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प्रोटीन समारोह के लिए एक 2DE जेल मौके से: क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया में HS1 से सीखा सबक

Published: October 19, 2014 doi: 10.3791/51942
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1, 1, 1,4, 1,4, 1
1Division of Molecular Oncology, IRCCS, San Raffaele Scientific Institute, 2Department of Haemato-Oncology, King's College London, 3IFOM, FIRC Institute of Molecular Oncology, 4Università Vita-Salute San Raffaele

Summary

यहाँ हम जोड़ों के दो प्रोटीयोमिक तकनीक, अर्थात् वैद्युतकणसंचलन (2DE) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) 2 आयामी, विभिन्न प्राथमिक नमूनों में से दो या अधिक समूहों के बीच / बाद translational संशोधित प्रोटीन व्यक्त की पहचान कर सकते हैं कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन. यह दृष्टिकोण, एक साथ कार्यात्मक प्रयोगों के साथ, शकुन मार्करों / चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान और लक्षण वर्णन की अनुमति देता है.

Abstract

ट्यूमर दीक्षा और प्रगति में शामिल अणुओं की पहचान रोगियों के नैदानिक ​​प्रबंधन के लिए, एक परिणाम के रूप में, समझ रोग के जीव विज्ञान के लिए मौलिक है और. वर्तमान काम में हम पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) की प्रगति में शामिल अणुओं की पहचान के लिए एक अनुकूलित प्रोटिओमिक दृष्टिकोण का वर्णन करेंगे. विस्तार में, लुकेमिक सेल lysates 2 आयामी वैद्युतकणसंचलन (2DE) द्वारा हल कर रहे हैं और 2DE जैल पर "स्पॉट 'के रूप में कल्पना की. प्रोटिओमिक नक्शे का तुलनात्मक विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा पृथक, उठाया और पहचान कर रहे हैं कि (बहुतायत और बाद translational संशोधनों के संदर्भ में) विभिन्न व्यक्त प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता. पहचान उम्मीदवारों की जैविक समारोह हम प्राथमिक leukemic कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया है कि, विभिन्न assays (यानी प्रवास, आसंजन और एफ actin polymerization) द्वारा परीक्षण किया जा सकता है.

Introduction

क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL), पश्चिमी देशों में सबसे आम वयस्क ल्यूकेमिया, मोनोक्लोनल नियोप्लास्टिक CD5 + बी लिम्फोसाइटों के संचय से निकला और नैदानिक ​​बहुत विषम है. यह मोनोक्लोनल बी सेल lymphocytosis (एमबीएल) 1,2,3 के रूप में परिभाषित एक पूर्व लयूकेमिक रूप है, के रूप में मौजूद हो सकता है. रोग या तो एक अकर्मण्य नैदानिक ​​पाठ्यक्रम के साथ दिखाई दे सकते हैं अन्य मामलों में, कि इलाज की जरूरत से पहले साल के लिए स्थिर रह सकता है, या निराशाजनक पूर्वानुमान के साथ एक प्रगतिशील chemorefractory बीमारी के रूप में चिकित्सा के बावजूद. अंत में, यह एक अक्सर घातक उच्च ग्रेड लिंफोमा (रिक्टर सिंड्रोम रु) 2,3,4 में प्रगति कर सकते हैं. अच्छा और बुरा रोग का निदान, रोग परिणाम और अस्तित्व के भविष्यवक्ताओं पर पूरक जानकारी प्रदान करता है कि शकुन कारकों में से एक सेट पर आधारित: मरीजों को आमतौर पर दो मुख्य कैंपेन्स में वर्गीकृत किया जाता है. क्लीनिकल विविधता संभावना जैविक विविधता को दर्शाता है. आनुवंशिक, microenvironmental और CE की संख्याllular कारकों कोई एकीकृत तंत्र 5 पाया गया है, हालांकि रोग रोगजनन के लिए सहमत करने के लिए दिखाया गया है. विस्तार में, कई अध्ययनों रोग के नैदानिक ​​पाठ्यक्रम में मतभेद आंशिक रूप से एक शकुन मूल्य 6,7,8 है कि कुछ जैविक मार्कर की उपस्थिति (या अनुपस्थिति) द्वारा समझाया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है. इन आंकड़ों रोग जीव विज्ञान की एक बेहतर समझ शकुन मार्करों और चिकित्सीय लक्ष्य दोनों की पहचान करके, विकृति विज्ञान के नैदानिक ​​प्रबंधन के लिए अतिरिक्त संकेत दे सकती है कि प्रदर्शन किया.

वर्तमान कागज के लक्ष्य अलग प्रोटीयोमिक तकनीकों का एक संयोजन CLL शुरुआत और प्रगति में शामिल प्रोटीन की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दिखाने के लिए है. हमारा दृष्टिकोण यह एक साथ बुनियादी प्रोटीयोमिक और नैदानिक ​​डेटा 5 में शामिल होने के लिए संभव है कि यह दर्शाता है.

चयनित रोगियों से वर्तमान कार्यप्रवाह में, प्राथमिक leukemic कोशिकाओं(बुरा रोग का निदान बनाम अच्छा) अलग कर रहे हैं और सेल lysates तो प्रोटीयोमिक नक्शे प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है. 2DE इस प्रकार प्रत्येक प्रोटीन की जैविक गतिविधि पर अप्रत्यक्ष जानकारी दे रही है, बाद translational संशोधनों सहित एक सेल आबादी के प्रोटीयोमिक प्रोफ़ाइल के लक्षण वर्णन अनुमति देता है. पूरे सेल lysates उनके आणविक वजन के आधार पर प्रोटीन को हल करने वाले एक polyacrylamide जेल पर चलने एक दूसरा आयाम है, जिसके बाद समविद्युतविभव बात पर आधारित एक प्रथम आयाम रन से हल कर रहे हैं. प्रोटिओमिक नक्शे का तुलनात्मक विश्लेषण विभिन्न व्यक्त प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता है (दोनों बहुतायत और बाद translational संशोधनों के संदर्भ में) में कटौती और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है कि जेल पर धब्बे के रूप में. प्रत्येक उम्मीदवार की भूमिका तो अलग assays के द्वारा शोषण किया जा सकता है.

वर्तमान पांडुलिपि में CLL के लिए प्रतिबंधित यह दृष्टिकोण, आसानी से इस प्रकार proteomi के बारे में जानकारी प्रदान करने, अन्य बीमारियों / नमूने के लिए विस्तारित किया जा सकता है(पछाड़ना बनाम unstimulated, जंगली प्रकार बनाम प्रेरित सामान्य बनाम वैकृत यानी,) दो समूहों के बीच सी / जैविक मतभेद.

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Protocol

नोट: सभी ऊतकों के नमूनों सैन Raffaele अस्पताल (मिलान, इटली) की संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुमोदन के साथ प्राप्त किया गया.

1 मानव ऊतकों के नमूनों और सेल शोधन (चित्रा 1)

नोट: leukemic लिम्फोसाइटों सेंट एट अल के अनुसार, CLL रोगियों के परिधीय रक्त (पंजाब) से प्राप्त निदान किया गया 9.

पंजाब से 1.1) leukemic सेल जुदाई

  1. सोडियम हेपरिन के साथ vacutainer रक्त संग्रह ट्यूबों में पंजाब लीजिए.
  2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में रक्त स्थानांतरण और पूरे रक्त का 50 μL / एमएल पर मानव बी कोशिका संवर्धन कॉकटेल जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और कमरे के तापमान पर 20 मिनट सेते हैं.
  3. , पीबीएस + 2% FBS के एक बराबर मात्रा के साथ नमूना पतला सुनिश्चित इंटरफेस तोड़ने के लिए नहीं है, जिससे Ficoll पर धीरे से और ध्यान से ओवरले रक्त मिश्रण. एक 15 मिलीलीटर टी में पतला नमूना के 2 भागों में Ficoll के कम से कम 1 भाग का उपयोग (यानी 4 मिलीलीटर Ficoll + 10 मिलीलीटर रक्तUbe).
  4. कोई ब्रेक के साथ 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (20 डिग्री सेल्सियस) पर 400 XG पर अपकेंद्रित्र,. मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं इंटरफेस में किया जाएगा.
  5. ध्यान से कोशिकाओं को ठीक करने और एक नया ट्यूब में जगह के लिए इंटरफेस aspirate. 5 मिनट के लिए अंधेरे में, 300 XG पर पीबीएस और अपकेंद्रित्र के साथ एक बार 4 डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं को धो लें. गोली तल पर किया जाएगा.
  6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें. आगे पीछे उंगलियों के साथ ट्यूब flicking द्वारा शेष सतह पर तैरनेवाला में गोली Resuspend. (10% भ्रूण बछड़ा सीरम और 15 मिलीग्राम / एमएल जेंटामाइसिन के साथ पूरक RPMI 1640) 10 मिलीलीटर पूरा RPMI मध्यम के साथ गोली पतला और Trypan ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग कोशिकाओं गिनती.

1.2) पवित्रता मूल्यांकन

नोट: सभी तैयारियाँ की पवित्रता 99% से ऊपर हमेशा की जरूरत है.

  1. निम्नलिखित एंटीबॉडी के साथ शुद्ध सेल निलंबन के 100 μl सेते (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, सामग्री की तालिका देखें): CD3 FITC (5 μl / tesटी), CD14 पीई (5 μl / परीक्षण), CD19 ईसीडी (6 μl / परीक्षण), CD16-CD56 PC5 (2 μl / परीक्षण), CD5 PC7 एक में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए (4 μl / परीक्षण), FACS ट्यूब.
  2. (300 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र) पीबीएस के 4 मिलीलीटर के साथ नमूना धो लें और साजिश के रूप में उनकी सतह पर CD19 और CD5 एक्सप्रेस जो सह CLL कोशिकाओं (> 99%) की% प्रवाह cytometry.Check से शुद्धता की जांच चित्र 1 में दिखाया (6). तैयारी शून्य के पास होना चाहिए जो साजिश में CD3, CD14 और CD16-56 की% की जाँच करके एन.के., टी lymphocytes और monocytes के लगभग रहित हैं कि सुनिश्चित करें.

1.3) नमूने संग्रहण

  1. प्रोटिओमिक पढ़ाई के लिए, 10 मिनट के लिए 300 XG पर 25 X 10 6 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं, अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को इकट्ठा 4 घंटे के लिए सतह पर तैरनेवाला और lyophilize छर्रों त्यागें. -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक रखें.
  2. पूरा RPMI में मान्यता assays, resuspend कोशिकाओं (मात्रा है कि आगे परख पर निर्भर करता है के लिएचुना) और चरण 4 के साथ आगे बढ़ना.

2 दो आयामी वैद्युतकणसंचलन (2 डे) (चित्रा 2)

2.1) Isoelectrofocusing (IEF)

  1. 380 μl 2 डे बफर (एक RBthio समाधान के 344 μl के अंतिम मात्रा के साथ CLL कोशिकाओं छर्रों solubilize (9 एम यूरिया, 10 मिमी Tris, 4% CHAPS), 65mm डीटीटी के 30 μl, 2% IPG बफर ampholine के 6 μl पीएच 4-7).
  2. 18 IPG स्ट्रिप्स (पीएच 4-7) के लिए प्रोटीन के नमूने (1 मिलीग्राम) लागू करें और कोंटी एट अल द्वारा वर्णित के रूप में मानक प्रोटोकॉल के बाद IEF प्रदर्शन करते हैं. 10
  3. आरटी पर 15 मिनट के लिए, ताजा डीटीटी के 2% के साथ पूरक,: (6 एम यूरिया, 30% ग्लिसरॉल, 2% एसडीएस युक्त 50 मिमी पीएच 8.8 Tris-एचसीएल बफर ईबी) संतुलन बफर के 2 मिलीलीटर में स्ट्रिप्स संतुलित करना. त्यागें ईबी + डीटीटी और ईबी के 2 मिलीलीटर जोड़ने 2.5% Iodoacetamide के साथ पूरक. एक कमाल मंच पर आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.

2.2) एसडीएस पृष्ठ

  1. दूर करने के लिए जेल छूने के बिना एक कागज पर स्ट्रिप्स सूखीईबी से अधिक. एक 9-16% ढाल एसडीएस पृष्ठ जेल के शीर्ष पर प्रत्येक पट्टी लोड करें. एसडीएस वैद्युतकणसंचलन बफर (Tris 25 मिमी, Glycine 192 मिमी, वी / डब्ल्यू एसडीएस 0,1%) जेल के शीर्ष पर पट्टी की लोडिंग की सुविधा के लिए की एक छोटी मात्रा में जोड़ें.
  2. पट्टी के अस्थायी रोकने के लिए अगर समाधान (0.8%) की ~ 5 मिलीलीटर जोड़कर जेल सील, तो electrophoretic इकाई को इकट्ठा और एसडीएस वैद्युतकणसंचलन बफर के साथ भरें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए 60 मा / जेल में चलाने के प्रदर्शन.
  3. Electrophoretic इकाई से जेल निकालें और उचित धुंधला बॉक्स में जगह है.

प्रारंभिक जेल के लिए 2.3) रजत दाग

फिक्सर 50% मेथनॉल 12% एसिटिक एसिड
0,05 formalin% 		2 घंटे (या रातोंरात) *
धोने बफर 35% Ehanol 20 मिनट (चरण तीन बार दोहराने)
सुग्राही 0,02% सोडियम Thiosulfate 2 मिनट
धोने एच 2 ओ 5 मिनट (चरण तीन बार दोहराने)
चांदी नाइट्रेट 0,2% चांदी नाइट्रेट 0076 formalin% 20 मिनट
धोने एच 2 ओ 1 मिनट (दो बार कदम दोहराने)
डेवलपर 6% सोडियम कार्बोनेट 0,0004% सोडियम Thiosulfate
0,05% formalin 		धुंधला हो जाना पर्याप्त है जब तक
रुकें 50% मेथनॉल 30 मिनट
* 2 घंटा कम से कम समय प्रोटीन निर्धारण के लिए आवश्यक है

तालिका 1.

नोट: प्रोटीन स्पॉट एमएस संगत चांदी दाग 11 के साथ जैल धुंधला द्वारा देखे जा सकते हैं. सभी समाधान की जरूरतचांदी धुंधला के लिए 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं.

  1. प्रत्येक समाधान / जेल के बारे में 200 मिलीलीटर की तैयारी और 1 टेबल में संकेत के रूप में आगे बढ़ना. ध्यान जेल युक्त धुंधला बॉक्स के लिए प्रत्येक समाधान जोड़ने. एक कमाल मंच पर सभी incubations प्रदर्शन करना.
  2. धुंधला के बाद, बंद करो समाधान निकालें और अधिग्रहण तक 1% एसिटिक एसिड के घोल में जेल छोड़ दें.

2.4) जेल अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. धुंधला से 3 दिनों के भीतर एक densitometer का उपयोग उच्च संकल्प पर छवियों मोल.
  2. 2 डे जैल के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 2 डी प्रोटीन पैटर्न का विश्लेषण करें.
    नोट: सॉफ्टवेयर एक तेज और विश्वसनीय छवि तुलना की अनुमति देता है.
    1. प्रासंगिक मेनू से "एक नई परियोजना का निर्माण" का चयन करके एक परियोजना बनाएँ. एक फ़ोल्डर बनाएँ और, .tif साथ "आयात जेल छवियों" चुनने .png द्वारा जैल आयात करते हैं. या .gel विस्तार.
    2. जैल आयातित और worksp में जुड़ जाते एक बारइक्का, मेनू में "का पता लगाने संपादित> स्थान>" स्थान का पता लगाने के लिए जैल का चयन और चयन करके एक स्वचालित स्थान का पता लगाने के लिए प्रदर्शन.
    3. इसके बाद, मेनू "घटाना पृष्ठभूमि" से चुनकर एक पृष्ठभूमि घटाव प्रदर्शन करते हैं. नोट: यह कई जैल तुलना करने के लिए और मात्रात्मक और / या गुणात्मक विश्लेषण से मतभेद या समानता का पता लगाने के लिए संभव है के बाद कि.

MALDI-TOF एमएस विश्लेषण द्वारा 3 प्रोटीन की पहचान (चित्रा 3)

3.1) प्रोटीन पाचन

  1. या तो (एक स्वच्छ स्केलपेल के साथ काटने) पुस्तिका से या स्वचालित छांटना द्वारा जैल से ब्याज का पानी और आबकारी धब्बों के साथ जेल कुल्ला.
  2. , पानी (100-150 μl) के साथ जेल कणों धो नीचे स्पिन (400 XG पर 30 सेकंड) और तरल हटा दें.
  3. जेल टुकड़े को सीएच 3 सीएन की (जेल मात्रा पर निर्भर करता है) एक बराबर मात्रा जोड़ने और जेल टुकड़े हटना जब तक 10-15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. जेल कणों से सुखी मैंNA वैक्यूम अपकेंद्रित्र.
  4. 50 मिमी एनएच 4 HCO 3 में पतला 10 मिमी Dithioerythritol की 75-100 μl जोड़ें और 56 डिग्री सेल्सियस (न्यूनीकरण चरण) पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. चरण 3.1.3 में वर्णित के रूप में फिर से सीएच 3 सीएन साथ जेल टुकड़े हटना.
  5. मिमी Iodoacetamide 50 मिमी एनएच 4 HCO 3 में पतला और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते एक समाधान 55 की 75-100 μl जोड़कर alkylation के साथ आगे बढ़ें.
  6. चरण 3.1.3 में वर्णित के रूप में जेल टुकड़े को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा का उपयोग सीएच 3 सीएन के साथ एक बार फिर जेल टुकड़े हटना. एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में सूखी.
  7. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 HCO 3 25 मिमी राष्ट्रीय राजमार्ग, 5 मिमी 2 CaCl, और 12,5 एनजी trypsin के / μl युक्त एक बफर में कणों rehydrate. जेल टुकड़े को कवर करने के लिए बफर की पर्याप्त मात्रा का प्रयोग करें. जेल टुकड़े से संयुक्त राष्ट्र अवशोषित सतह पर तैरनेवाला निकालें और 25 मिमी एनएच 4 HCO 3, 5 मिमी 2 CaCl trypsin बिना cov के लिए जोड़जेल एर.
  8. रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस कम से कम 3 घंटा (पेप्टाइड पाचन के लिए आवश्यक न्यूनतम समय) के लिए कम से नमूने छोड़ दें.

3.2) मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण (सूखे छोटी बूंद तकनीक)

  1. एक स्टेनलेस स्टील MALDI थाली पर प्रत्येक नमूने की स्पॉट 1 μl विभाज्य और 50% सीएच 3 सीएन और 0.1% TFA में तैयार α-cyano-4-hydroxycinnamic मैट्रिक्स के रूप में एसिड की 1 μl, साथ मिश्रण.
  2. एक MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमीटर पर जन स्पेक्ट्रा प्राप्त करते हैं. लेजर तीव्रता संकेत संतृप्ति को रोकने के लिए या संकेत बढ़ाने के लिए समायोजन, स्थान के बारे में प्रति 200 स्पेक्ट्रा जमा. डेटा एक्सप्लोरर सॉफ्टवेयर के माध्यम से प्रक्रिया स्पेक्ट्रा नीचे वर्णित के रूप में:
    1. .dat फ़ाइल आयात और "प्रक्रिया> आधारभूत सुधार" का चयन करके आधारभूत सुधार करते हैं. "प्रक्रिया> जन अंशांकन> पुस्तिका अंशांकन चुनकर trypsin autolysis उत्पादों और मैट्रिक्स चोटियों का उपयोग जनता जांचना; मी / z 855.1 और 2163.1 बी के करीब चोटियों का चयनवाई फिर "साजिश" पर क्लिक करें और मैनुअल अंशांकन खिड़की में "अंशांकन लागू", खींचने और इसी संदर्भ जनता का चयन छोड़ दिया.
    2. ("सक्रिय ट्रेस नकल> प्रदर्शन") सक्रिय ट्रेस नकल, चोटी का पता लगाने के लिए सीमा ("शिखर> चोटी का पता लगाने") समायोजित नया पता लगाने का चयन करें और deisotoping ("शिखर> deisotoping") करते हैं. मैक्रो "getpeaklist" का उपयोग करना, पहचान के लिए प्रयोग की जाने वाली जनता की एक सूची उत्पन्न करते हैं. यदि आवश्यक हो, मैन्युअल सूची को साफ और एक बेहतर पहचान पाने के लिए चोटियों के रूप में उठाया शोर संकेतों को हटा दें.
  3. खोज इंजन के रूप में 12 गहरा और शुभंकर का उपयोग कर एक व्यापक गैर अनावश्यक प्रोटीन डेटाबेस खोज से प्रोटीन की पहचान करें.
    1. सभी खोजों में निम्नलिखित मानकों का प्रयोग करें: एक तय संशोधन और एक initi रूप पेप्टाइड प्रति दरार, चर संशोधन के रूप में methionine ऑक्सीकरण, सिस्टीन carbamidomethylation याद किया50 पीपीएम के अल जन सहिष्णुता.

4 cytoskeletal गतिविधि assays (चित्रा 4)

नोट: कोशिकाओं Resuspend पूरा RPMI (10 6 कोशिकाओं / 200 μl) में चरण 1 में शुद्ध.

4.1) प्रवासन परख. इस परीक्षण का विश्लेषण किया कोशिकाओं (लिम्फोसाइटों) की प्रवासी क्षमता की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. 6.5 मिमी व्यास और 5.0 माइक्रोन रोमकूप आकार की एक transwell कक्ष का प्रयोग करें और तीन प्रतियों में परख करते हैं. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के मामले में ध्यान में लीन होना आकार और माइग्रेशन समय (चरण 4.1.3) का अनुकूलन.

  1. क्रमशः प्रेरित और सहज प्रवास को मापने के लिए साथ या विशिष्ट उत्तेजनाओं (यानी एसडीएफ 1) के बिना पूरा RPMI के 600 μl जोड़कर निचले सदन तैयार करें.
  2. उस पर ऊपरी सदन रखो और प्रणाली इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए संतुलित करना.
  3. बीज 10 6 कोशिकाओं / ऊपरी सदन में 200 μl (कुल सेल नंबर) और सेतेइनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए थाली.
  4. , ऊपरी सदन निकालें निचले सदन में मीडिया को इकट्ठा करने और 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ एक बार निचले सदन धो लो. ट्यूब में पीबीएस लीजिए.
  5. 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र, 500 μl पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend त्यागें.
  6. प्रवाह cytometry द्वारा अधिग्रहण के 1 मिनट के बाद चले गए कोशिकाओं की संख्या गिनती. एक पृथक सेल जनसंख्या के मामले में यह किसी भी सतह एंटीबॉडी जोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है. कोशिकाओं की ओर scatters और गणना के लिए उपयोग करने के लिए संख्या है जो 1 मिनट में कल्पना की घटनाओं की संख्या पर एक द्वि आयामी डॉट साजिश में कोशिकाओं की संख्या की जाँच करें.
  7. प्रवासन सूचकांक (एमआई) के रूप में की गणना:
    समीकरण 1

4.2) आसंजन परख. इस परख कोशिकाओं के आसंजन क्षमता को मापने के लिए अनुमति देता है. तीन प्रतियों में परख प्रदर्शन.

  1. पूर्व कोट 96 welलोकसभा में 50 μl के साथ प्लेट (फ्लैट नीचे) / अच्छी तरह से या तो रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस, पीबीएस में पतला 2% BSA पीबीएस (पृष्ठभूमि के रूप में) या 1 ग्राम ICAM-1.
  2. पीबीएस के साथ दो बार थाली धो लें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 2% BSA पीबीएस (100 μl / अच्छी तरह से) जोड़कर गैर विशिष्ट साइटों को ब्लॉक.
  3. पूरा RPMI में 5 एक्स 10 6 / एमएल पर इस बीच resuspend कोशिकाओं में, 1 मिमी CMFDA, हरे सेल ट्रैकर के साथ उन्हें लेबल और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट सेते हैं.
  4. अवरुद्ध समाधान (चरण 4.2.2) discarding के बाद 1 x 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से पूर्व लेपित कुओं में जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे सेते हैं.
  5. एक एलिसा रीडर का उपयोग करके आसंजन यों (उत्तेजना फिल्टर: 485 एनएम, उत्सर्जन फिल्टर: 535 एनएम). कुल इनपुट (इनपुट) पर पहली बार एक माप प्रदर्शन.
  6. 2% BSA पीबीएस के साथ धीरे थाली धोने (200 μl / अच्छी तरह से) 4 बार (x). प्रत्येक धोने कदम (आसंजन एक्स) के बाद थाली का एक पढ़ने कार्य करें.
  7. प्रत्येक माप के लिए पृष्ठभूमि घटाव के बाद, विशेष adhes गणनाआयन (आसंजन):
    समीकरण 1

4.3) Polymerization परख. यह एफ actin polymerization quantifies कि एक वर्णमिति परख है. तीन प्रतियों में परख प्रदर्शन.

  1. Resuspend 1x10 ^ 10 मिनट के लिए 6 पूर्व गर्म पूरा RPMI के 100 μl में कोशिकाओं और विशिष्ट प्रोत्साहन जोड़ने (यानी α-आईजीएम 20 माइक्रोग्राम / एमएल).
  2. 4% paraformaldehyde के 400 μl के साथ प्रतिक्रिया बंद करो और आरटी पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक.
  3. (5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र) पीबीएस के साथ 3 बार धोएं.
  4. 2 मिनट के लिए बर्फ पर पीबीएस saponine 0.2% (200 μl) के साथ सतह पर तैरनेवाला और Permeabilize कोशिकाओं त्यागें.
  5. , (5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र) पीबीएस saponine 0.1% के साथ 3 बार धोएं 100 μl पीबीएस saponine 0.1% में सतह पर तैरनेवाला और resuspend त्यागें.
  6. कमरे टी पर 30 मिनट के लिए Phalloidin-Alexafluor 488 (3 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ दागअंधेरे में emperature.
  7. पीबीएस 0.1% saponine साथ 3 बार धोएं. 300 μl पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend त्यागें.
  8. Phalloidin का मतलब पुष्पन तीव्रता (एमएफआई) की गणना, प्रवाह cytometry द्वारा एफ actin की राशि यों. फ्लोरोसेंट तीव्रता के आधार पर एक हिस्टोग्राम का उत्पादन करने के क्रम में एक भी आयाम साजिश में उत्पन्न डेटा का विश्लेषण करें, एमएफआई मूल्य ग्राफ रिपोर्ट में दिखाया गया है.
  9. एफ actin polymerization (Δ एफ actin) के रूप में उपाय:
    समीकरण 1

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Representative Results

हम प्राथमिक लयूकेमिक बी कोशिकाओं CLL रोगियों की पंजाब के फार्म अलग है और हम प्रोटिओमिक नक्शे का विश्लेषण किया. नमूने (एन = 104) प्रत्येक रोगी (अच्छा रोग का निदान बनाम बुरा रोग का निदान) और 2DE जैल का तुलनात्मक विश्लेषण किया गया था के नैदानिक ​​सुविधाओं के आधार पर दो मुख्य कैंपेन्स में वर्गीकृत किया गया.

विश्लेषण की अनुमति दी विभिन्न दो कैंपेन्स के बीच व्यक्त स्पॉट की पहचान (बाद translational संशोधनों में परिवर्तन जिसका अर्थ उपस्थिति / अनुपस्थिति या जेल पर पारी की अवधि में,; n ≈ 16). हम एक MALDI थाली पर देखा गया 2DE जैल से और कम हो और alkylated किया जा रहा है, प्रोटीन trypsin और जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला में पेप्टाइड के साथ पचा गया के बाद चयनित स्पॉट excised. स्पेक्ट्रा एक MALDI-TOF मल्लाह डे में हासिल किया गया. परिणामस्वरूप शिखर सूची शुभंकर और गहरा करने के लिए प्रस्तुत की गई थी. एक निश्चित द्रव्यमान सहिष्णुता के भीतर जनता माना जाता है जो एक प्रोटीन, में डेटाबेस में दृश्यों पेप्टाइड को सौंपा, और फिर इकट्ठा कर रहे हैंयह एक निश्चित संभावना स्कोर (चित्रा 3) गुजरता अगर पहचान की. इस विश्लेषण से हम मुख्य रूप से cytoskeletal गतिविधि और चयापचय की प्रक्रिया (अप्रकाशित डेटा) में शामिल प्रोटीन की पहचान की.

उनमें से, हम जिसका अंतर फास्फारिलीकरण जोरदार रोग के नैदानिक ​​पाठ्यक्रम के साथ जुड़े (चित्रा 4) hematopoietic वंश सेल विशिष्ट प्रोटीन -1 (HS1) पर ध्यान केंद्रित किया. 2 धब्बों के साथ रोगियों (n = 60, Hypo-phosphorylated HS1) अच्छा रोग का निदान 13 (चित्रा 4 है, जबकि विशेष रूप से, हम (n = 44, अति phosphorylated HS1) एक बुरा नैदानिक ​​परिणाम का अनुभव रोगियों को एक ही स्थान ले जा पाया है कि ). स्पॉट में HS1 प्रोटीन की उपस्थिति तो HS1 13 के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ 2DE जेल Immunoblotting द्वारा मान्य किया गया था.

यह HS1 cytoskeletal remodeling 14 में शामिल है कि जाना जाता है के बाद से, हम मैं परीक्षण करने के लिए इन विट्रो assays में प्रदर्शनच HS1 फास्फारिलीकरण स्थिति विभिन्न (बुरा रोग का निदान बनाम अच्छा) दो CLL कैंपेन्स में cytoskeletal गतिविधि को प्रभावित कर सकता है. एक स्थान प्रवास, आसंजन और actin polymerization के मामले में एक बिगड़ा cytoskeletal गतिविधि के रूप में हम इस प्रकार एक अलग नैदानिक ​​व्यवहार 15 (चित्रा 5), समझा Hypo-phosphorylated-HS1 नमूनों की तुलना में, HS1 ले जाने कि CLL कोशिकाओं पाया.

चित्रा 1
चित्रा 1:. CLL रोगियों से पंजाब रक्त से लुकेमिक सेल शुद्धि के कार्यप्रवाह एक 15ml ट्यूब (1), मानव बी कोशिका संवर्धन कॉकटेल (2) नमूने के लिए जोड़ा गया है और 20 मिनट के लिए incubated है में स्थानांतरित किया है. रक्त तो 1 के अनुपात में पीबीएस के साथ पतला है: 1 और घनत्व ढाल (3) के शीर्ष पर रखा गया. इसके बाद नमूना centrifugation (4) एकाधिक एल के गठन की अनुमति देता है Ayers: एक) प्लाज्मा, ख) बी लिम्फोसाइटों, ग) Ficoll, घ) लाल कोशिकाओं और अवांछित कोशिकाओं. शुद्ध बी लिम्फोसाइटों (बी परत) तो (5), धोया और सेल तैयारी की पवित्रता फ्लो (6) द्वारा विश्लेषण किया है एकत्र कर रहे हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2:. 2DE के कार्यप्रवाह गोली 2DE बफर (1) में solubilized और प्रथम आयाम रन (2 isoelectrofocusing) के लिए IPG पट्टी पर लोड किया जाता है. संतुलन के बाद, पट्टी दूसरा आयाम रन (3 एसडीएस पृष्ठ) के लिए एक ढाल polyacrylamide जेल के शीर्ष पर लोड किया जाता है. जेल तो स्पॉट कल्पना करने के लिए दाग है / प्रोटीन (4). उच्च संकल्प छवि अधिग्रहण के बाद, प्रोटिओमिक नक्शे विश्लेषण कर रहे हैं (5). लेस / ftp_upload / 51942 / 51942fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3: एमएस विश्लेषण के कार्यप्रवाह (1) रुचि के धब्बे एक स्केलपेल के साथ 2 डी जेल से excised और एक स्वच्छ ट्यूब में स्थानांतरित कर रहे हैं.. कम और alkylated जाने के बाद (2), प्रोटीन trypsin के साथ पचा रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला में पेप्टाइड्स एक MALDI प्लेट (3) पर देखा जाता है. स्पेक्ट्रा एक MALDI-TOF मल्लाह डे में अर्जित कर रहे हैं. (4) जिसके परिणामस्वरूप शिखर सूची शुभंकर और गहरा खोज इंजन के लिए प्रस्तुत की और एक व्यापक गैर अनावश्यक प्रोटीन डेटाबेस के खिलाफ खोज की है. (5) एक निश्चित द्रव्यमान सहिष्णुता के भीतर जनता के डेटाबेस में पेप्टाइड दृश्यों के लिए आवंटित कर रहे हैं, तो एक प्रोटीन में इकट्ठे हुए. लक्ष्य = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4: HS1 फास्फारिलीकरण स्थिति CLL रोगियों के रोग का निदान के साथ संबद्ध (1) वृत्त क्रमशः 4.83 और 4.86 के 79 केडीए के एक ही आणविक द्रव्यमान (श्री) और विभिन्न समविद्युतविभव बिंदु (पीआई) के साथ दो करीबी स्पॉट की पहचान है, द्वारा की पहचान की थी जो. HS1 प्रोटीन के रूप में एमएस (2). (2) एक बुरा रोग का निदान (लाल चौक) और एक अच्छा रोग का निदान CLL रोगियों (हरे वर्ग) के दो प्रतिनिधि जैल. (3) कापलान-Meier घटता HS1 फास्फारिलीकरण पैटर्न के अनुसार वर्गीकृत CLL रोगियों का संचयी अस्तित्व दिखाने (1 स्थान, एन = 44, बनाम 2 धब्बे, एन = 60). 2 स्पॉट (हरी डॉट्स) के साथ मरीजों को केवल एक (लाल डॉट्स) के साथ उन लोगों की तुलना में काफी लंबे समय तक जीवित रहने की (मंझला अस्तित्व नहीं पहुंचे) है./files/ftp_upload/51942/51942fig4highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5: CLL प्राथमिक नमूनों में HS1 फास्फारिलीकरण स्थिति को प्रभावित करती है cytoskeletal कार्यक्षमता एसडीएफ -1 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में प्राथमिक नमूनों की transwell पर (1) प्रवासन.. ग्राफ में SEM (एन = 7 1 के स्थान HS1 बनाम N = 12 2 स्थान की HS1) प्रवाह पर 1 मिनट में अधिग्रहीत कोशिकाओं की संख्या का साधन प्रदर्शित कर रहे हैं. (2) स्वतःस्फूर्त आसंजन सेल लेबलिंग और 96 अच्छी तरह प्लेटें में 1 घंटा ऊष्मायन के बाद मापा गया था. साधन SEM प्राथमिक नमूने लिए हैं प्रदर्शित (एन = 7 1 के स्थान HS1 बनाम N = 12 स्थान HS1 2 की). प्राथमिक नमूनों की (3) एफ actin polymerization क्षमता. रिश्तेदार एफ actin शेष भाग के साधन SEM हैं प्रदर्शितFITC लेबल phalloidin साथ एसडीएफ -1 के साथ उत्तेजना और धुंधला के बाद CLL कोशिकाओं के ईएनटी (5 1 के स्थान HS1 n = बनाम N = 5 2 स्थान HS1 की). एमएफआई: मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता. हिस्टोग्राम नमूना अधिग्रहण के उदाहरण के रूप में. का प्रतिनिधित्व करते हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस पांडुलिपि का उद्देश्य इस दृष्टिकोण अन्य बीमारियों और / या अन्य प्रकार नमूना 16-18 के लिए बढ़ाया जा सकता है, भले ही CLL के रोगजनन में शामिल अणुओं की पहचान के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए है. बुरा रोग का निदान 19 बनाम अच्छा CLL रोगियों के 2 कैंपेन्स के प्रोटीयोमिक प्रोफाइलों की तुलना करके, हम वे HS1 के फास्फारिलीकरण स्थिति में मतभेद है कि और अपने सक्रियण leukemic कोशिकाओं के प्रवास और आसंजन क्षमता को प्रभावित करता है कि प्रदर्शन किया.

अन्य तरीकों के संबंध में, पांडुलिपि, 2DE जेल और एमएस में प्रस्तुत प्रोटीयोमिक तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि, वे सेल proteome की एक पूरी फिंगरप्रिंट प्रदान करते हैं और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि वे प्रोटीन के बाद translational संशोधनों के बारे में जानकारी देना है. विभिन्न phosphorylated या ग्लाइकोसिलेटेड हैं कि प्रोटीन जेल में अपनी स्थिति को बदलने, और संभावना कोशिकाओं में उनकी गतिविधि बदल जाते हैं.

"ove_content> इसके अलावा, हम cytoskeletal कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि 'कोशिकाओं प्रवास और आसंजन के मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित हैं, वे आमतौर पर पक्षपाती कोशिकाओं को लागू कर रहे हैं के बाद से इन प्रोटोकॉल अभी भी खराब (, निलंबन में बढ़ कोशिकाओं के लिए जैसे घाव चिकित्सा वर्णित हैं कार्यात्मक assays के लिए यह कोशिकाओं की व्यवहार्यता है जबकि). 2DE और एमएस तकनीक की प्रमुख सीमा कोशिकाओं / प्रोटीन (जेल प्रति ≈25 x 10 6 कोशिकाओं) की राशि है. असली चुनौती प्राथमिक कोशिकाओं पर काम करने के लिए है , लेकिन कई रोगों के लिए यह कोशिकाओं या उन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए जीवित कोशिकाओं के लिए पर्याप्त संख्या तक पहुंचने के लिए संभव नहीं है, इस मामले में, यदि उपलब्ध हो, यह सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए संभव है.

एमएस प्रोटोकॉल के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है ताकि संक्रमण से बचने के लिए और स्पष्ट प्रोटीन की पहचान प्राप्त करने में स्वच्छ (केरातिन मुक्त) की स्थिति में काम करने के लिए है. Cytoskeletal assays विशेष रूप से प्रथम पर (पुन: पेश करने के लिए आम तौर पर मुश्किल हो जाता हैRY कोशिकाओं), इस प्रकार यह तीन प्रतियों में प्रयोग करने का सुझाव दिया है.

हम दिखा दिया है के रूप में हम HS1 प्रोटीन 19 के लिए प्रदर्शन किया है, जैसा कि इस पांडुलिपि में प्रस्तुत दृष्टिकोण के संयोजन, इस प्रकार नई चिकित्सकीय लक्ष्यों की खोज के लिए उपलब्ध कराने, विभिन्न रोगों में शामिल नए रास्ते की पहचान करने में मदद करता है.

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Acknowledgments

हम लिम्फायड कैंसर यूनिट, एलिसा दस Hacken, लिडा Scarfò, मास्सिमो Alessio, एंटोनियो कोंटी, एंजेला बच्ची, और एंजेला Cattaneo धन्यवाद.

इस परियोजना के द्वारा समर्थित किया गया था: Associazione Italiana प्रति ला RICERCA सुल Cancro AIRC (अन्वेषक अनुदान और विशेष कार्यक्रम आण्विक नैदानिक ​​कैंसर विज्ञान - 5 सहस्र # प्रति 9965)

सीएस और बीए, अध्ययन डिजाइन किए प्रयोगों का प्रदर्शन, डेटा का विश्लेषण और पांडुलिपि लिखा था. MTSB, यू.आर., FBPR पांडुलिपि लेखन में सहायता प्रदान की. पीजी और एफसीसी अध्ययन प्रदान की मरीजों के नमूने और क्लीनिकल डाटा बनाया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitril MERCK 61830025001730 
Ammonium Bicarbonate SIGMA A6141-500G
1,4-Dithioerythritol SIGMA D9680-5G
Iodoacetamide SIGMA I6125-25G
Calcium chloride dihydrate SIGMA 223506-25G
Trypsin, Sequencing Grade ROCHE 11418475001
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid SIGMA C2020-10G
Trifluoroacetic acid SIGMA T6580
ZipTipµ-C18 MILLIPORE ZTC18M096
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL 15064
PBS EUROCLONE ECB4004L
FBS DOMINIQUE DUTSCHER S1810
Lymphoprep SENTINEL DIAGNOSTICS 1114547
Trypan Blue SIGMA T8154
CD19 BECKMAN COULTER 082A07770 ECD
CD5 BECKMAN COULTER 082A07754 PC5
CD3 BECKMAN COULTER 082A07746 FITC
CD14 BD 345785 PE
CD16 BECKMAN COULTER 082A07767 PC5
CD56 BECKMAN COULTER 082A07789 PC5
Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE-Healthcare 11-0033-64 
Urea SIGMA U6504
Tris-Hcl Buffer BIO-RAD 161-0799
CHAPS SIGMA C2020-10G
DTT SIGMA D9163-5G
IPGstrips GE-Healthcare 17-1233-01  Linear pH 4-7 18cm
IPGbuffer GE-Healthcare 17-6000-86 pH 4-7
Glycerol SIGMA G6279
PROTEAN II XL Cell BIO-RAD 165-3188
SDS INVITROGEN NP0001
Acrilamide BIO-RAD 161-0156
Agarosio INVITROGEN 16500
Methanol SIGMA 32213
Acetic Acid VWR 631000
Formalin BIO-OPTICAL 05-K01009
Ethanol VWR 9832500
Sodium Thiosulfate FLUKA 72049
Silver Nitrate FLUKA 85228
Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0 Amersham Biosciences
Sodium Carbonate MERCK A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR Applied Biosystems
Data Explorer software (version 3.2)  Applied Biosystems
transwell chambre 6.6 mm diameter CORNING 3421
RPMI EUROCLONE ECB2000L WITH L-GLUTAMINE
Gentamicin SIGMA G1397
SDF-1 PREPROTECH 300-28A
Flat-bottom 96-well plate BECTON DICKINSON 353072
BSA SANTA CRUZ 9048-46-8
ICAM-1 R&D Systems 720-IC
CMFDA Life Thechnology C7025 Green
IgM SOUTHERNBIOTECH 2020-02
Paraformaldehyde SIGMA P6148
Saponine SIGMA S-7900
Phalloidin  Life Thechnology A12379 Alexa fluor 488

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References

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चिकित्सा अंक 92 लिम्फोसाइटों क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया 2 डी वैद्युतकणसंचलन मास स्पेक्ट्रोमेट्री cytoskeleton माइग्रेशन
प्रोटीन समारोह के लिए एक 2DE जेल मौके से: क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया में HS1 से सीखा सबक
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Apollonio, B., Bertilaccio, M. T.… More

Apollonio, B., Bertilaccio, M. T. S., Restuccia, U., Ranghetti, P., Barbaglio, F., Ghia, P., Caligaris-Cappio, F., Scielzo, C. From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. (92), e51942, doi:10.3791/51942 (2014).

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