Summary
Burada, iki çift proteomik teknikleri, yani Elektroforez (2DE) ve kütle spektrometrisi (MS) 2 boyutlu, diferansiyel primer örnekleri, iki veya daha fazla grup arasından / translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinler olarak ifade teşhis edilmesi için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım, birbirine işlevsel deneyler ile, prognostik parametreler / terapötik hedeflerin tanımlanması ve karakterizasyonu sağlar.
Abstract
Tümör başlaması ve ilerlemesinde rol moleküllerin belirlenmesi hastaların klinik yönetimi için, bir sonucu olarak, anlayış hastalığın biyolojisi için temel ve. Bu çalışmada biz kronik lenfositik lösemi (KLL) ilerlemesinde katılan moleküllerin tanımlanması için optimize edilmiş bir proteomik yaklaşım anlatacağız. Ayrıntılı, lösemik hücre lizatlan 2-boyutlu Elektroforez (2DE) tarafından çözümlenir ve 2DE jelleri "noktalar" olarak görünür. Proteomik haritaları karşılaştırmalı analizi, kütle spektrometrisi (MS) ile izole edilmiş toplandı ve tespit edilir (bol miktarda ve post-translasyonel modifikasyonlar bakımından) farklı şekilde eksprese edilmiş proteinlerin tanımlanmasına izin verir. Belirlenen aday biyolojik işlevi primer lösemi hücreleri için optimize edilmiş olması, farklı deneylerde (yani geçiş, yapışma ve F-aktin polimerizasyonu) ile test edilebilir.
Introduction
Kronik lenfositik lösemi (KLL), Batı ülkelerinde en yaygın yetişkin lösemi, monoklonal neoplastik CD5 + B lenfositlerinin birikimi türemiştir ve klinik çok heterojen. Bu nedenle, monoklonlu B hücresi lemfositozu (MBL) 1,2,3 olarak tanımlanan bir ön-lösemi form olarak mevcut olabilir. Hastalık ya bir seyirli ders ile görünebilir diğer durumlarda, bu tedaviye ihtiyaç duyan daha önce yıllarca stabil kalır veya serdedilebilmektedir ilerleyici bir kemorefrakter hastalık olarak tedaviye rağmen. Son olarak, bir sıklıkla ölümcül yüksek dereceli lenfoma (Richter'in Sendromu-RS) 2,3,4 ilerleyebilir. Iyi ve kötü prognoz, hastalık sonucu ve yaşam belirleyicileri hakkında tamamlayıcı bilgiler sağlar prognostik faktörlerin bir dizi dayalı: Hastalar genellikle iki ana alt gruplarında sınıflandırılır. Klinik heterojenite olasılıkla biyolojik heterojenitesini yansıtır. Genetik, microenvironmental ve ce bir dizillular faktörler birleştirici bir mekanizma 5 tespit edilmiştir bile hastalık patojenezine hemfikir gösterilmiştir. Ayrıntılı olarak, çeşitli çalışmalar hastalığın klinik seyrinde farklılıklar kısmen prognostik değer 6,7,8 olan bazı biyolojik belirteçlerin varlığı (veya yokluğu) ile izah edilebilir olduğunu göstermiştir. Bu veriler, hastalık biyolojisinin daha iyi anlaşılması, prognostik işaretleri ve terapötik hedeflerin her ikisinin belirlenmesi ile, patolojinin klinik yönetimi için ek ipuçları sağlayabildiğini göstermiştir.
Bu yazıda amacı, farklı proteomik tekniklerin bir kombinasyonu CLL başlangıcı ve ilerlemesinde de görev proteinlerin tanımlanması için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Bizim yaklaşımımız bu arada temel proteomik verileri ve klinik verileri 5 katılmak mümkün olduğunu göstermektedir.
Seçilen hastaların mevcut iş akışında, primer lösemi hücreleri(Kötü prognoz good vs) izole edilmiş ve hücre lizatlan sonra proteomik haritalar elde etmek için kullanılır. 2DE dolayısıyla her bir proteinin biyolojik aktivitesi üzerinde dolaylı bilgi verilmesi sonrası değişiklikleri dahil olmak üzere, bir hücre popülasyonu, proteomik profilinin karakterizasyonu sağlar. Tüm hücre lisatları, moleküler ağırlığına dayalı olarak proteinleri gideren bir poliakrilamid jeli üzerinde çalışan bir ikinci boyut, ardından izoelektrik noktasına göre bir birinci boyuta çalışma ile çözümlenir. Proteomik haritaları karşılaştırmalı analizi, diferansiyel olarak ifade edilen proteinlerin belirlenmesini sağlar (her ikisi de bol miktarda ve post-translasyonel modifikasyonlar bakımından) kesilmiş ve kütle spektrometresi ile analiz edilebilir jeli üzerinde lekeler halinde. Her adayın rolü daha sonra farklı deneyleri tarafından istismar edilebilir.
Geçerli el yazması KLL sınırlı Bu yaklaşım, kolay, böylece proteomi hakkında bilgi veren, diğer hastalıklar / örnekleri genişletilebilir(v demonte uyarılmamış, vahşi tip v uyarılan normal v patolojik yani,), iki grup arasında C / biyolojik farklılıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm doku örnekleri San Raffaele Hastanesi (Milan, İtalya) kurumsal inceleme kurulu onayı ile elde edilmiştir.
1. İnsan Doku ve Hücre numuneleri saflaştırma (Şekil 1)
NOT: Lösemik lenfositler Mulligan ve ark göre, KLL hastalarının Periferik Kan (PB) elde tanısı konuldu 9.
PB 1.1) Lösemik Hücre Ayırma
- Sodyum Heparin ile vacutainer kan toplama tüpleri içinde PB toplayın.
- 15 ml'lik bir tüp içine kan transferi ve tam kan, 50 uL / mL insan B-hücresi zenginleştirme kokteyl ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
- PBS +% 2 FBS eşit hacimde örnek seyreltilir emin arabirimi kırmak için dikkat ederek, Ficoll üzerinde yavaş ve dikkatli bir katlamalı kan karıştırın. 15 ml t seyreltilmiş numunenin 2 kısım Ficoll, en az 1 kısmı kullanarak (örneğin 4 ml Ficoll + 10 ml kanube).
- Hiçbir frenli 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (20 ° C) 400 xg'de santrifüj. Mononükleer hücreler arayüzde olacaktır.
- Dikkatle hücreleri kurtarmak ve yeni bir tüp içine yerleştirmek için arayüz aspire. 5 dakika boyunca karanlıkta, 300 x g hızında santrifüj ve PBS ile bir defa, 4 ° C hücreleri yıkayın. Topak alt olacaktır.
- Süpernatant atın. Ileri ve geri parmaklarınızla tüp hafifçe vurarak kalan süpernatantında pelletini. (% 10 Fetal dana serumu ve 15 mg / ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI 1640), 10 ml tam RPMI ortamı ile pelet seyreltin ve Tripan Mavisi dışlama yöntemi kullanarak hücreleri sayın.
1.2) saflığının değerlendirilmesi
Not: Tüm preparatların saflığı% 99'un üzerinde her zaman gerekir.
- Aşağıdaki antikorlar ile saflaştırılmış hücre süspansiyonu 100 ul inkübe (ticari olarak temin edilebilir; Malzemelerin tabloya bakınız): CD3 FITC (5 ul / test); CD14 PE (5 ul / deney), CD19 ECD (6 ul / deney), CD16-CD56 PY5 (2 ul / deney), CD5 PY7 bir 4 ° C'de 20 dakika boyunca (4 ul / deney), FACS tüpü.
- (300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj) PBS içinde 4 ml ile örnek yıkayın ve arsa olarak yüzeyi üzerinde CD19 ile birlikte ifade CD5-CLL hücreleri (>% 99)% akış cytometry.Check ile saflığını kontrol Şekil 1 'de gösterilen (6). Hazırlıkları sıfıra yakın olmalıdır arsa, CD3, CD14 ve CD16-56 içinde% kontrol ederek NK, T lenfositlerin ve monositlerin neredeyse yoksun olduğundan emin olun.
1.3) Numuneler Depolama
- Proteomik çalışmalar için, 10 dakika boyunca 300 x g'de 25 x 10 6, 1.5 ml bir tüp içinde hücreler, santrifüj hücreleri toplamak, 4 saat boyunca yüzer madde ve liyofilize pelet atın. -80 ° C'de kullanıma kadar muhafaza edin.
- Tam RPMI doğrulama deneyleri, tekrar süspansiyon hücreleri (miktar daha tahlil bağlıdır içinseçilmiş) ve Adım 4 ile devam edin.
2. İki boyutlu Elektroforez (2-DE) (Şekil 2)
2.1) izoelektro-odaklanma (İEF)
- 380 ul 2-DE tampon maddesi (bir RBthio çözeltisi 344 ul bir son hacme sahip CLL hücreleri topakları çözünürleştirilir (9 M üre, 10 mM Tris, 4% CHAPS), 65 mm DTT, 30 ul,% 2 IPG tamponu amfolin 6 ul pH 4-7).
- 18 IPG şeritler (pH 4-7) ile protein numuneleri (1 mg) uygulayın ve Conti ve arkadaşları tarafından tarif edilen standart protokol izlenerek IEF gerçekleştirin. 10
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, taze DTT,% 2 ile takviye edilmiş, (6 M üre,% 30 gliserol,% 2 SDS ihtiva eden 50 mM, pH = 8,8 Tris-HCl tampon EB) dengeleme tampon maddesinin 2 ml şeritler dengelenmesi. Iskarta EB + DTT ve EB 2 ml ekleyin% 2.5 İyodoasetamid ile desteklenmiş. Sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
2,2) SDS-PAGE
- Çıkarmak için jel dokunmadan, bir kağıt üzerinde kurutun şeritlerEB fazla. Bir% 9-16 gradyan SDS-PAGE jeli üzerine her bir şerit yerleştirin. SDS-elektroforez tamponu (Tris 25 mM, 192 mM Glisin, a / h SDS,% 0,1) jelinin üzerine şeridin yüklenmesini kolaylaştırmak için küçük bir hacim.
- Yüzer şeridin önlemek için agar çözeltisi (% 0.8), ~ 5 ml ilave etmek suretiyle jel Seal, daha sonra elektroforetik ünitesini kurmak ve SDS-elektroforez tamponu ile doldurun. 4 ° C'de 4 saat boyunca 60 mA / jel bölümünde çalışma gerçekleştirin.
- Elektroforetik üniteden jel çıkarın ve düzgün boyama kutuya yerleştirin.
Preparatif Gel 2.3) Gümüş Leke
| FIXER | % 50 metanol% 12 Asetik Asit % 0,05 Formalin | 2 saat (veya gece) * |
| YIKAMA TAMPON | % 35 etil alkol'le | 20 dakika (adımı üç kez tekrarlayın) |
| Sensitizing | % 0,02 Sodyum Tiyosülfat | 2 dakika |
| YIKAMA | H2O | 5 dk (adımı üç kez tekrarlayın) |
| Gümüş nitrat | % 0,2 Gümüş Nitrat 0076% Formalin | 20 dakika |
| YIKAMA | H2O | 1 dk (iki adımı tekrarlayın) |
| DEVELOPER | % 6 Sodyum Karbonat% 0,0004 Sodyum Tiyosülfat 0,05% formalin | Boyama yeterli olana kadar |
| Dur | 50% Metanol | 30 dakika |
| * 2 saat minimum zaman protein tespiti için gerekli |
Tablo 1.
NOT: Protein noktalar MS uyumlu gümüş boyası 11 ile jeller boyanarak görülebilir. Tüm çözümler gereklidirGümüş boyama için Tablo 1 'de listelenmiştir.
- Her bir çözelti / jel, yaklaşık 200 ml hazırlayın ve Tablo 1 'de gösterildiği gibi devam edin. Dikkatli bir jel ihtiva eden boyama kutusuna her bir çözeltiyi ekleyin. Sallanan bir platform üzerinde tüm inkübasyonlar gerçekleştirin.
- Boyama işleminden sonra Durdurma çözeltisi çıkarın ve satın alınana kadar% 1 asetik asit çözeltisi içinde jel bırakın.
2.4) Jel Toplama ve Analiz
- Boyama itibaren 3 gün içinde bir dansitometresi kullanarak yüksek çözünürlükte görüntüler elde.
- 2-DE jeller için yazılımı kullanarak 2 boyutlu protein kalıplarını analiz.
NOT: yazılımı hızlı ve güvenilir bir görüntü karşılaştırma sağlar.- Bağlam menüsünden "Yeni bir proje oluşturmak" seçerek bir proje oluşturun. Bir klasör oluşturun ve .tif ile "ithal jel görüntüleri" seçerek .png tarafından jeller içe. veya .gel uzantısı.
- Jeller ithal ve worksp eklenir kezace, menüde "tespit edit> nokta>" nokta tespiti için jeller seçip seçerek otomatik bir nokta algılaması gerçekleştirmek.
- Sonraki, menüde "çıkarma plan" seçerek bir arka plan çıkarma işlemleri. Not: Birden çok jelleri karşılaştırmak ve nicel ve / veya nitel analizi ile farklılıklar ve benzerlikler tespit etmek mümkündür Bundan sonra.
MALDI-TOF MS analizi ile 3. Protein Tanımlama (Şekil 3)
3.1) Protein Sindirimi
- Ya (temiz bir neşter ile kesim) manuel veya otomatik eksizyon ile jeller ilgi ve su tüketim noktalar ile jel durulayın.
- , Su (100-150 ul) ile jel parçacıkları yıkayın aşağı spin (400 x g'de 30 sn) ve sıvı çıkarın.
- Jel parçalara CH3 CN (jel hacmine bağlı olarak) bir eşit hacmi ekleyin ve jel parçaları küçültmek kadar 10-15 dakika boyunca bekleyin. Jel parçacıkları kurulayın ina vakum santrifüj.
- 50 mM NH4 HCO3 içerisinde seyreltilmiş 10 mM ditioeritritol 75-100 ul ekleyin ve 56 ° C (Aşama indirgenmesi) 30 dakika boyunca inkübe edin. Aşama 3.1.3 de tarif edildiği gibi tekrar CH3CN ile jel parçaları küçültür.
- MM iodoasetamid, 50 mM NH4 HCO3 içinde seyreltilmiş ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe bir çözelti 55 75-100 ul ekleyerek alkilasyon ile devam edin.
- Aşama 3.1.3 tarif edildiği gibi jel parçaları karşılamak için yeterli hacmi kullanılarak CH3CN ile bir kez daha jel parçaları küçültür. Bir vakum santrifüj içinde kurutun.
- 20 dakika boyunca 4 ° C de 4 HCO3 25 mM NH, 5 mM CaCl2, ve 12.5 ng tripsin / ml ihtiva eden bir tampon içinde, parçacıkları rehidrate. Jel parçaları karşılamak için yeterli hacim tampon kullanır. Jel parçalardan un-absorbe Süpernatantı ve 25 mM NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl2 tripsine olmadan cov eklejel er.
- Gece boyunca 37 ° C'de en az 3 saat (peptid sindirimi için gerekli olan minimum süre) için numuneler bırakın.
3.2) Kütle Spektrometre Analiz (Kuru damlacık tekniği)
- Paslanmaz çelik bir levha üzerine MALDI Her numunenin Noktası 1 ul eş-payı ve 50% CH3CN ve% 0.1 TFA içinde hazırlanmış α-siyano-4-hidroksisinamik asit, matris olarak 1 ul ile karıştırılır.
- Bir MALDI-TOF kütle spektrometresi üzerinde kütle spektrumları elde edilir. Lazer yoğunluğu sinyal doygunluğu önlemek veya sinyali artırmak için ayarlama, ve benek başına yaklaşık 200 spektrumları birikir. Veri Gezgin yazılımı ile işlem spektrumları, aşağıda tarif edildiği gibidir:
- .dat Dosyası almak ve "süreci> temel düzeltme" seçerek temel düzeltme gerçekleştirin. "Süreç> kütle kalibrasyon> manuel kalibrasyon seçerek tripsin otoliz ürünler ve matris zirveleri kullanarak kitleleri kalibre; m / z 855,1 ve 2163,1 b yakın zirveleri seçiny ardından "komplo" tıklayın ve manuel kalibrasyon penceresinde "kalibrasyonu uygulamak", sürükleyerek ve ilgili referans kitleleri seçin bıraktı.
- , ("Aktif iz yinelenen> Ekran") Etkin izlemeyi çoğaltmak, tepe tespiti için eşik ("pik> pik algılama") ayarlayın yeni iz seçin ve deisotoping ("pik> deisotoping") gerçekleştirin. Makro "getpeaklist" kullanarak, tanımlama için kullanılacak kitlelerin bir listesini oluşturmak. Gerekirse, elle listesini temizlemek ve daha iyi bir kimlik almak için zirveleri olarak aldı gürültü sinyalleri kaldırın.
- Arama motorları 12 kadar derin ve Mascot kullanarak kapsamlı bir yedekli olmayan protein veritabanı arayarak proteinleri tespit.
- Tüm aramalarda aşağıdaki parametreleri kullanın: Bir sabit modifikasyon ve başlatılışının olarak peptit başına bölünme, değişken modifikasyonu gibi metiyonin oksidasyonu, sistein karbamido cevapsız50 ppm arkadaşları kütle tolerans.
4. Sitoskeletal Etkinlik Tahliller (Şekil 4)
Not: süspanse hücreleri tam RPMI (10 6 hücre / 200 ul) içindeki Aşama 1 'de arıtıldı.
4.1) Yer değiştirme tahlili. Bu test analiz hücreleri (lenfositler) göç kapasitesinin ölçümü sağlar. 6.5 mm çapında ve 5.0 mikron gözenek boyutunda bir Transwell odasını ve üç kopya halinde tahlilin gerçekleştirilmesi. Farklı hücre tipleri durumunda gözenek boyutuna ve geçiş süresi (Aşama 4.1.3) duruma getirin.
- Sırasıyla indüklenen ve kendiliğinden migrasyonun ölçülmesi için ya da belirli bir uyaranlara (yani SDF-1) olmadan tam RPMI 600 ul ekleyerek alt odayı hazırlayın.
- Bunun üzerindeki üst odasına koyun ve sistem kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca dengelenmeye bırakın.
- Tohum 10 6 hücre / üst bölmeye 200 ul (Toplam hücre sayısı) ve inkübekuluçka makinesi içinde 37 ° C de 4 saat boyunca plakası.
- , Üst oda çıkarın, alt bölmede ise medya toplamak ve 1 ml PBS ile bir kez alt odayı yıkayın. Tüp içinde PBS toplayın.
- 5 dakika 300 x g'de santrifüje, 500 ul PBS içinde süpernatant ve tekrar süspansiyon atın.
- Akış sitometrisi tarafından, satın alma 1 dakika sonra göç hücre sayısı. Izole edilmiş bir hücre popülasyonu durumunda, herhangi bir yüzey antikoru ilave etmek gerekli değildir. Hücrelerin yan scatter ve hesaplama için kullanılacak sayıdır, 1 dakika görüntülendi olayların sayısı göz önüne alındığında, bir iki-boyutlu bir nokta arsa hücre sayısını kontrol edin.
- Göç Endeksi (MI) gibi hesaplayın:
4.2) Yapışma deneyi. Bu deney, hücre yapışma kapasitesinin ölçülmesi sağlar. Üç kopya halinde tahlil gerçekleştirin.
- Ön ceket 96-welmi, 50 ul plakası (düz tabanlı) / oyuk ya da gece boyunca 4 ° C'de, PBS içinde sulandırılmış% 2 BSA-PBS (arka plan) ya da 1 ug, ICAM-1.
- PBS ile iki kez, plakayı yıkayın ve 37 ° C'de 1 saat boyunca% 2 BSA-PBS (100 ul / göz) eklenerek spesifik olmayan the bloke eder.
- Tam RPMI içinde 5 x 10 6 / ml arada tekrar süspansiyon hücrelerde, 1mM CMFDA-yeşil cep izci ile etiket ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
- Blokaj çözeltisi (Aşama 4.2.2) çıkartıldıktan sonra 1 x 10 6 hücre / oyuk önceden kaplanmış oyuklara ilave edin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edilir.
- , Bir ELISA okuyucu kullanılarak yapışma miktarını (Uyarım filtresi: 485 nM, emisyon filtresi: 535 nM). Toplam girişi (GİRİŞ) bir ilk ölçümü yapın.
- % 2 BSA-PBS ile hafifçe plakayı yıkayın (200 ul / kuyucuk) 4 kez (x). Her bir yıkama basamağı (Yapışma x), ardından bir plaka okuma gerçekleştirin.
- Her bir ölçüm için plan çıkarma sonra, belirli ADHES hesaplamakiyon (ADEZYON):
4.3) Polimerizasyon deneyi. Bu F-aktin polimerizasyonu rakamlarla bir kolorimetrik testtir. Üç kopya halinde tahlil gerçekleştirin.
- Yeniden süspanse 1x10 ^, 10 dakika boyunca 6 önceden ısıtılmış tam RPMI, 100 ul hücre ve spesifik bir uyarıcı ekleme (örneğin, α-lgM 20 ug / ml).
- % 4 paraformaldehit ile 400 ul reaksiyonu durdurun ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücrelerin tespit.
- (5 dakika, 4 ° C'de 300 x g'de santrifüj) 3 defa PBS ile yıkayın.
- 2 dakika boyunca buz üzerinde, PBS-% 0.2 saponinler (200 ul) ile yüzer ve Permeabilize hücreleri atın.
- , (5 dakika, 4 ° C'de 100 x g'de santrifüj) PBS-% 0.1 saponinler ile 3 kez 100 ul PBS ile yıkayın-saponinler% 0.1 supernatant ve tekrar süspansiyon atın.
- Oda t'de 30 dakika boyunca Phalloidin-AlexaFluor 488 (3 ug / ml) ile LekeKaranlıkta emperature.
- PBS-% 0.1 saponinler ile 3 kez yıkayın. 300 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve süpernatant atılır.
- Phalloidin bir ortalama flüoresans şiddeti (MFI) hesaplanması, akış sitometrisi ile, F-aktin miktarı belirlenmiştir. Floresan yoğunluğuna dayalı bir histogram üretmek için tek bir boyuta parselde oluşturulan verileri analiz, MFI değeri grafik raporu gösterilmiştir.
- F-aktin polimerizasyonu (Δ F-aktin) olarak ölçün:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz primer lösemi B hücreleri KLL hastalarının PB formu izole ve biz proteomik haritalar analiz. Numuneler (n = 104) her hasta (iyi prognoz vs kötü prognoz) ve 2DE jellerin karşılaştırmalı analizi yapılmıştır klinik özelliklerine göre iki ana alt gruplarında gruplandırıldı.
Analiz izin diferansiyel olarak ifade edilen iki alt noktalar arasındaki tanımlama (post-translasyonel modifikasyonlar değişiklik ima varlığında / yokluğunda, veya jel üzerinde kaymanın vadede, n ≈ 16). Bir MALDI plakası üzerine tespit edildi 2DE jellerden ve indirgenmiş ve alkillenmiş olan, proteinler, tripsin ve elde edilen üstte kalan sıvı kısımdaki peptidler ile sindirildi seçilmiş olan noktalar kesilir. Spectra bir MALDI-TOF Voyager DE elde edildi. Elde edilen pik listesi MASCOT ve derin sunulmuştur. Belirli bir tolerans dahilinde kütle kütleleri olarak kabul edilir bir protein içine veritabanında dizileri peptit atanır ve daha sonra monte edilirbelli bir olasılık skoru (Şekil 3) geçerse tespit edilmiştir. Bu analizde biz esas hücre iskeleti aktivite ve metabolik süreçler (yayınlanmamış veri) yer alan proteinleri tespit.
Bunların arasında, kimin diferansiyel fosforilasyon güçlü hastalığın klinik seyri ile ilişkili (Şekil 4) hematopoetik-soy-hücre-spesifik protein-1 (HS1) odaklanmıştır. 2 noktalar hastalar (n = 60, hipo-fosforile HS1) iyi prognoz 13 (Şekil 4 varken Özellikle, biz, (n = 44, hiper-fosforile HS1) kötü klinik sonuç yaşamaya hastalar tek bir nokta taşıyan bulduk ). Noktalar SS1 proteininin mevcudiyeti HS1 13 karşı bir monoklonal antikor ile immunoblotting 2DE jel ile doğrulandı.
Bu SS1 hücre iskeleti yeniden 14 dahil olduğu bilindiğinden, biz i test etmek için in vitro tahliller gerçekleştirilmiştirf HS1 fosforilasyon durumu farklı olarak (kötü prognoz good vs) iki KLL subsetlerinde sitosköletal aktivitesini etkileyebilir. Bir nokta göç, yapışma ve aktin polimerizasyonu açısından bir engelli sitosköletal aktiviteye sahip olarak biz, böylece farklı bir klinik davranış 15 (Şekil 5) açıklayan, hipo-fosforile-HS1 örneklere kıyasla, HS1'i taşıyan bu KLL hücreleri bulundu.
Şekil 1:. CLL 'li hastalarda Pb Kandan lösemik hücre arıtma akışı, bir 15 mL tüp (1), insan B-hücresi zenginleştirme kokteyli (2) bir örneğe ilave edildi ve 20 dakika süreyle inkübe edilir aktarılır. Kan daha sonra 1 arasında bir oranda PBS ile seyreltilir: 1 ve yoğunluk gradyanı (3) 'ün üzerine yerleştirilmiştir. Daha sonra numune santrifüj (4), birden çok l oluşumunu sağlar Ayers: a) plazma b) B lenfositleri, c) Ficoll, d), kırmızı hücreleri ve istenmeyen hücreleri. Arıtılmış B lenfositleri (b layer) sonra (5), yıkanmış ve hücre hazırlama saflık akış sitometri (6) ile analiz edilir toplanmaktadır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. 2DE Akışı Topak 2DE tampon maddesi (1) içinde çözülür ve ilk boyut run (2-izoelektro-odaklanma) için IPG şerit üzerine yüklenir. Dengelemeden sonra, bir şerit ise ikinci boyut run (3-SDS-PAGE) bir gradyan poliakrilamid jeli üzerine yüklenir. Jel daha sonra, görselleştirmek için lekeleri lekelenmektedir / proteinler (4). Yüksek çözünürlüklü görüntü alımından sonra, proteomik haritaları incelendiğinde (5). les / ftp_upload / 51942 / 51942fig2highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: MS analizi iş akışı (1) ilgi Spotlar bir neşter ile 2D jelden kesilip çıkarılmış ve temiz bir tüp içine aktarılır.. Indirgenmiş ve alkillenmiş edildikten sonra (2), protein tripsin ile sindirilmiş, elde edilen üstte yüzen madde içindeki peptidler bir MALDI plaka (3) üzerine tespit edilir. Spectra bir MALDI-TOF Voyager DE elde edilir. (4) oluşan pik listesi MASKOT ve derin arama motorları teslim ve kapsamlı bir yedekli olmayan protein veritabanına karşı aranır. (5), belirli bir tolerans dahilinde kütle kütleleri veri tabanında bulunan peptid dizilerine tahsis edilir, daha sonra protein içine yerleştirilebilir. target = "_blank"> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: SS1 fosforilasyon durumu CLL 'li hastalarda prognozu ile bağlantılıdır (1) daire, sırasıyla 4,83 ve 4,86 arasında 79 kDa olan, aynı moleküler ağırlığına (Mı) ve farklı izoelektrik noktası (pl) da birbirine yakın iki noktalar tanımlar tanımlanmıştır. SS1 protein olarak, MS (2). (2) bir kötü prognoz (kırmızı kare) ve iyi bir prognoz KLL hastalarında (yeşil kare) iki temsilcisi jeller. (3) Kaplan-Meier eğrileri HS1 fosforilasyon desenine göre gruplandırılmış KLL hastalarının kümülatif sağkalım göstermektedir (1 spot, n = 44, vs 2 noktalar, n = 60). 2 nokta (yeşil nokta) olan hastalar sadece bir (kırmızı noktalar) olanlara göre anlamlı derecede daha uzun sağkalım (medyan sağkalım ulaşmış değil) var./files/ftp_upload/51942/51942fig4highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: CLL Primer örnekleri SS1 fosforilasyon durumunu etkilemektedir iskelet hücresi işlevi, SDF-1 'in varlığında ya da yokluğunda, primer örneklerinin Transwell (1) üzerine göç.. Grafikte (SEM, n = 1 7 arasında yer HS1 v, n = 12 2 nokta SS1) akış sitometresi ile 1 dakika içinde elde edilen hücrelerin sayısı araçlarını görüntülenir. (2) Spontan hücre adezyon etiketleme ve 96 oyuklu plakalar içerisinde 1 saat inkübe edildikten sonra ölçüldü. SEM birincil vasıta örnekleri içindir gösterilir (n = 7 1 spot SS1 v, n = 12 nokta HS1 2). Primer örnekleri (3), F-aktin polimerizasyon yeteneği. Göreceli F-aktin cont araçlarının SEM gösterilirFITC ile işaretlenmiş falloidinle SDF-1 ile uyarılması ile boyandıktan sonra CLL hücreleri ENT (5 1 arasında yer HS1 n = v, n = 5 2 nokta HS1 arasında). MFI: Ortalama Floresan Yoğunluğu. Histogram örnek edinme örnek olarak. Temsil Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda amacı, bu yaklaşım, başka hastalıklar ve / veya başka bir numune türlerine 16-18 kadar uzatılabilir bile, CLL patogenezinde rol oynayan moleküllerin tanımlanması için optimize edilmiş bir protokol tanımlamaktır. Kötü prognoz 19 karşı iyi CLL 'li hastalarda, 2 altkümelerinin proteomik profilleri karşılaştırarak, bu HS1 fosforilasyon durumu açısından farklılık gösterir ve aktivasyonu lösemi hücrelerinin göçü ve yapışması kapasitesini etkiler gösterdi.
Diğer yöntemler ile ilgili olarak, el yazması, 2DE jel ve MS sunulan proteomik tekniklerinin temel avantajı, hücre proteome'una tam bir parmak izi sağlar ve en önemlisi proteinlerinin post-translasyonel modifikasyonlar hakkında bilgi vermektir. Farklı şekilde fosforile veya glikosilatlanmış olan proteinler jel içindeki konumlarını değiştirmek, ve büyük olasılıkla hücrelerde kendi etkinliğini değiştirebilirsiniz.
"ove_content> Ayrıca, hücre iskeleti işlevselliğini test etmek için kullanılan hücrelerin göç ve yapışmasının değerlendirilmesi için protokoller tarif, onlar yaygın yapışık hücrelere uygulandı beri bu protokolleri hala zayıf (süspansiyon büyüyen hücrelerin örneğin yara iyileşmesini anlatılmıştır Bu, işlevsel tayinler için, hücrelerin canlılığı ise). 2DE ve MS tekniğin başlıca sınırlaması hücre / proteinlerin (Jel başına ≈25 x 10 6 hücre) miktarı vardır. Esas sorun, primer hücreler üzerinde çalışmak için ama birçok hastalık için bir hücre veya bu deneyler gerçekleştirmek için canlı hücre yeterli sayıda ulaşmak mümkün değildir, bu durumda, uygun olması durumunda hücre çizgileri kullanmak mümkündür.MS protokolü için en kritik aşama için kirlenmeyi önlemek ve net protein kimlik elde etmek için temiz (keratin ücretsiz) koşullarda çalışmak. Sitoskeletal deneyleri özellikle prima üzerine (yeniden genellikle zordurry hücreleri), böylece üç kopya halinde deneyi gerçekleştirmek için önerilmektedir.
Gösterdiğimiz gibi biz SS1 protein 19 için gösterildiği gibi, bu metinde sunulan yaklaşımların bir kombinasyonu, bu nedenle yeni bir tedavi hedeflerinin keşfine sağlayan farklı hastalıklarda rol oynayan yeni yolların tanımlanmasına yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz Lenfoid Maligniteler Birimi, Elisa on Hacken, Lydia Scarfo Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela bachi, ve Angela Cattaneo teşekkür ederiz.
Bu proje ile desteklenmiştir: Associazione Italiana per la Ricerca sul Yengeç AIRC (Araştırmacı Grant ve Özel Programı Moleküler Klinik Onkoloji - 5 mille # başına 9965)
CS ve BA, çalışma tasarlanan deneyler, verileri analiz ve el yazması yazdı. MTSB, UR, FBPR taslağın yazım destekli. PG ve FCC çalışma sağlanan hastaların örnekleri ve klinik verilerini tasarlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
References
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).
- Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. Monoclonal B lymphocytosis in the general population. Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).
- Fazi, C., et al. General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL. Blood. 118, 6618-6625 (2011).
- Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in cancer biology. , (2013).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94, 1840-1847 (1999).
- Lanham, S., et al. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 101, 1087-1093 (2003).
- Wiestner, A., et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood. 101, 4944-4951 (2003).
- Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood. 113, 6496-6497 (2009).
- Conti, A., et al. Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers. J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).
- Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).
- Zhang, W., Chait, B. T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).
- Scielzo, C., et al. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).
- Muzio, M., et al. HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).
- Scielzo, C., et al. HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells. Blood. 116, 3537-3546 (2010).
- Kashuba, E., et al. Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen. J Proteomics. 91, 478-485 (2013).
- Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. The ongoing evolution of proteomics in malignancy. Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).
- Ummanni, R., et al. Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform. PLoS One. 6, (2011).
