a CLL no manuscrito atual, pode ser facilmente expandido para outras doenças / amostras, fornecendo assim informações sobre o proteomic / diferenças biológicas entre dois grupos (ie patológicas vs normais, estimuladas vs não estimulada, do tipo selvagem vs knockdown).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todas as amostras de tecido foram obtidos com a aprovação do conselho de revisão institucional do Hospital San Raffaele (Milão, Itália).
1. amostras de tecidos humanos e purificação celular (Figura 1)
NOTA: linfócitos leucêmicas foram obtidas a partir do sangue periférico (PB) de pacientes com LLC, diagnosticados de acordo com Mulligan et al, 9.
1.1) A separação de células leucêmicas da PB
- Colete PB em vacutainer tubos de coleta de sangue com heparina sódica.
- Transferir o sangue para um tubo de 15 ml e adicionar enriquecimento cocktail de células B humanas em 50 ul / ml de sangue total. Misturar bem e incubar 20 min a temperatura ambiente.
- Diluir a amostra com um volume igual de PBS + 2% FBS, misturar sangue suavemente e cuidadosamente através da sobreposição de Ficoll, tomando cuidado para não romper a interface. Utilizar pelo menos 1 parte de Ficoll a 2 partes da amostra diluída (ou seja, 4 mL de Ficoll + 10 ml de sangue em 15 ml de tube).
- Centrifugar a 400 xg, à temperatura ambiente (20 ° C) durante 20 minutos sem travão. As células mononucleares será na interface.
- Aspirar cuidadosamente a interface para recuperar as células e colocar em um novo tubo. Lave as células uma vez com PBS e centrifugar a 300 xg, a 4 ° C no escuro durante 5 min. O sedimento será na parte inferior.
- Descartar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento no sobrenadante restante sacudindo o tubo e para trás com os dedos. Diluir o sedimento com 10 ml de meio RPMI completo (RPMI 1640 suplementado com 10% de Soro Fetal de Vitela e 15 mg / ml de gentamicina), e contar as células utilizando o método de exclusão de azul de tripano.
1.2) Avaliação Pureza
NOTA: A pureza de todas as preparações deve ser sempre superior a 99%.
- Incubar 100 ul de suspensão de células purificadas com os seguintes anticorpos (disponível comercialmente, ver Tabela de Materiais): CD3 FITC (5 ul / test), CD14 PE (5 ul / teste), CD19 ECD (6 mL / teste), CD16-CD56 PC5 (2 ^ l / teste), CD5 PC7 (4 ul / ensaio), durante 20 min a 4 ° C numa tubo de FACS.
- Lava-se a amostra com 4 ml de PBS (centrifuga-se durante 5 minutos a 300 xg) e verificar a pureza por fluxo cytometry.Check na trama a% de células CLL (> 99%) que co-expresso CD19 e CD5, enquanto na sua superfície mostrado na Figura 1 (6). Certifique-se de que os preparativos são praticamente desprovidos de NK, linfócitos T e monócitos, verificando o% de CD3, CD14 e CD16-56 na trama, que deve ser perto de zero.
1.3) As amostras de armazenamento
- Para os estudos de proteómica, recolher 25 x 10 6 células em um tubo de 1,5 ml, as células de centrifugação a 300 xg durante 10 minutos, rejeitar o sobrenadante e de peletes de liofilizar durante 4 horas. Manter a -80 ° C até à sua utilização.
- Para os ensaios de validação, ressuspender as células em meio RPMI completo (quantidade depende do ensaio que é maisescolhido) e prossiga com a Etapa 4.
2. electroforese bidimensional (2-DE) (Figura 2)
2.1) Isoelectrofocusing (IEF)
- Solubiliza-se as células CLL pelotas com um volume final de 380 ul de tampão de 2-DE (344 ul de uma solução RBthio (9 M ureia, 10 mM Tris, 4% CHAPS), 30 ul de 65 mM de DTT, 6 ul de 2% de tampão de IPG anfolina pH 4-7).
- Aplicar amostras de proteína (1 mg) a 18 tiras de IPG (pH 4-7) e realizar IEF seguindo o protocolo padrão descrito por Conti et al. 10
- Equilibrar as tiras em 2 ml de Tampão de Equilíbrio (EB: 50 mM de tampão pH 8,8 de Tris-HCl, contendo 6 M de ureia, 30% glicerol, 2% SDS), suplementado com 2% de fresco de DTT, durante 15 minutos à RT. Descartar EB + DTT e adicionar 2 ml de EB suplementado com 2,5% Iodoacetamida. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente numa plataforma oscilante.
2.2) de SDS-PAGE
- Secam-se as tiras em um papel, sem tocar no gel para removero excesso de EB. Carregar cada tira na parte superior de um gradiente de gel de SDS-PAGE a 9-16%. Adicionar uma pequena quantidade de SDS-electroforese tampão (Tris 25 mM, Glicina 192 mM, SDS a 0,1% w / v) na parte superior do gel para facilitar a carga da fita.
- Fecha-se o gel por adição de ~ 5 ml de solução de ágar (0,8%) para evitar que a tira de flutuação, em seguida, montar a unidade de electroforese e encher com tampão SDS-electroforese. Realizar a corrida no 60 mA / gel durante 4 horas a 4 ° C.
- Remover o gel a partir da unidade de electroforese e colocá-lo na caixa de coloração adequada.
2.3) coloração de prata para preparativa Gel
| FIXER | 50% de metanol de 12% de Ácido Acético 0,05% de formalina | 2 horas (ou durante a noite) * |
| TAMPÃO DE LAVAGEM | 35% Ehanol | 20 min (repita o passo três vezes) |
| SENSIBILIZAÇÃO | 0,02% de tiossulfato de sódio | 2 min |
| WASH | H2O | 5 min (repita o passo três vezes) |
| NITRATO DE PRATA | 0,2% de nitrato de prata 0,076% de formalina | 20 min |
| WASH | H2O | 1 min (repita o passo duas vezes) |
| COLABORADOR | 6% Carbonato de sódio 0,0004% de tiossulfato de sódio 0,05% de formalina | Até a coloração é suficiente |
| Pare | 50% Metanol | 30 min |
| * 2 horas é o tempo mínimo necessário para a fixação de proteínas |
Tabela 1.
NOTA: spots de proteínas podem ser visualizados através da coloração géis com MS mancha prata compatível 11. Todas as soluções necessáriaspara a coloração de prata estão listadas na Tabela 1.
- Prepare a cerca de 200 ml de cada solução / gel e proceder como indicado na Tabela 1. Adiciona-se cuidadosamente cada solução para a caixa de coloração contendo o gel. Realize todas as incubações em uma plataforma de balanço.
- Após a coloração, remover a solução de paragem e deixar o gel numa solução de 1% de ácido acético até a aquisição.
2.4) Gel Aquisição e Análise
- Aquisição de imagens com elevada resolução utilizando um densitómetro no prazo de 3 dias a partir da coloração.
- Analisar padrões de proteínas 2-D, utilizando software para géis 2-DE.
NOTA: O software permite uma comparação rápida e confiável de imagem.- Criar um projeto escolhendo "criar um novo projeto" a partir do menu contextual. Crie uma pasta e importar os géis escolhendo "imagens de gel de importação" com tif, png. ou .gel extensão.
- Uma vez que os geles são importadas e adicionou-se o Espaço de Trabalhoás, realizar uma detecção de ponto automatizado, selecionando os géis para detecção de ponto e escolher "Editar> local> detectar" no menu.
- Em seguida, executar uma subtração de fundo, selecionando no menu "fundo de subtração". Nota: Depois disso, é possível comparar vários géis e para detectar diferenças ou semelhanças de análise quantitativa e / ou qualitativa.
3 Identificação de proteínas por MALDI-TOF MS de análise (Figura 3)
3.1) A digestão de proteínas
- Lavar o gel com água e impostos especiais de consumo pontos de interesse de géis ou pelo manual (corte com um bisturi limpo) ou por excisão automatizado.
- Lave partículas de gel com água (100-150 mL), spin down (30 segundos a 400 xg) e remover o líquido.
- Adicionar um volume igual (dependendo do volume de gel) de CH 3 CN para os pedaços de gel e esperar por 10-15 min, até os pedaços de gel de encolher. Secam-se as partículas de gel ina centrífuga de vácuo.
- Adicionar 75-100 ul de 10 mM Ditioeritritol diluído em 50 mM NH 4 HCO 3 e incubar durante 30 min a 56 ° C (Redução Passo). Diminuir novamente os pedaços de gel com CH 3 CN como se descreveu na etapa 3.1.3.
- Continuar com a alquilação por adição de 75-100 ul de uma solução 55 mM de iodoacetamida diluído em 50 mM NH 4 HCO 3 e incubar durante 20 min à temperatura ambiente no escuro.
- Diminuir os pedaços do gel, uma vez mais com CH 3 CN utilizando um volume suficiente para cobrir os pedaços do gel, tal como descrito no passo 3.1.3. Seco numa centrífuga de vácuo.
- Re-hidratar as partículas em um tampão contendo 25 mM de NH 4 HCO 3, 5 mM de CaCl2, e 12,5 ng / mL de tripsina a 4 ° C durante 20 min. Use um volume suficiente de tampão para cobrir os pedaços de gel. Retirar o sobrenadante absorvido-un dos pedaços de gel e adicionar 25 mM NH 4 HCO 3, 5 mM de CaCl2, sem tripsina para cover o gel.
- Deixar as amostras a 37 ° C, pelo menos, 3 horas (o tempo mínimo necessário para a digestão de péptidos) a durante a noite.
3.2) Análise Espectrometria de Massa (técnica de gota seco)
- Ponto 1 ul alíquota de cada amostra para uma placa de aço inoxidável de MALDI e misturar com 1 ml de ácido como matriz α-ciano-4-hidroxicinâmico, preparadas em 50% CH3CN e 0,1% TFA.
- Obter espectros de massa em um espectrômetro de massa MALDI-TOF. Acumulam-se cerca de 200 espectros por local, o ajuste da intensidade do laser para evitar a saturação do sinal ou para aumentar o sinal. Espectros do processo através de software Data Explorer, conforme descrito abaixo:
- Importe o arquivo dat e realizar a correção de linha de base, escolhendo "processo> correção de linha de base". Calibrar massas que utilizam os produtos tripsina autólise e picos de matriz escolhendo "processo> calibração massa> calibragem manual; selecionar picos perto de m / z 855,1 e 2.163,1 by esquerda arrastando e selecionar as massas de referência correspondente, em seguida, clique em "conspiração" e "aplicará a calibragem" na janela de calibração manual.
- Ajuste o limiar para detecção de pico ("peak> pico de detecção"), duplicar o rastreamento ativo ("display> duplicar rastreamento ativo"), selecione o novo rastreamento e realizar o deisotoping ("pico> deisotoping"). Usando a macro "getpeaklist", gerar uma lista de massas para ser utilizado para a identificação. Se necessário, remover manualmente os sinais de ruído escolhida como picos de limpar a lista e obter uma melhor identificação.
- Identificar as proteínas por pesquisar um banco de dados abrangente de proteínas não redundante usando profunda e mascote como motores de busca 12.
- Utilize os seguintes parâmetros em todas as pesquisas: um perdeu a clivagem por peptídeo, oxidação da metionina como modificação variável, carbamidomethylation cisteína como modificação fixa e uma inititolerância massa al de 50 ppm.
4. Citoesqueletal Actividade ensaios (Figura 4)
NOTA: Suspenda as células purificadas no Passo 1 em meio RPMI completo (10 6 células / 200 uL).
4.1) Ensaio de migração. Este ensaio permite a quantificação da capacidade migratória das células analisadas (linfócitos). Use uma câmara transwell de 6,5 mm de diâmetro e 5,0 uM de tamanho de poro e realizar o ensaio em triplicado. Optimizar tamanho de poro e do tempo de migração (Passo 4.1.3) no caso de diferentes tipos de células.
- Prepare a câmara inferior através da adição de 600 ul de meio RPMI completo, com ou sem os estímulos específicos (isto é, SDF-1) para medir a ea migração espontânea induzida respectivamente.
- Coloque a câmara superior sobre ele e deixe o sistema equilibrar durante 30 minutos a 37 ° C na incubadora.
- Semente 10 6 células / 200 mL no cenáculo (número total de células) e incubara placa durante 4 horas a 37 ° C na incubadora.
- Retire a câmara superior, recolher os media na câmara baixa e lavar a câmara baixa uma vez com 1 ml de PBS. Recolhe-se o PBS no tubo.
- Centrifugar 5 minutos a 300 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender em 500 ul de PBS.
- Por citometria de fluxo, contar o número de células migradas após 1 min de aquisição. No caso de uma população de células isoladas, não é necessário adicionar qualquer anticorpo superfície. Verificar o número de células em um gráfico de pontos bidimensional considerando as dispersa laterais das células e o número de eventos visualizadas em 1 min, que é o número a ser usado para o cálculo.
- Calcular o Índice de Migrações (MI) como:
4.2) Ensaio de Adesão. Este ensaio permite medir a capacidade de adesão das células. Realize o ensaio em triplicado.
- Pré-coat de 96 wells placa (de fundo plano) com 50 uL / poço tanto de 2% BSA-PBS (como base) ou 1 ug de ICAM-1 diluída em PBS, durante a noite a 4 ° C.
- Lavar a placa duas vezes com PBS e bloquear os sítios não específicos por adição de 2% de BSA-PBS (100 ul / poço) durante 1 hora a 37 ° C.
- No entretanto, as células ressuspender em 5 x 10 6 / ml em meio RPMI completo, identificá-los com um rastreador célula mM CMFDA-verde e incubar 30 min a 37 ° C.
- Adicionar 1 x 10 6 células / poço aos poços pré-revestidos depois de descartar a solução de bloqueio (passo 4.2.2) e incubar 1 h a 37 ° C.
- Quantificar a aderência usando um leitor de ELISA (filtro de excitação: 485 nm, filtro de emissão: 535 nm). Realizar uma primeira medição do total de entrada (INPUT).
- Lava-se a placa suavemente com 2% de BSA-PBS (200 ul / poço) 4 vezes (x). Efectuar a leitura da placa, após cada etapa de lavagem (Adesão x).
- Depois de subtração de fundo para cada medição, calcule Adhes específicosião (adesão):
4.3) Ensaio de polimerização. Este é um ensaio colorimétrico que quantifica a polimerização de F-actina. Realize o ensaio em triplicado.
- Ressuspender 1x10 ^ 6 células em 100 ml de pré-aquecido RPMI completo e adicionar o estímulo específico (ou seja, α-IgM 20 ng / ml) por 10 min.
- Parar a reacção com 400 uL de paraformaldeído a 4% e as células fixar durante 10 min à temperatura ambiente.
- Lavar 3 vezes com PBS (centrifugar a 300 xg durante 5 min, 4 ° C).
- Descartar o sobrenadante e as células permeabilizar com PBS-saponina 0,2% (200 ul) em gelo durante 2 min.
- Lavar 3 vezes com PBS-saponina 0,1% (centrifugar a 100 xg durante 5 min, 4 ° C), descartar o sobrenadante e ressuspender em 100 ul de PBS-saponina 0,1%.
- Mancha com faloidina-AlexaFluor 488 (3 ug / ml) durante 30 min a sala temperatura no escuro.
- Lavar 3 vezes com PBS-saponina 0,1%. Descartar o sobrenadante e ressuspender em 300 ul de PBS.
- Quantificar a quantidade de actina F por citometria de fluxo, o cálculo da intensidade média de Florescence (IMF) da faloidina. Analisar os dados gerados em um único gráfico de dimensão, de modo a produzir um histograma com base na intensidade de fluorescência, o valor MFI é mostrado no gráfico de relatório.
- Medir a polimerização de actina F (Δ F-actina) como:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nós isolado células B leucêmicos primários formam PB de pacientes com LLC e analisamos mapas proteômica. As amostras (n = 104) foram agrupados em dois subconjuntos principais com base nas características clínicas de cada paciente (mau prognóstico vs bom prognóstico) e análise comparativa dos géis 2DE foi realizada.
A análise permitiu a identificação de pontos diferencialmente expressos entre os dois subconjuntos (em termos de presença / ausência ou mudança no gel, o que implica alterações na modificações pós-traducionais, n ≈ 16). Nós excisada pontos seleccionados a partir dos géis de 2DE e depois de ter sido reduzido e alquilado, as proteínas foram digeridas com tripsina e os péptidos do sobrenadante resultante foram manchados em uma placa de MALDI. Os espectros foram adquiridos em MALDI-TOF Voyager DE. A lista de pico resultante foi submetido a MASCOTE e profunda. Massas dentro de uma determinada tolerância de massa são atribuídos ao péptido sequências na base de dados, e, em seguida, montado em uma proteína, que é consideradoidentificado se passar uma certa probabilidade de pontuação (Figura 3). Por meio dessa análise, identificamos proteínas envolvidas principalmente na atividade do citoesqueleto e processos metabólicos (dados não publicados).
Entre eles, nós nos concentramos em hematopoiéticas de linhagem de célula-específico-protein-1 (HS1), cuja fosforilação diferencial fortemente associada com a evolução clínica da doença (Figura 4). Em particular, descobrimos que pacientes portadores de um único ponto (n = 44, hiper-fosforilada HS1) experimentar um resultado clínico ruim, enquanto os pacientes com 2 pontos (n = 60, hipo-fosforilada HS1) tem bom prognóstico 13 (Figura 4 ). A presença da proteína de HS1 nas manchas foi validada por immunoblotting o gel 2DE com um anticorpo monoclonal contra o HS1 13.
Uma vez que é sabido que HS1 está envolvida na remodelação do citoesqueleto 14, foram realizados ensaios in vitro para testar if o estado de fosforilação HS1 poderia afetar diferencialmente atividade do citoesqueleto em dois subconjuntos CLL (bons vs mau prognóstico). Descobrimos que as células que transportam CLL HS1 como uma mancha tem uma actividade do citoesqueleto prejudicada em termos de migração, adesão e a polimerização da actina, em comparação com as amostras hipo-HS1-fosforilada, explicando, assim, um comportamento clínico diferente 15 (Figura 5).
Figura 1:. Fluxo de trabalho de purificação de células leucémicas de sangue PB de doentes com CLL é transferida para um tubo de 15 ml (1), Humana enriquecimento de células B cocktail é adicionado à amostra (2) e incubou-se durante 20 minutos. O sangue é então diluída com PBS numa proporção de 1: 1 e colocada no topo do gradiente de densidade (3). Subsequente a centrifugação da amostra (4) permite a formação de múltiplos l Ayers: a) no plasma, b) os linfócitos B, c) de Ficoll, d) os glóbulos vermelhos e as células não desejadas. Linfócitos B purificado (b layer) são então recolhidos (5), lavado e pureza da preparação de células é analisada por citometria de fluxo (6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Fluxo de trabalho de 2DE O sedimento é solubilizado no tampão de 2DE (1) e colocado sobre a tira de IPG para a primeira execução de dimensão (2-isoelectrofocusing). Após o equilíbrio, a tira é colocado no topo de um gel de poliacrilamida de gradiente para a segunda execução de dimensão (3-SDS-PAGE). O gel é então corado para visualizar locais / proteínas (4). Após a aquisição de imagens de alta resolução, são analisados os mapas de proteômica (5). les / ftp_upload / 51942 / "target =" _blank 51942fig2highres.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fluxo de trabalho de análise MS (1) as manchas de interesse são excisadas do gel 2D com um bisturi e transferida para um tubo limpo.. (2) Depois de ser reduzida e alquilada, as proteínas são digeridas com tripsina, os péptidos do sobrenadante resultante são manchadas sobre uma placa de MALDI (3). Spectra são adquiridos em um MALDI-TOF Voyager DE. (4) A lista de pico resultante é submetido aos motores de busca e MASCOTE profunda e procurou contra um banco de dados de proteínas não redundante abrangente. (5) As massas dentro uma determinada tolerância de massa são atribuídos a sequências de péptido na base de dados, em seguida, montadas numa proteína. target = "_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: estado de fosforilação HS1 correlaciona com o prognóstico dos doentes com CLL (1) O círculo identifica duas manchas próximas com a mesma massa molecular (Mr) de 79 kDa e diferente ponto isoeléctrico (pi) de 4,83 e 4,86, respectivamente, o qual foi identificado por. MS como a proteína HS1 (2). (2) Dois géis representativos de um mau prognóstico (quadrado vermelho) e um pacientes com LLC bom prognóstico (quadrado verde). (3) as curvas de Kaplan-Meier mostram sobrevivência cumulativa de pacientes com LLC agrupadas de acordo com HS1 padrão de fosforilação (1 ponto, n = 44, vs 2 pontos, n = 60). Pacientes com 2 spot (pontos verdes) têm uma sobrevivência significativamente maior (média de sobrevivência não atingido) do que aqueles com apenas um (pontos vermelhos)."target =" /files/ftp_upload/51942/51942fig4highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: fosforilação HS1 funcionalidade influências do estado do citoesqueleto em amostras de CLL primárias (1) migração em transwell de amostras de partida, na presença ou ausência de SDF-1.. No gráfico são mostrados os meios de SEM do número de células em 1 minuto adquiridos no citómetro de fluxo (n = 7 de um local HS1 n = 12 vs 2 de mancha HS1). (2) adesão espontânea foi medida após a marcação de células e 1 h de incubação em placas de 96 poços. Indicadas são o meio para SEM amostras primárias (n = 7 de 1 ponto HS1 vs n = 12, de 2 ponto HS1). (3) a capacidade de polimerização F-actina das amostras primárias. Indicadas são o meio SEM do cont F-actina em relaçãoent de células após estimulação com CLL SDF-1 e da coloração com faloidina marcada com FITC (n = 5 de um local HS1 vs n = 5 de 2 mancha HS1). MFI: A média de intensidade da fluorescência. O histograma representam como exemplo de aquisição de amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O objectivo deste artigo é descrever um protocolo optimizado para a identificação de moléculas envolvidas na patogénese de CLL, mesmo que esta abordagem possa ser estendida a outras doenças e / ou outros tipos de amostras 16-18. Ao comparar os perfis de proteómica dois grupos de pacientes com LLC, boas vs mau prognóstico 19, demonstrou-se que eles diferem no estado de fosforilação de HS1 que a sua activação e afecta a capacidade de adesão e migração de células leucémicas.
No que diz respeito a outros métodos, a principal vantagem das técnicas de proteómica apresentados no manuscrito, gel 2DE e MS, é que eles proporcionam uma impressão digital completa do proteoma de células e, mais importante que dão informações sobre as modificações pós-traducionais das proteínas. As proteínas que são diferencialmente fosforilado ou glicosilado alterar a sua posição no gel, e provavelmente alterar a sua actividade nas células.
ove_content "> Além disso, descrevemos os protocolos para a avaliação da migração e da adesão das células que foram utilizadas para testar a funcionalidade do citoesqueleto, estes protocolos são ainda pouco descrito para as células que crescem em suspensão, uma vez que são geralmente aplicadas a células aderentes (por exemplo, a cicatrização de feridas ). A principal limitação da técnica 2DE e MS é a quantidade de células / proteínas (≈25 x 10 6 células por gel), ao passo que para os testes funcionais é a viabilidade das células. O verdadeiro desafio consiste em trabalhar em células primárias , mas, para muitas doenças não é possível atingir um número suficiente de células ou células vivas para realizar esses ensaios, neste caso, se estiverem disponíveis, é possível utilizar as linhas de células.A etapa mais importante para o protocolo MS consiste em trabalhar em (livres de queratina) condições de limpeza, de modo a evitar a contaminação e para se obter a identificação de proteínas claro. Os ensaios do citoesqueleto são normalmente difíceis de reproduzir (especialmente na primacélulas ry), assim, sugere-se a realização da experiência em triplicado.
Como já demonstrado, a combinação das abordagens apresentado neste trabalho auxilia na identificação de novas vias envolvidas em diversas doenças, fornecendo, assim, a descoberta de novos alvos terapêuticos, como aqui demonstrado para a proteína 19 de HS1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Agradecemos Malignancies Unidade linfóide, Elisa dez Hacken, Lydia Scarfo, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, e Angela Cattaneo.
Este projecto foi apoiado por: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant e Programa Especial Molecular Oncologia Clínica - 5 por mille # 9965)
CS e BA projetou o estudo, realizou os experimentos, analisaram os dados e escreveu o manuscrito. MTSB, UR, FBPR assistida por escrito o manuscrito. PG e FCC projetado amostras O estudo proporcionou dos pacientes e dados clínicos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
References
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).
- Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. Monoclonal B lymphocytosis in the general population. Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).
- Fazi, C., et al. General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL. Blood. 118, 6618-6625 (2011).
- Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in cancer biology. , (2013).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94, 1840-1847 (1999).
- Lanham, S., et al. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 101, 1087-1093 (2003).
- Wiestner, A., et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood. 101, 4944-4951 (2003).
- Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood. 113, 6496-6497 (2009).
- Conti, A., et al. Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers. J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).
- Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).
- Zhang, W., Chait, B. T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).
- Scielzo, C., et al. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).
- Muzio, M., et al. HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).
- Scielzo, C., et al. HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells. Blood. 116, 3537-3546 (2010).
- Kashuba, E., et al. Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen. J Proteomics. 91, 478-485 (2013).
- Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. The ongoing evolution of proteomics in malignancy. Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).
- Ummanni, R., et al. Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform. PLoS One. 6, (2011).
