Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das zwei Paare Proteom-Techniken, nämlich 2-dimensionale Elektrophorese (2DE) und Massenspektrometrie (MS), differentiell zwischen zwei oder mehr Gruppen von Primärproben ausgedrückt identifizieren / post-translationale modifizierten Proteinen. Dieser Ansatz, der zusammen mit funktionellen Experimenten ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von Prognosemarkern / therapeutische Ziele.
Abstract
Die Identifizierung von Molekülen in der Tumorprogression beteiligt Initiierung und ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Biologie und Erkrankung als Folge, für die klinische Behandlung von Patienten. In der vorliegenden Arbeit werden wir eine optimierte proteomischen Ansatz für die Identifizierung von Molekülen in der Progression der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) beteiligt zu beschreiben. Im Einzelnen werden leukämischen Zell-Lysaten durch 2-dimensionale Elektrophorese (2DE) gelöst und als "Flecken" auf der 2DE Gelen visualisiert. Vergleichende Analyse von Proteom-Karten ermöglicht die Identifizierung von differentiell exprimierten Proteine (in Bezug auf die Fülle und post-translationale Modifikationen), die abgeholt werden, isoliert und identifiziert durch Massenspektrometrie (MS). Die biologische Funktion der identifizierten Kandidaten kann durch verschiedene Assays (dh Migration, Adhäsion und F-Aktin-Polymerisation) getestet werden, dass man für die primäre Leukämiezellen optimiert wurden.
Introduction
Chronische lymphatische Leukämie (CLL), der häufigsten Leukämie bei Erwachsenen in den westlichen Ländern, ergibt sich aus der Akkumulation von monoklonalen Tumor CD5 + B-Lymphozyten und ist klinisch sehr heterogen. Es kann als ein Pre-Leukämieform, die als monoklonale B-Zell-Lymphozytose (MBL) 1,2,3 vorliegen. In anderen Fällen kann die Krankheit erscheinen entweder mit einem indolenten klinischen Verlauf, dass über Jahre stabil bleiben, bevor eine Behandlung benötigen kann, oder als progressive Erkrankung mit chemorefractory düstere Prognose trotz Therapie. Schließlich kann es in eine tödliche häufig hochgradige Lymphom (Richter-Syndrom-RS) 2,3,4 Fortschritt. Gute und schlechte Prognose, basierend auf einer Reihe von prognostischen Faktoren, die ergänzende Informationen zu Prädiktoren der Krankheitsverlauf und die Überlebens bietet: Die Patienten werden in der Regel in zwei Hauptuntergruppen klassifiziert. Klinische Heterogenität spiegelt wahrscheinlich biologische Heterogenität. Eine Reihe von genetischen, Mikroumgebung und CEllular Faktoren wurde gezeigt, dass auf Pathogenese stimmen aber keine einheitliche Mechanismen wurden 5. Im Einzelnen haben mehrere Studien gezeigt, dass Unterschiede in den klinischen Verlauf der Krankheit kann teilweise durch das Vorhandensein (oder die Abwesenheit) von einigen biologischen Markern, die einen prognostischen Wert haben 6,7,8 erläutert. Diese Daten zeigten, dass ein besseres Verständnis der Krankheit Biologie könnte zusätzliche Hinweise für die klinische Behandlung der Pathologie liefern, durch die Identifizierung von sowohl prognostische Marker und therapeutischer Targets.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zu zeigen, wie eine Kombination von verschiedenen proteomischen Techniken für die Identifizierung von Proteinen in CLL Entstehung und Progression beteiligt sind, verwendet werden. Unser Ansatz zeigt, dass es möglich ist, gemeinsam Grund Proteom-und klinischen Daten 5 verbinden.
In der vorliegenden Workflow, primäre Leukämiezellen von Patienten ausgewählt(Gut vs schlechte Prognose) werden isoliert und Zelllysaten werden dann verwendet, um Proteom-Karten zu erhalten. 2DE erlaubt die Charakterisierung der proteomischen Profil einer Zellpopulation, einschließlich post-translationale Modifikationen, wodurch indirekt Informationen über die biologische Aktivität des jeweiligen Proteins. Ganzzell-Lysate werden durch eine erste Dimension laufen, bezogen auf den isoelektrischen Punkt gelöst, gefolgt von einer zweiten Dimension auf einem Polyacrylamid-Gel, das Proteine löst auf der Grundlage ihres Molekulargewichts führen. Vergleichende Analyse der Proteom-Karten ermöglicht die Identifizierung der differenziell exprimierten Proteine (sowohl in Bezug auf Menge und posttranslationale Modifikationen) als Punkte auf dem Gel ausgeschnitten und durch Massenspektrometrie analysiert werden können. Die Rolle der einzelnen Kandidaten kann dann durch verschiedene Tests genutzt werden.
Dieser Ansatz, der CLL in der aktuellen Manuskript beschränkt, kann leicht auf andere Krankheiten / Proben erweitert werden, damit die Bereitstellung von Informationen über die proteomic / biologischen Unterschiede zwischen beiden Gruppen (dh pathologische vs normal, nicht stimulierten vs Wildtyp vs Zuschlags stimuliert).
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Protocol
HINWEIS: Alle Gewebeproben wurden mit Zustimmung der Ethikkommission des Krankenhauses San Raffaele (Mailand, Italien) erhalten.
1. Menschengewebeproben und Zellreinigung (Abbildung 1)
HINWEIS: Leukämie-Lymphozyten wurden aus peripherem Blut (PB) von CLL-Patienten nach Mulligan et al, 9 diagnostiziert.
1.1) von Leukämiezellen Trennung von PB
- Sammeln PB in Vacutainer Blutentnahmeröhrchen mit Heparin-Natrium.
- Übertragen Blut in ein 15-ml-Tube und füge menschlichen B-Zell-Anreicherung Cocktail bei 50 ul / ml Vollblut. Gut mischen und Inkubation 20 min bei Raumtemperatur.
- Verdünnen Probe mit dem gleichen Volumen PBS + 2% FBS, vorsichtig mischen und vorsichtig Overlay Blut über Ficoll, was sicher nicht, um die Schnittstelle zu brechen. Verwenden Sie mindestens 1 Teil Ficoll zu 2 Teilen der verdünnten Probe (dh 4 ml Ficoll + 10 ml Blut in einem 15 ml tube).
- Zentrifuge bei 400 × g bei Raumtemperatur (20 ° C) für 20 min ohne Bremse. Mononukleäre Zellen an der Grenzfläche ist.
- Sorgfältig absaugen Schnittstelle, um die Zellen zu gewinnen und in einen neuen Schlauch. Waschen Zellen einmal mit PBS und Zentrifugation bei 300 × g, 4 ° C im Dunkeln für 5 min. Das Pellet wird am unteren Rand sein.
- Überstand verwerfen. Das Pellet in dem verbleibenden Überstand Dazu den Schlauch hin und her mit den Fingern. Verdünne das Pellet mit 10 ml vollständigem RPMI-Medium (RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum und 15 mg / ml Gentamicin) und zähle die Zellen unter Verwendung von Trypan-Blau-Ausschlussverfahren.
1.2) Reinheit Bewertung
HINWEIS: Die Reinheit aller Zubereitungen muss immer oberhalb von 99% liegen.
- Inkubieren 100 ul gereinigte Zellsuspension mit den folgenden Antikörpern (im Handel erhältlich, siehe Tabelle der Materialien): CD3 FITC (5 ul / test), CD14 PE (5 ul / Prüfung), CD19-ECD (6 ul / Test), CD16-CD56 PC5 (2 ul / Test), CD5 PC7 (4 ul / Test), für 20 min bei 4 ° C in eine FACS-Röhrchen.
- Die Probe mit 4 ml PBS (Zentrifuge für 5 min bei 300 g) waschen und überprüfen Sie die Reinheit durch Strömungs cytometry.Check in der Handlung den% der CLL-Zellen (> 99%), die CD19 und CD5 auf ihrer Oberfläche als Co-express (6) in 1 gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Vorbereitungen sind praktisch frei von NK, T-Lymphozyten und Monozyten durch die Überprüfung der% der CD3, CD14 und CD16-56 in der Handlung, die in der Nähe von Null sein sollte.
1.3) Die Proben Lagerung
- Für proteomische Studien, erheben 25 x 10 6 Zellen in einem 1,5-ml-Röhrchen, Zentrifuge Zellen bei 300 g für 10 min, Überstand verwerfen und lyophilisiere Pellets 4 Stunden. Halten bei -80 ° C bis zur Verwendung.
- Zur Validierung Assays Zellen in komplettem RPMI (Menge hängt von der weiteren Test, der istgewählt) und fahren Sie mit Schritt 4.
2. Zweidimensionale Elektrophorese (2-DE) (Abbildung 2)
2.1) Isoelektrofokussierung (IEF)
- Solubilisierung CLL-Zellen-Pellets mit einem Endvolumen von 380 ul 2-DE-Puffer (344 ul einer Lösung RBthio (9 M Harnstoff, 10 mM Tris, 4% CHAPS), 30 ul 65 mm DTT, 6 ul 2% IPG-Puffer Ampholin pH-Wert 4-7).
- Gelten Proteinproben (1 mg) zu 18 IPG-Streifen (pH 4-7) und führen Sie folgende IEF Standard-Protokoll wie von Conti et al. 10
- Äquilibrieren Streifen in 2 ml Äquilibrierungspuffer (EB: 50 mM pH 8,8 Tris-HCl-Puffer, der 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 2% SDS), ergänzt mit 2% der frischen DTT für 15 Minuten bei RT. Verwerfen EB + DTT und 2 ml EB ergänzt mit 2,5% Iodacetamid. Inkubieren für 15 min bei RT auf einem Schaukelplattform.
2.2) SDS-PAGE
- Trocknen Sie die Streifen auf einem Papier ohne Berührung des Gels zu entfernenDer Überschuss der EB. Laden jeden Streifen auf einem 9-16% Gradienten-SDS-PAGE-Gel. Hinzufügen eines kleinen Volumens von SDS-Elektrophorese-Puffer (Tris 25 mM, Glycin 192 mM, SDS 0,1% w / v) auf der Oberseite des Gels, um das Laden des Bandes zu erleichtern.
- Dichten Sie das Gel durch Zugabe von ~ 5 ml Agar-Lösung (0,8%) schwimm des Streifens zu verhindern, dann die elektrophoretische Einheit montieren und füllen mit SDS-Elektrophorese-Puffer. Führen der Lauf bei 60 mA / Gel 4 Stunden bei 4 ° C ist.
- Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophorese-Einheit und legen Sie sie in der richtigen Färbung-Box.
2.3) Silberfärbung für die präparative Gel
| FIXER | 50% Methanol 12% Essigsäure 0,05% Formalin | 2 Stunden (oder über Nacht) * |
| WASH BUFFER | 35% Ehanol | 20 min (dreimal wiederholen Sie den Schritt) |
| Sensibilisierung | 0,02% Natriumthiosulfat | 2 min |
| WASH | H 2 O | 5 min (dreimal wiederholen Sie den Schritt) |
| SILVER NITRAT | 0,2% Silbernitrat 0,076% Formalin | 20 min |
| WASH | H 2 O | 1 min (zweimal wiederholen Sie den Schritt) |
| DEVELOPER | 6% Sodium Carbonate 0,0004% Natriumthiosulfat 0,05% Formalin | Bis die Färbung ausreichend ist, |
| Aufhören | 50% Methanol | 30 min |
| * 2 Stunden ist die minimale Zeit für die Protein Fixierung erforderlich |
Tabelle 1.
HINWEIS: Protein-Spots kann durch Färbung Gele mit MS-kompatiblen Silberfärbung 11 visualisiert werden. Alle Lösungen erforderlichfür die Silberfärbung sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Bereiten Sie etwa 200 ml jeder Lösung / Gel und gehen Sie wie in Tabelle 1 angegeben. Jede Lösung der Färbung Feld mit dem Gel vorsichtig hinzuzufügen. Führen Sie alle Inkubationen auf einem Schaukel Plattform.
- Nach der Färbung, entfernen Sie die Stopp-Lösung und lassen Sie das Gel in einer Lösung von 1% Essigsäure, bis die Erfassung.
2.4) Gel-Akquisition und Analyse
- Erwerben Sie Bilder mit einer hohen Auflösung mit einem Densitometer innerhalb von 3 Tagen von der Färbung.
- Analyse 2-D-Proteinmustern unter Verwendung von Software für die 2-DE Gelen.
Hinweis: Die Software ermöglicht eine schnelle und zuverlässige Bildvergleich.- Erstellen Sie ein Projekt, indem Sie "ein neues Projekt erstellen" aus dem Kontextmenü. Erstellen Sie einen Ordner und die Gele importieren, indem Sie "Import-Gel-Bilder" mit TIF, PNG. oder .gel Erweiterung.
- Nachdem die Gele werden importiert und auf den worksp hinzugefügtAss, führen Sie eine automatisierte Spot Detection, indem Sie die Gele für Spot-Erkennung und Auswahl von "Bearbeiten> Ort> erkennen" im Menü.
- Als nächstes führen Sie eine Hintergrundabzug, indem Sie aus dem Menü "subtrahieren Hintergrund". Hinweis: Danach ist es möglich, mehrere Gelen zu vergleichen und Unterschiede oder Ähnlichkeiten durch quantitative und / oder qualitative Analyse zu erfassen.
3. Proteinidentifizierung mittels MALDI-TOF MS-Analyse (Figur 3)
3.1) Proteinverdauung
- Spülen Sie das Gel mit Wasser und Verbrauch Flecken von Interesse aus Gelen entweder durch manuelle (Schneiden mit einem sauberen Skalpell) oder durch automatische Exzision.
- Waschen Gel-Teilchen mit Wasser (100-150 ul), Spin-down (30 s bei 400 × g) und entfernen Sie die Flüssigkeit.
- Das gleiche Volumen (je nach Gelvolumen) von CH 3 CN zu den Gelstückchen und warten 10-15 Minuten, bis die Gelstücke schrumpfen. Trocknen Sie die Gel-Teilchen ina Vakuumzentrifuge.
- Fügen 75-100 ul 10 mM Dithioerythritol in 50 mM NH 4 HCO 3 verdünnt und Inkubation für 30 min bei 56 ° C (Reduktionsschritt). Schrumpfen wieder die Gel-Stücke mit CH 3 CN, wie in Schritt 3.1.3 beschrieben.
- Weiter mit Alkylierung durch Zugabe von 75-100 ul einer Lösung, 55 mM Iodacetamid, verdünnt in 50 mM NH 4 HCO 3 und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Schrumpfen die Gel-Stücke noch einmal mit CH 3 CN mit genügend Volumen, um das Gel Stücke abdecken, wie in Schritt 3.1.3 beschrieben. Trocken in einer Vakuumzentrifuge.
- Rehydrieren der Teilchen in einem Puffer mit 25 mM NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl 2 und 12,5 ng / ul Trypsin bei 4 ° C für 20 min. Verwenden Sie ausreichend Puffervolumen, um die Gel-Stücke zu decken. Entfernen Sie die un-absorbiert Stand von den Gel-Stücke und fügen Sie 25 mM NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl 2 ohne Trypsin zu cover das Gel.
- Lassen Proben bei 37 ° C mindestens 3 Stunden (die minimale Zeit für die Peptidverdauung erforderlich) über Nacht.
3.2)-Massenspektrometrie-Analyse (Getrocknete Tröpfchentechnik)
- Spot 1 ul-Aliquot jeder Probe auf eine Edelstahlplatte MALDI und mischen mit 1 ul α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure als Matrix, in 50% CH 3 CN und 0,1% TFA hergestellt.
- Massenspektren zu erhalten, auf einem MALDI-TOF-Massenspektrometer. Akkumulieren etwa 200 Spektren pro Spot, die Anpassung der Laserintensität an Signalsättigung zu verhindern oder um das Signal zu erhöhen. Prozess-Spektren über Daten-Explorer-Software wie unten beschrieben:
- Importieren Sie die DAT-Datei und führen Sie die Basislinienkorrektur, indem Sie "Prozess> Basislinienkorrektur". Kalibrieren Massen mit den Trypsin Autolyse Produkte und Matrix Spitzen, indem Sie "Prozess> Massenkalibrierung> manuelle Kalibrierung; Wählen Gipfel in der Nähe von m / z 855,1 und 2163,1 by links verschieben, und wählen Sie die entsprechenden Bezugsmassen, klicken Sie dann auf "Handlung" und "Kalibrierung anwenden" im Handbuch Kalibrierungsfenster.
- Stellen Sie die Schwelle für Spitzenerkennung ("peak> Spitzenerkennung"), duplizieren Sie die aktive trace ("Anzeige> Duplizieren aktive Trace"), wählen Sie die neue Spur und führen Sie die deisotoping ("peak> deisotoping"). Mit dem Makro "getpeaklist", erzeugen eine Liste der Massen für die Identifizierung verwendet werden. Falls erforderlich, manuell Rauschsignale als Peaks, um die Liste zu reinigen und eine bessere Identifikation abgeholt entfernen.
- Identifizieren Proteine, die von der Suche nach einem umfassenden nicht-redundanten Proteindatenbank mit tiefen und Maskottchen als 12 Suchmaschinen.
- Verwenden Sie die folgenden Parameter in allen Suchanfragen: eine verpasste Spaltung pro Peptid, Methionin-Oxidation als variable Modifikation, Cystein Carbamidomethylierung als feste Modifikation und einer Initial Massentoleranz von 50 ppm.
4. Cytoskeletal Aktivitätstests (Abbildung 4)
HINWEIS: Die Zellen in Schritt 1 in komplettem RPMI (10 6 Zellen / 200 ul) gereinigt.
4.1) Migration Assay. Dieser Test ermöglicht die Quantifizierung der Migrationsfähigkeit der untersuchten Zellen (Lymphozyten). Verwenden Sie ein Transwell-Kammer von 6,5 mm Durchmesser und 5,0 um Porengröße und führen den Test in dreifacher Ausfertigung. Optimierung der Porengröße und der Wanderungszeit (Schritt 4.1.3) im Fall von verschiedenen Zelltypen.
- Bereiten Sie die untere Kammer durch Zugabe von 600 ul vollständigem RPMI mit oder ohne bestimmte Reize (dh SDF-1), um die induzierte und spontane Migration bzw. messen.
- Legen Sie die obere Kammer auf sie und lassen Sie das System ins Gleichgewicht für 30 Minuten bei 37 ° C in den Brutschrank.
- Samen 10 6 Zellen / 200 ul in die obere Kammer (Gesamtzellzahl) und inkubierendie Platte für 4 Stunden bei 37 ° C im Brutschrank.
- Entfernen Sie die obere Kammer, sammeln Sie die Medien in der unteren Kammer und die untere Kammer waschen einmal mit 1 ml PBS. Sammeln Sie die PBS in die Röhre.
- Zentrifuge 5 Minuten bei 300 g, den Überstand verwerfen und resuspendieren in 500 ul PBS.
- Durch Durchflusszytometrie, zählen die Anzahl der migrierten Zellen nach 1 min des Erwerbs. Im Fall einer isolierten Zellpopulation ist es nicht notwendig, irgendeine Oberflächen-Antikörper hinzuzufügen. Überprüfen Sie die Anzahl von Zellen in einem zweidimensionalen Punktediagramm unter Berücksichtigung der Streuungen der Seite der Zellen und die Anzahl der Ereignisse in 1 min, was die Anzahl für die Berechnung zu verwenden ist, visualisiert.
- Berechnen Sie die Migration Index (MI) als:
4.2) Die Haftung Assay. Dieser Assay ermöglicht die Messung der Haftfähigkeit der Zellen. Führen Sie den Test in dreifacher Ausfertigung.
- Pre-Mantel 96-WELls Platte (Flachboden) mit 50 ul / von entweder 2% BSA-PBS (als Hintergrund) oder 1 ug ICAM-1 in PBS verdünnt, über Nacht bei 4 ° C.
- Zweimal waschen der Platte mit PBS und Blockieren nicht-spezifischen Stellen durch Zugabe von 2% BSA-PBS (100 ul / Vertiefung) für 1 h bei 37 ° C aufweist.
- In der Zwischenzeit Die Zellen bei 5 x 10 6 / ml in komplettem RPMI, beschriften Sie sie mit 1 mM CMFDA-grüne Zelle Tracker und Inkubation 30 min bei 37 ° C.
- 1 x 10 6 Zellen / Vertiefung zu den vorbeschichteten Vertiefungen nach Verwerfen der Blockierungslösung (Schritt 4.2.2), Inkubation 1 h bei 37 ° C aufweist.
- Quantifizieren Haftung durch Verwendung eines ELISA-Lesegerät (Anregungsfilter: 485 nm, Emissionsfilter: 535 nm). Führen Sie eine erste Messung auf die Gesamt Eingang (INPUT).
- Vorsichtig waschen Sie die Platte mit 2% BSA-PBS (200 ul / Vertiefung) 4-mal (x). Durchführen einer Lese der Platte nach jedem Waschschritt (Adhäsion x).
- Nach Abzug des Hinter für jede Messung, Berechnung spezifischen ADHESIon (Adhäsion):
4.3) Polymerisation Assay. Dies ist ein kolorimetrischer Test, der F-Aktin-Polymerisation quantifiziert. Führen Sie den Test in dreifacher Ausfertigung.
- Resuspendieren 1x10 ^ 6 Zellen in 100 ul vorgewärmtes komplettem RPMI und fügen den spezifischen Stimulus (dh α-IgM 20 ug / ml) für 10 min.
- Stoppen Sie die Reaktion mit 400 ul 4% Paraformaldehyd und fixieren Zellen für 10 min bei RT.
- 3 x waschen mit PBS (Zentrifuge bei 300 × g für 5 min, 4 ° C).
- Überstand verwerfen und die Zellen mit PBS permeabilisiert-Saponin 0,2% (200 ul) auf Eis für 2 min.
- 3-mal mit PBS-0,1% Saponin waschen (Zentrifuge bei 100 × g für 5 min, 4 ° C), der Überstand verworfen und Resuspendieren in 100 ul PBS-Saponin 0,1%.
- Fleck mit Phalloidin-AlexaFluor 488 (3 ug / ml) für 30 min bei Raum temperatur in der Dunkelheit.
- Mit PBS-Saponin 0,1% 3 x waschen. Überstand verwerfen und resuspendieren in 300 ul PBS.
- Quantifizierung der Menge an F-Aktin durch Durchflusszytometrie, Berechnen des Mittel Fluorescence Intensität (MFI) der Phalloidin. Analysieren Sie die erzeugten Daten in einer einzigen Dimension Grundstück, um ein Histogramm auf der Basis der Fluoreszenzintensität zu erzeugen, wird die MFI-Wert in der Grafik Berichts.
- Messen F-Aktin-Polymerisation (Δ F-Aktin) als:
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Representative Results
Wir isolierten primären leukämischen B-Zellen bilden PB von CLL-Patienten, und wir Proteom-Karten analysiert. Proben (n = 104) wurden in zwei Hauptuntergruppen eingeteilt, basierend auf den klinischen Merkmale der einzelnen Patienten (schlechte Prognose vs gute Prognose) und die vergleichende Analyse der 2DE Gelen durchgeführt wurde.
Die Analyse ermöglichte die Identifizierung von Flecken differentiell zwischen den beiden Teilmengen ausgedrückt (in der Bezeichnung der Gegenwart / Abwesenheit oder Verschiebung auf dem Gel, was auf Veränderungen der post-translationalen Modifikationen, n ≈ 16). Wir geschnitten ausgewählten Stellen aus den 2DE Gelen und nach reduziert und alkyliert wurden die Proteine mit Trypsin und Peptide, die in dem resultierenden Überstand verdaut wurden auf eine MALDI-Platte aufgetragen. Spektren wurden in einem MALDI-TOF Voyager DE erworben. Die daraus resultierende Peak-Liste wurde auf MASCOT und tiefe eingereicht. Massen innerhalb eines bestimmten Massentoleranz zugewiesen werden, um Sequenzen in der Datenbank Peptid und dann zusammengebaut in ein Protein, von dem angenommen wirdidentifiziert, wenn er geht eine gewisse Wahrscheinlichkeit Score (Abbildung 3). Durch diese Analyse haben wir festgestellt Proteine hauptsächlich in Zytoskelett Aktivität und Stoffwechselprozesse (unveröffentlichte Daten) beteiligt.
Unter ihnen haben wir uns auf hämatopoetischen Abstammungslinien-zellspezifischen Protein-1 (HS1), dessen Differential-Phosphorylierung stark mit dem klinischen Verlauf der Krankheit verbunden (Figur 4). Insbesondere haben wir festgestellt, dass Patienten, die ein einzelner Punkt (n = 44, hyper-phosphoryliert HS1) erleben einen schlechten klinischen Ergebnis, während Patienten mit 2 Punkten (n = 60, hypo phosphoryliert HS1) haben gute Prognose 13 (Abbildung 4 ). Die Anwesenheit des HS1-Proteins in den Flecken wurde dann durch Immunoblotting der 2DE-Gel mit einem monoklonalen Antikörper gegen HS1 13 validiert.
Da bekannt ist, dass HS1 in Zytoskelett-Remodeling beteiligt 14, in vitro-Assays zu testen, führten wir if der HS1 Phosphorylierung könnte unterschiedlich beeinflussen Zytoskelett-Aktivität in den beiden Untergruppen CLL (gut vs schlechte Prognose). Wir fanden, dass CLL-Zellen, die HS1 als einer Stelle eine Beeinträchtigung des Zytoskeletts Aktivität in Bezug auf Migration, Adhäsion und Aktin-Polymerisation, im Vergleich zu hypo-phosphoryliert-HS1 Proben, was erklärt, eine andere klinische Verhalten 15 (Abbildung 5).
Figur 1.: Arbeits von Leukämiezellreinigung von PB Blut von CLL-Patienten wird in ein 15 ml-Rohr (1), die menschliche B-Zellen-Anreicherungscocktail auf die Probe (2) zugegeben und für 20 Minuten inkubiert. Blut wird dann mit PBS in einem Verhältnis von 1: 1 verdünnt und auf die Oberseite des Dichtegradienten (3) festgelegt. Anschließende Zentrifugation Probe (4) ermöglicht die Bildung von Mehrfach l Ayers: a) Plasma, b) B-Lymphozyten, c) Ficoll, d) rote Blutkörperchen und unerwünschte Zellen. Gereinigt B-Lymphozyten (B-Schicht) werden dann gesammelt (5), gewaschen und Reinheit der Zellpräparation mittels Durchflusszytometrie (6) analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2.: Arbeits 2DE Das Pellet wird in Puffer 2DE (1) gelöst und auf die IPG-Streifen für die erste Dimension Lauf (2-Isoelektrofokussierung) geladen. Nach Äquilibrierung wird das Band auf einem Gradienten-Polyacrylamid-Gel für die zweite Dimension Lauf (3-SDS-PAGE) geladen. Das Gel wird dann gefärbt, um Flecken zu visualisieren / Proteinen (4). Nach hochauflösenden Bildaufnahme, werden Proteom-Karten analysiert (5). les / ftp_upload / 51942 / 51942fig2highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3: Arbeitsablauf der MS-Analyse (1) Spots von Interesse aus dem 2D-Gel mit einem Skalpell ausgeschnitten und in ein sauberes Röhrchen überführt.. (2) Nach der reduzierten und alkylierten, werden Proteine mit Trypsin verdaut werden Peptide in dem resultierenden Überstand auf eine MALDI-Platte (3) entdeckt. Spektren sind in einem MALDI-TOF Voyager DE erworben. (4) Der resultierende Peakliste auf MASCOT und tiefe Suchmaschinen vorgelegt und suchte gegen eine umfassende nicht-redundanten Proteindatenbank. (5) Messen innerhalb eines bestimmten Massentoleranz an Peptidsequenzen in der Datenbank zugeordnet ist, anschließend in einem Protein zusammengesetzt. target = "_blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4: HS1 Phosphorylierung korreliert mit der Prognose von CLL-Patienten (1) Der Kreis identifiziert zwei enge Stellen mit der gleichen Molekularmasse (Mr) von 79 kDa und unterschiedlichen isoelektrischen Punkt (pI) von 4,83 und 4,86 jeweils die von identifiziert wurde. MS als HS1-Protein (2). (2) Zwei repräsentative Gele von einer schlechten Prognose (rotes Quadrat) und eine gute Prognose CLL-Patienten (grünes Quadrat). (3) Kaplan-Meier-Kurven zeigen kumulative Überleben der CLL-Patienten nach HS1 Phosphorylierung Muster gruppiert (Platz 1, n = 44, 2 vs Flecken, n = 60). Patienten mit Platz 2 (grüne Punkte) haben eine deutlich längere Überlebens (mediane Überlebens nicht erreicht) als solche mit nur einer (rote Punkte)./files/ftp_upload/51942/51942fig4highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: HS1 Phosphorylierung Einflüsse Zytoskelett-Funktionalität in CLL Primärproben (1) Migration auf Transwell Primärproben in Gegenwart oder Abwesenheit von SDF-1.. In der Grafik sind die Mittel SEM der Anzahl der Zellen in 1 Minute am Durchflusszytometer (n = 7 von 1 Stelle HS1 vs n = 12 von Platz 2 HS1) erworben angezeigt. (2) Die spontane Adhäsion wurde nach Markierung von Zellen und 1-stündiger Inkubation in 96-Well-Platten gemessen. Angezeigt werden, sind die Mittel für SEM Primärproben (n = 7 von 1 Stelle HS1 vs n = 12 von Platz 2 HS1). (3) F-Aktin-Polymerisation Fähigkeit von Einzelproben. Angezeigt werden, sind die Mittel SEM der relativen F-Actin-Fortsetzungent von CLL-Zellen nach Stimulation mit SDF-1 und Färbung mit FITC-markiertem Phalloidin (n = 5 von Platz 1 HS1 vs n = 5 von Platz 2 HS1). MFI: mittlere Fluoreszenzintensität. Das Histogramm darstellen, wie beispielsweise der Probennahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Ziel dieses Manuskript ist, um ein optimiertes Protokoll für die Identifizierung von Molekülen in der Pathogenese der CLL beteiligt zu beschreiben, auch wenn dieser Ansatz auf andere Krankheiten und / oder anderen Probentypen 16-18 verlängert werden. Durch Vergleich der proteomischen Profile 2 Untergruppen von CLL-Patienten gut gegen schlechte Prognose 19 zeigten wir, dass sie sich in der Phosphorylierung von HS1 und dessen Aktivierung das Wandern und Haftfähigkeit von Leukämiezellen.
In Bezug auf andere Verfahren der Hauptvorteil der Proteomiktechniken im Manuskript 2DE Gel und MS dargestellt, ist, dass sie einen vollständigen Fingerabdruck der Zelle Proteom und vor allem sie Informationen über die post-translationale Modifikationen von Proteinen ergeben. Proteine, die unterschiedlich phosphoryliert oder glykosyliert sind verändern ihre Position im Gel, und wahrscheinlich ihre Aktivität in den Zellen verändern.
ove_content "> Darüber hinaus haben wir beschrieben, Protokolle für die Bewertung der Migration und Adhäsion Zellen, die verwendet wurden, um Zytoskelett-Funktionalität zu testen, werden diese Protokolle immer noch schlecht für in Suspension wachsenden Zellen beschrieben, da sie üblicherweise auf anhaftende Zellen angewandt (zB Wundheilungs .) Der große Einschränkung der 2DE und MS-Technik ist die Menge der Zellen / Proteine (≈25 x 10 6 Zellen pro Gel), während für funktionelle Assays ist die Lebensfähigkeit der Zellen. Die eigentliche Herausforderung ist es, auf der primären Zellen arbeiten , aber für viele Krankheiten ist es nicht möglich, eine ausreichende Anzahl von Zellen oder lebende Zellen, diese Experimente zu erreichen, in diesem Fall, wenn vorhanden, ist es möglich, Zelllinien zu verwenden.Der wichtigste Schritt für die MS-Protokoll ist in saubere (Keratin frei) Bedingungen, um Kontaminationen zu vermeiden und klare Proteinidentifikation zu erhalten zu arbeiten. Zytoskelett-Tests sind in der Regel schwer zu reproduzieren (vor allem auf den erstenRY-Zellen), so wird vorgeschlagen, den Versuch dreifach durchgeführt.
Wie wir gezeigt haben, die Kombination der Ansätze in diesem Manuskript vorgelegt hilft bei der Identifizierung neuer Wege in verschiedenen Erkrankungen beteiligt, wodurch die Entdeckung neuer therapeutischer Targets, wie wir für HS1 Protein 19 gezeigt haben.
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Acknowledgments
Wir danken dem malignen Lymphomen Einheit, Elisa ten Hacken, Lydia Scarfò, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, und Angela Cattaneo.
Dieses Projekt wurde unterstützt von: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant und Special Program Molecular Clinical Oncology - 5 Promille # 9965)
CS und BA entwarf die Studie durchgeführt, die Versuche, die Daten analysiert und schrieb das Manuskript. MTSB, UR, FBPR des Manuskriptes unterstützt. PG und FCC entwickelt die Studie vorgesehenen Patientenproben und klinischen Daten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
References
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