Summary
Her beskriver vi en protokol, der kobler to proteomiske teknikker, nemlig 2-dimensional elektroforese (2DE) og massespektrometri (MS), til at identificere differentielt udtrykte / posttranslationelle modificerede proteiner blandt to eller flere grupper af delprøver. Denne fremgangsmåde, sammen med funktionelle eksperimenter, muliggør identifikation og karakterisering af prognostiske markører / terapeutiske mål.
Abstract
Identifikationen af molekyler, der er involveret i tumor initiering og progression er fundamental for forståelsen sygdom biologi og som følge heraf for den kliniske behandling af patienterne. I det foreliggende arbejde vil vi beskrive en optimeret proteomisk fremgangsmåde til identifikation af molekyler, der er involveret i progressionen af kronisk lymfatisk leukæmi (CLL). I detaljer er leukæmiske cellelysater løst ved 2-dimensional elektroforese (2DE) og visualiseret som "pletter" på 2DE geler. Sammenlignende analyse af proteom kort muliggør identifikation af differentielt udtrykte proteiner (i form af overflod og post-translationelle modifikationer), der er plukket, isoleret og identificeret ved massespektrometri (MS). Den biologiske funktion af de identificerede kandidater kan testes ved forskellige assays (dvs. migrering, adhæsion og F-actin-polymerisationsbetingelser), som vi har optimeret til primære leukæmiske celler.
Introduction
Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL), den mest almindelige voksne leukæmi i de vestlige lande, stammer fra ophobning af monoklonale neoplastiske CD5- + B-lymfocytter og er klinisk meget heterogen. Det kan være til stede som en præ-leukæmisk form defineret som monoklonale B-celle lymfocytose (MBL) 1,2,3. I andre tilfælde kan sygdommen stå enten med en indolent klinisk forløb, der kan forblive stabilt i årevis, før brug for behandling, eller som en progressiv chemorefractory sygdom med dystre prognose trods behandling. Endelig kan det udvikle sig til en ofte dødelig høj kvalitet lymfom (Richters syndrom-RS) 2,3,4. Patienterne er normalt klassificeret i to undergrupper: gode og dårlige prognose, baseret på et sæt af prognostiske faktorer, der giver supplerende oplysninger om prædiktorer for sygdom prognose og overlevelse. Klinisk heterogenitet sandsynligvis afspejler biologiske heterogenitet. En række genetiske, microenvironmental og cellular faktorer har vist sig at tilslutte sygdom patogenese selv er blevet fundet 5 ingen samlende mekanismer. I detaljer, har flere undersøgelser vist, at forskelle i det kliniske forløb af sygdommen kan delvis forklares ved tilstedeværelsen (eller fraværet) af nogle biologiske markører, som har en prognostisk værdi 6,7,8. Disse data viste, at en bedre forståelse af sygdommen biologi kunne give yderligere hints til den kliniske behandling af patologi ved kortlægningen af både prognostiske markører og terapeutiske mål.
Målet med nærværende dokument er at vise, hvordan en kombination af forskellige proteomiske teknikker kan anvendes til identifikation af proteiner involveret i CLL debut og progression. Vores tilgang viser, at det er muligt at slutte sig sammen grundlæggende proteomisk og kliniske data 5.
I den nuværende arbejdsgang, primære leukæmiceller fra udvalgte patienter(God vs dårlig prognose) er isoleret og cellelysater derefter anvendes til opnåelse af proteom kort. 2DE tillader karakterisering af proteomisk profil af en cellepopulation, herunder post-translationelle modifikationer, hvilket giver en indirekte information om den biologiske aktivitet af hvert protein. Hele cellelysater klares ved en første dimension køre baseret på det isoelektriske punkt, efterfulgt af en anden dimension kørt på en polyacrylamidgel, der løser proteiner baseret på deres molekylvægt. Sammenlignende analyse af proteom kort muliggør identifikation af differentielt udtrykte proteiner (både med hensyn til tæthed og post-translationelle modifikationer) som pletter på gelen, der kan skæres og analyseres ved massespektrometri. Den rolle, som hver kandidat kan derefter udnyttes af forskellige assays.
Denne fremgangsmåde, som er begrænset til CLL i den nuværende manuskript, kan let udvides til andre sygdomme / prøver, hvilket giver information om proteomic / biologiske forskelle mellem to grupper (dvs. patologiske vs normal, stimuleret vs stimuleret, vildtype vs knockdown).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle vævsprøver blev opnået med godkendelse af Institutional Review Board San Raffaele Hospital (Milano, Italien).
1. humane vævsprøver og Cell Oprensning (figur 1)
BEMÆRK: leukæmiske lymfocytter blev opnået fra det perifere blod (PB) af CLL-patienter, diagnosticeret ifølge Mulligan m.fl. 9.
1.1) leukæmicellepopulationen Adskillelse fra PB
- Saml PB i vacutainer blodtagningsglas med Natriumheparin.
- Overfør blod i et 15 ml rør, og der tilsættes humane B-celle-berigelse cocktail på 50 ul / ml fuldblod. Bland godt og inkuberes 20 minutter ved stuetemperatur.
- Fortyndet prøve med et lige volumen af PBS + 2% FBS, bland forsigtigt og omhyggeligt overlay blod over Ficoll, at sørge for ikke at bryde grænsefladen. Brug mindst 1 del Ficoll til 2 dele af den fortyndede prøve (dvs. 4 ml Ficoll + 10 ml blod i et 15 ml tUbe).
- Der centrifugeres ved 400 xg ved stuetemperatur (20 ° C) i 20 minutter uden bremse. Mononukleære celler vil være ved grænsefladen.
- Aspireres forsigtigt grænsefladen at inddrive de celler og anbringes i et nyt rør. Vask cellerne en gang med PBS og centrifugeres ved 300 xg, 4 ° C i mørke i 5 minutter. Pelleten vil være nederst.
- Supernatanten kasseres. Resuspender pellet i den resterende supernatant ved at stille røret frem og tilbage med fingrene. Fortynd pelleten med 10 ml komplet RPMI-medium (RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt kalveserum og 15 mg / ml gentamicin) og tælle celler under anvendelse af trypanblåt udelukkelsesmetoden.
1.2) Renhed Evaluering
BEMÆRK: Renhed af alle forberedelser skal være altid over 99%.
- Inkuber 100 ul renset cellesuspension med følgende antistoffer (kommercielt tilgængelige, se tabel Materialer): CD3 FITC (5 gl / TESt), CD14 PE (5 ul / test), CD19 ECD (6 gl / test), CD16-CD56 PC5 (2 gl / test) CD5 PC7 (4 gl / test) i 20 min ved 4 ° C i en FACS-rør.
- Vask prøven med 4 ml PBS (centrifuge i 5 minutter ved 300 xg), og kontroller renheden ved flow cytometry.Check i plot% af CLL celler (> 99%), som coudtrykke CD19 og CD5 på deres overflade som vist i figur 1 (6). Sørg for, at forberedelserne er næsten blottet for NK, T-lymfocytter og monocytter ved at kontrollere% af CD3, CD14 og CD16-56 i plottet, som bør være nær nul.
1.3) Prøver Opbevaring
- For proteom undersøgelser, indsamle 25 x 10 6 celler i et 1,5 ml rør, centrifugeres cellerne ved 300 xg i 10 min, supernatanten og lyofiliseres piller i 4 timer. Opbevares ved -80 ° C indtil brug.
- Til validering assays, Resuspender cellerne i komplet RPMI (mængde afhænger af den videre analyse, der ervalgt), og fortsæt med trin 4.
2. To-dimensional elektroforese (2-DE) (figur 2)
2.1) isoelektrofokusering (IEF)
- Opløseliggøre CLL cells pellets med et slutvolumen på 380 ul 2-DE-puffer (344 pi af en RBthio opløsning (9 M urinstof, 10 mM Tris, 4% CHAPS), 30 pi 65 mM DTT, 6 pi 2% IPG buffer ampholin pH 4-7).
- Påfør proteinprøver (1 mg) til 18 IPG strimler (pH 4-7) og udfør IEF følgende standard protokol som beskrevet af Conti et al. 10
- Ækvilibrer strimler i 2 ml ækvilibreringspuffer (EB: 50 mM pH 8,8 Tris-HCl puffer indeholdende 6 M urinstof, 30% glycerol, 2% SDS), suppleret med 2% af frisk DTT i 15 minutter ved stuetemperatur. Kassér EB + DTT og tilsættes 2 ml EB suppleret med 2,5% Iodoacetamide. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur på en vippende platform.
2.2) SDS-PAGE
- Tør strimler på et papir uden at røre gelen for at fjerneoverskud af EB. Læg hver strimmel på toppen af en 9-16% gradient SDS-PAGE-gel. Tilføj et lille volumen SDS-elektroforese buffer (Tris 25 mM, glycin 192 mM, SDS 0,1% w / v) på toppen af gelen for at lette læsning af strimlen.
- Forsegl gelen ved tilsætning ~ 5 ml agaropløsning (0,8%) for at forhindre flydning af strimlen, derefter samle den elektroforetiske enhed og fyld med SDS-elektroforese-buffer. Udfør køre på 60 mA / gel i 4 timer ved 4 ° C.
- Fjern gelen fra elektroforetisk enhed og placere den i den rigtige farvning kassen.
2.3) sølvfarve til Præparativ Gel
| Fixer | 50% methanol 12% eddikesyre 0,05% formalin | 2 timer (eller natten over) * |
| Vaskebuffer | 35% Ehanol | 20 min (gentag tre gange) |
| Sensibiliserende | 0,02% Natriumthiosulfat | 2 min |
| VASK | H2O | 5 min (gentag tre gange) |
| SØLVNITRAT | 0,2% Sølvnitrat 0,076% formalin | 20 min |
| VASK | H2O | 1 min (gentag trin to gange) |
| UDVIKLER | 6% Natriumcarbonat 0,0004% Natriumthiosulfat 0,05% formalin | Indtil farvningen er tilstrækkelig |
| STOP | 50% methanol | 30 min |
| * 2 timer er den mindste tid, der kræves for protein fiksering |
Tabel 1.
BEMÆRK: Protein pletter kan visualiseres ved at farve geler med MS kompatibel sølvfarve 11. Alle løsninger er nødvendigtil sølvfarvning er anført i tabel 1.
- Forbered ca. 200 ml af hver opløsning / gel og fortsæt som angivet i tabel 1. Tilsættes forsigtigt hver enkelt løsning til farvningen kassen med gelen. Udfør alle inkubationer på en vippende platform.
- Efter farvningen fjernes stopopløsning og efterlade gelen i en opløsning af 1% eddikesyre, indtil overtagelsen.
2.4) Gel indsamling og analyse
- Anskaf billeder i høj opløsning ved hjælp af et densitometer inden for 3 dage fra farvning.
- Analyser 2-D protein mønstre ved hjælp af software til 2-DE-gelerne.
BEMÆRK: Softwaren giver mulighed for en hurtig og pålidelig billede sammenligning.- Opret et projekt ved at vælge "Opret et nyt projekt" fra genvejsmenuen. Opret en mappe og importere geler ved at vælge "import gelbilleder" med .tif .png. eller .gel forlængelse.
- Når geler importeres og lægges til workspes, udføre en automatiseret påvisning plet ved at vælge geler til påvisning stedet og vælge "edit> spot> opdage" i menuen.
- Næste, udføre en baggrund subtraktion ved at vælge fra menuen "Træk baggrund". Bemærk: Efter at det er muligt at sammenligne flere geler og at påvise forskelle eller ligheder ved kvantitativ og / eller kvalitativ analyse.
3. Protein Identifikation ved MALDI-TOF-MS-analyse (figur 3)
3.1) Protein Digestion
- Skyl gelen med vand og punktafgifter pletter af interesse fra geler enten ved manuel (skæring med en ren skalpel) eller ved automatiseret excision.
- Vask gelpartiklerne med vand (100-150 ul), spin ned (30 sekunder ved 400 xg) og fjern væsken.
- Tilføj en tilsvarende mængde (afhængig af volumen gelen) i CH3CN til gelstykkerne og vente i 10-15 min, indtil gelstykkerne skrumpe. Tør gelpartiklerne ina vakuumcentrifuge.
- Tilføj 75-100 pi 10 mM dithioerythritol fortyndet i 50 mM NH4 HCO 3 og inkuberes i 30 minutter ved 56 ° C (Reduktion Step). Shrink igen gelstykkerne med CH3CN som beskrevet i trin 3.1.3.
- Fortsæt med alkylering ved tilsætning af 75-100 ul af en opløsning 55 mM iodacetamid fortyndet i 50 mM NH4 HCO 3 og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Shrink gelstykkerne gang mere med CH3CN ved hjælp af tilstrækkelig volumen til at dække gelstykkerne som beskrevet i trin 3.1.3. Der tørres i en vakuumcentrifuge.
- Rehydrér partiklerne i en buffer indeholdende 25 mM NH4 HCO 3, 5 mM CaCl2 og 12,5 ng / pl trypsin ved 4 ° C i 20 min. Brug tilstrækkelig mængde buffer til at dække gelstykker. Fjern un-absorberede supernatant fra gelen stykker og tilsæt 25 mM NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl2 uden trypsin til covis gelen.
- Lad prøverne ved 37 ° C i mindst 3 timer (den minimale tid, der kræves til peptid fordøjelse) til natten over.
3.2) massespektrometrianalyse (tørret dråbe teknik)
- Spot 1 pi alikvot af hver prøve på en rustfri MALDI plade og blandes med 1 ml af α-cyano-4-hydroxykanelsyre som matrix fremstillet i 50% CH3CN og 0,1% TFA.
- Opnå massespektre på et MALDI-TOF-massespektrometer. Akkumulere omkring 200 spektre per plet, justere laser intensitet for at forhindre signalmætning eller øge signalet. Proces spektre via Data Explorer-softwaren som beskrevet nedenfor:
- Importer Dat fil og udføre baseline korrektion ved at vælge "proces> baseline korrektion". Kalibrer masser ved hjælp af trypsin autolyse produkter og matrix toppe ved at vælge "proces> masse kalibrering> manuel kalibrering; Vælg toppe tæt på m / z 855,1 og 2163,1 By forlod trække og vælg den tilsvarende referenceperiode masserne, og klik derefter på "Plot" og "anvende kalibrering" i manuel kalibrering vinduet.
- Justér tærsklen for topdetektion ("peak> topdetektion"), duplikere den aktive trace ("skærm> duplikere aktiv trace"), vælg den nye spor og udfører deisotoping ("peak> deisotoping"). Brug af makro "getpeaklist" generere en liste over masserne, der skal anvendes til identifikation. Hvis nødvendigt, fjernes støjsignaler plukket som toppe til at rengøre liste og få et bedre identifikation manuelt.
- Identificer proteiner ved at søge en omfattende ikke-redundante protein database ved hjælp af dybtgående og Mascot som søgemaskiner 12.
- Brug følgende parametre i alle søgninger: en forpasset spaltning pr peptid, methionin oxidation som variabel ændring, cystein carbamidomethylation som fast modifikation og en initial masse tolerance på 50 ppm.
4. cytoskeletale Aktivitet assays (figur 4)
BEMÆRK: Resuspender cellerne renset i trin 1 i komplet RPMI (10 6 celler / 200 ul).
4.1) Migration analysen. Denne test muliggør kvantificering af vandrende kapacitet af de analyserede celler (lymfocytter). Brug en transwell kammer på 6,5 mm i diameter og 5,0 um porestørrelse og udføre analysen i tre eksemplarer. Optimer porestørrelse og migration tid (trin 4.1.3) i tilfælde af forskellige celletyper.
- Forbered nedre kammer ved tilsætning af 600 pi af komplet RPMI med eller uden specifikke stimuli (dvs. SDF-1) til at måle den inducerede og spontane migrering hhv.
- Sæt det øvre kammer på den og lade systemet i ligevægt i 30 minutter ved 37 ° C i inkubatoren.
- Seed 10 6 celler / 200 ul i det øvre kammer (samlet celle nummer) og inkuberespladen i 4 timer ved 37 ° C i inkubatoren.
- Fjern det øverste kammer, indsamle medierne i det nedre kammer og vaske det nederste kammer en gang med 1 ml PBS. Saml PBS i røret.
- Centrifuger i 5 minutter ved 300 xg, supernatanten og resuspender i 500 pi PBS.
- Ved flowcytometri, tælle antallet af migrerede celler efter 1 min overtagelsestidspunktet. I tilfælde af en isoleret celle population er det ikke nødvendigt at tilføje enhver overflade antistof. Kontrollér antallet af celler i en bi-dimensional punktdiagram overvejer side scatters af celler og antallet af begivenheder visualiseret i 1 min, hvilket er antallet at anvende til beregning.
- Beregn Migration indeks (MI), som:
4.2) Adhæsion assay. Dette assay muliggør måling af vedhæftning kapacitet af cellerne. Udfør assayet in triplo.
- Pre-coat 96-wellls plade (fladbundede) med 50 gl / brønd af enten 2% BSA-PBS (som baggrund) eller 1 ug ICAM-1 fortyndes i PBS natten over ved 4 ° C.
- Vask pladen to gange med PBS og blokere ikke-specifikke steder ved tilsætning af 2% BSA-PBS (100 ul / brønd) i 1 time ved 37 ° C.
- I mellemtiden resuspender cellerne ved 5 x 10 6 / ml i komplet RPMI, mærke dem med 1 mM CMFDA-grøn celle tracker og inkuberes 30 minutter ved 37 ° C.
- Tilsæt 1 x 10 6 celler / brønd til de præ-coatede brønde efter bortkastning af blokerende opløsning (trin 4.2.2), og der inkuberes 1 time ved 37 ° C.
- Kvantificer vedhæftning ved hjælp af en ELISA-læser (excitationsfilter: 485 nm, emission filter: 535 nM). Udfør en første måling på det samlede input (input).
- Vask pladen forsigtigt med 2% BSA-PBS (200 ul / brønd) 4 gange (x). Udfør en læsning af pladen efter hver vask trin (Vedhæftning x).
- Efter baggrundssubtraktion for hver måling, beregne specifikke ADHESion (ADHESION):
4.3) polymerisation assay. Dette er en kolorimetrisk assay, der kvantificerer F-actin-polymerisation. Udfør assayet in triplo.
- Resuspender 1x10 ^ 6 celler i 100 pi forvarmet komplet RPMI og tilføje den specifikke stimulus (dvs. α-IgM 20 ug / ml) i 10 min.
- Stop reaktionen med 400 pi 4% paraformaldehyd og løse celler i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask 3 gange med PBS (centrifugeres ved 300 xg i 5 min, 4 ° C).
- Supernatanten fjernes, og permeabiliserer celler med PBS-saponin 0,2% (200 ul) på is i 2 min.
- Vask 3 gange med PBS-saponin 0,1% (centrifuge ved 100 xg i 5 min, 4 ° C), supernatanten og resuspender i 100 ul PBS-saponin 0,1%.
- Farv med phalloidin-AlexaFluor 488 (3 ug / ml) i 30 minutter ved stuetemperatur temperatur i mørke.
- Vask 3 gange med PBS-0.1% saponin. Bortkast supernatanten og resuspender i 300 pi PBS.
- Kvantificere mængden af F-actin ved flowcytometri, beregne middelværdien Florescence Intensitet (MFI) i phalloidin. Analyser af de genererede data i en enkelt dimension plot for at frembringe et histogram baseret på fluorescensintensitet, er MFI-værdi, der vises i grafen rapport.
- Mål F-actin-polymerisation (Δ F-actin), som:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi isolerede primære leukæmiske B-celler danner PB af CLL-patienter og analyseret vi proteom kort. Prøver (n = 104) blev samlet i to undergrupper baseret på de kliniske træk ved hver patient (dårlig prognose vs god prognose) og sammenlignende analyse af 2DE geler blev udført.
Analysen tilladt identifikation af pletter differentielt udtrykte mellem de to delmængder (på sigt af tilstedeværelse / fravær eller skift på gelen, hvilket indebærer ændringer i post-translationelle modifikationer n ≈ 16). Vi udskåret udvalgte pletter fra 2DE geler og efter at blive reduceret og alkyleret, blev proteiner fordøjet med trypsin, og peptider i den resulterende supernatant blev spottet på en MALDI plade. Spectra er erhvervet i en MALDI-TOF Voyager DE. Den resulterende peak liste blev forelagt MASCOT og dyb. Masse inden for en bestemt masse tolerance tildelt peptid sekvenser i databasen, og derefter samles til et protein, der betragtes somidentificeret, hvis det passerer en vis sandsynlighed score (figur 3). Ved denne analyse identificerede vi proteiner hovedsageligt involveret i cytoskeletal aktivitet og metaboliske processer (upublicerede data).
Blandt dem har vi fokuseret på hæmatopoietisk-slægt-celle-specifikke protein-1 (HS1), hvis forskellen phosphorylering stærkt forbundet med det kliniske forløb af sygdommen (Figur 4). Især har vi fundet, at patienter, der bærer en enkelt plet (n = 44, hyper-phosphorylerede HS1) opleve en dårlig klinisk resultat, mens patienter med 2 spots (n = 60, hypo-phosphoryleret HS1) har god prognose 13 (figur 4 ). Tilstedeværelsen af HS1 protein i pletterne blev derefter valideret ved immunoblotting af 2DE gelen med et monoklonalt antistof mod HS1 13.
Da det er kendt, at HS1 er involveret i cytoskelet remodeling 14, udførte vi in vitro-assays til at teste if HS1 phosphoryleringsstatus kunne differentielt påvirker cytoskeletal aktivitet i de to CLL delmængder (god vs dårlig prognose). Vi fandt, at CLL celler, der bærer HS1 som en plet har en forringet cytoskeletal aktivitet i form af migration, vedhæftning og actinpolymerisation sammenlignet med hypo-phosphoryleret-HS1 prøver, hvilket forklarer en anden klinisk adfærd 15 (figur 5).
Figur 1:. Arbejdsgang af leukæmisk celle oprensning fra PB Blod fra CLL-patienter overføres til et 15 ml rør (1), er human B-celle-berigelse cocktail tilsat til prøven (2) og inkuberes i 20 minutter. Blod fortyndes derpå med PBS i forholdet 1: 1 og lagt på toppen af densitetsgradient (3). Efterfølgende prøve centrifugering (4) tillader dannelsen af multipel l Ayers: a) plasma, b) B-lymfocytter, c), Ficoll, d) røde blodlegemer og uønskede celler. Renset B-lymfocytter (B Layer) opsamles derefter (5), vasket og renhed cellepræparat analyseres ved flowcytometri (6). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Arbejdsgang af 2DE Pelleten opløses i 2DE puffer (1), og fyldt på IPG strip til den første dimension løb (2-isoelektrofokusering). Efter ækvilibrering strimlen lagt på toppen af en gradient polyacrylamidgel for den anden dimension løb (3-SDS-PAGE). Gelen farves derefter at visualisere pletter / proteiner (4). Efter billedoptagelse høj opløsning, er proteom kort analyseres (5). les / ftp_upload / 51942 / 51942fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Workflow af MS-analyse (1) Steder af interesse er udskåret fra 2D-gel med en skalpel og overført til et rent rør.. (2) Efter at blive reduceret og alkyleret, proteiner fordøjet med trypsin peptider i den resulterende supernatant plettet på en MALDI plade (3). Spectra er erhvervet i en MALDI-TOF Voyager DE. (4) Den resulterende peak Listen forelægges for MASCOT og dyb søgemaskiner og søgte mod en omfattende ikke-redundante protein database. (5) Masse inden for en bestemt masse tolerance tildelt peptidsekvenser i databasen, derefter samles i et protein. target = "_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: HS1 phosphoryleringsstatus korrelerer med prognose af CLL-patienter (1) cirkel identificerer to tætte pletter med samme molekylmasse (Mr) på 79 kDa og forskellige isoelektriske punkt (pi) på 4,83 og 4,86 hhv, der blev identificeret ved. MS som HS1 protein (2). (2) To repræsentative geler af en dårlig prognose (rød firkant) og en god prognose CLL-patienter (grøn firkant). (3) Kaplan-Meier kurver viser kumulativ overlevelse CLL-patienter grupperet efter HS1 phosphoryleringsmønstret (1 spot, n = 44, vs 2 spots, n = 60). Patienter med 2 spot (grønne prikker) har en signifikant længere overlevelse (median overlevelse ikke nået) end dem med kun én (røde prikker)./files/ftp_upload/51942/51942fig4highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: HS1 phosphoryleringsstatus påvirkninger cytoskeletal funktionalitet i CLL delprøver (1) Migration om transwell af delprøver i nærvær eller fravær af SDF-1.. I grafen vises midler SEM af antallet af celler, der er erhvervet i 1 minut ved flowcytometeret (n = 7 1 spot HS1 vs n = 12 2 plet HS1). (2) Spontan adhæsion blev målt efter cellemærkning og 1 times inkubation i 96-brønds plader. Vist er det middel SEM for delprøver (n = 7 1 spot HS1 vs n = 12 af 2 plet HS1). (3) F-actinpolymerisation evne af delprøver. Vist er det middel SEM af den relative F-actin content af CLL-celler efter stimulering med SDF-1 og farvning med FITC-mærket phalloidin (n = 5 1 stedet HS1 vs n = 5 2 plet HS1). MFI: Middel Fluorescens intensitet. Histogrammet repræsenterer som eksempel på erhvervelse prøve. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med dette manuskript er at beskrive en optimeret protokol til identifikation af molekyler, der er involveret i patogenesen af CLL, også selv om denne fremgangsmåde kan udvides til andre sygdomme og / eller andre prøvetyper 16-18. Ved at sammenligne proteomik profiler af 2 undergrupper af CLL-patienter, god vs dårlig prognose 19, vi viste, at de adskiller sig i phosphorylering status HS1 og at dens aktivering påvirker migration og vedhæftning kapacitet leukæmiceller.
Med hensyn til andre metoder, den største fordel ved proteomik teknikker præsenteres i manuskriptet, 2DE gel og MS, er, at de leverer en komplet fingeraftryk af cellen proteomet og vigtigst de giver oplysninger om de post-translationelle modifikationer af proteiner. Proteiner, der er differentielt phosphoryleret eller glycosyleret ændre deres position i gelen, og sandsynligvis ændre deres aktivitet i cellerne.
ove_content "> Desuden beskrev vi protokoller til evaluering af cellernes migrering og adhæsion, der blev brugt til at teste cytoskelet funktionalitet disse protokoller er stadig dårligt beskrevet for celler, der vokser i suspension, da de almindeligvis anvendes til adhærente celler (f.eks sårheling ). Den største begrænsning af 2DE og MS teknik er mængden af celler / proteiner (≈25 x 10 6 celler pr gel), mens det for funktionelle assays er det levedygtigheden af cellerne. Den virkelige udfordring er at arbejde på primære celler , men for mange sygdomme er det ikke muligt at nå et tilstrækkeligt antal celler eller levende celler til at udføre de eksperimenter, i dette tilfælde, hvis de er tilgængelige, er det muligt at anvende cellelinier.Den mest kritiske skridt for MS-protokollen er at arbejde i rene (keratin free) betingelser for at undgå forurening og til at få klare protein identifikation. Cytoskeletale analyser er normalt vanskelige at reproducere (især på primary celler), hvorfor det foreslås at udføre eksperimentet i tre eksemplarer.
Som vi har demonstreret, at kombinationen af de metoder, der præsenteres i denne manuskript hjælper i identifikation af nye veje, der er involveret i forskellige sygdomme, hvilket giver mulighed for opdagelse af nye terapeutiske mål, som vi har vist for HS1-protein 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker lymfoide maligne sygdomme Unit, Elisa ti Häcken, Lydia Scarfo Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi og Angela Cattaneo.
Dette projekt blev støttet af: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant og Special Program Molekylær Klinisk Onkologi - 5 promille # 9965)
CS og BA designet undersøgelsen, udførte forsøgene, analyserede data og skrev manuskriptet. MTSB, UR, FBPR assisteret skriftligt manuskriptet. PG og FCC designet patienternes undersøgelse forudsat prøver og kliniske data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
References
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).
- Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. Monoclonal B lymphocytosis in the general population. Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).
- Fazi, C., et al. General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL. Blood. 118, 6618-6625 (2011).
- Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in cancer biology. , (2013).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94, 1840-1847 (1999).
- Lanham, S., et al. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 101, 1087-1093 (2003).
- Wiestner, A., et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood. 101, 4944-4951 (2003).
- Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood. 113, 6496-6497 (2009).
- Conti, A., et al. Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers. J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).
- Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).
- Zhang, W., Chait, B. T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).
- Scielzo, C., et al. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).
- Muzio, M., et al. HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).
- Scielzo, C., et al. HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells. Blood. 116, 3537-3546 (2010).
- Kashuba, E., et al. Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen. J Proteomics. 91, 478-485 (2013).
- Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. The ongoing evolution of proteomics in malignancy. Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).
- Ummanni, R., et al. Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform. PLoS One. 6, (2011).
