In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.
Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.
يتم إصلاح إصابة البطانية بطانة الأوعية الدموية من خلال الاستجابة مرقئ، أو تشكيل لتجلط الدم. عندما يتخلل الدم في المصفوفة خارج الخلية، والعوامل الأنسجة تنشيط الصفائح الدموية في مجرى الدم التي تسهل الشروع في شلال التخثر. المكون الميكانيكي الرئيسي من هذه العملية هو شفاء المصفوفة الليفين، وتتألف من ألياف الفيبرين التي هي مرنة للغاية، ويمكن الحفاظ قوات كبيرة 1-4. لقد درس كثير من الباحثين بنية تشكيل وظيفة الفيبرين على نطاق واسع في العقود الماضية 5-13.
المرضى الذين يعانون من أمراض مثل داء السكري وفقر الدم المنجلي لديهم خطر متزايد لتطوير مضاعفات الجلطات مثل احتشاء عضلة القلب وأمراض نقص تروية القلب، والسكتات الدماغية 14-19. يتم تشخيص أكثر من 2 مليون شخص حديثا مع داء السكري كل عام في الولايات المتحدة. هناك نوعان من مرض السكري: النوع الأول، حيثفشل الجسم على إنتاج كميات كافية من الأنسولين، والنوع الثاني، حيث يصبح الجسم مقاوما للأنسولين. بين مرضى السكري، وأمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب ل80٪ من المراضة والوفيات المرتبطة بهذا المرض 20،21.
مرض فقر الدم المنجلي (SCD) هو اضطراب وراثي في الدم يؤثر على أكثر من 100،000 شخص في الولايات المتحدة (22). SCD هو مرض نقاط الطفرة التي تسبب خلايا الدم الحمراء لتصبح على شكل هلال، مما يجعل من الصعب على الخلايا لتمر عبر الأوعية الدموية في الدم 23. كل من هذه الحالات المرضية تزيد من فرص تطوير الظروف atherothrombotic في الجسم. واحدة من أسباب ذلك هو نتيجة لهيكل الفيبرين تغيير وظيفة في الدول المريضة 14،24-26.
في كل من السكري ومرض فقر الدم المنجلي، وهناك hypercoagulation والنشاط hypofibrinolysis أن يدفع atherothrombosis وأمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) بالمقارنة مع المرضى الأصحاء 17،27،28. ومن المعروف أن hypofibrinolysis يشجع تصلب الشرايين التقدم ويولد الأحداث الدماغية المتكررة للمرضى الذين يعانون من السابق لأوانه مرض الشريان التاجي (29). في المخطوطة الحالية، ونحن التحقيق في دور الخصائص الفيزيائية الليفين في هذا الإعداد معين. وتتكون الهياكل جلطة الفيبرين في المرضى غير المريضة من ألياف رقيقة، والمسام الكبيرة، وعموما أقل كثافة 14،24. تم العثور على زيادة المسامية وجلطات الفيبرين أقل كثافة في المرضى الأصحاء لتسهيل انحلال الفيبرين 16. في ظروف hyperthrombotic مثل مرض الخلية المنجلية ومرض السكري، وهناك زيادة في الإنتاج الفيبرينوجين، مما تسبب في تركيز الفيبرينوجين إلى زيادة من المستويات العادية من 2.5 ملغ / مل في المرضى الأصحاء 30-33. تم العثور على تجلط الليفين التي تشكلت في مرضى السكري إلى أن تكون أقل مسامية، أكثر جمودا، على المزيد من النقاط فرع، وأكثر كثافة بالمقارنة مع الأصحاء، وعدم ديا-المرضى betic 14،24،33-35. هيكل الفيبرين تغيير هو نتيجة لآليات غلكأيشن التي تحدث في البروتينات المشاركة في تشكيل الجلطة. يحدث غير إنزيمي (لا رجعة فيه) غلكأيشن عندما ربط جزيئات الجلوكوز إلى بقايا يسين على جزيء الفيبرينوجين، الذي يثبط عامل XIIIa البشري (FXIIIa) من الجلوتامين ويسين المخلفات بشكل صحيح عبر ربط 33،36،37.
وقد تمت دراسة التحليل الهيكلي للشبكات الفيبرين على نطاق واسع في الآونة الأخيرة. على وجه الخصوص، واستخدمت الباحثين المجهر الإلكتروني وإعادة الإعمار 3D شبكات الفيبرين 38، التحقيق في الكيفية التي تؤثر بها على حد سواء داخل الأوعية الدموية (البطانية) الخلايا وخارج الأوعية (الخلايا الليفية والعضلات الملساء) خلايا هيكل الفيبرين 39، اللزجة المستخدمة والتحليل الطيفي لتحليل الهياكل الفيبرين 40، و الارتباطات المتقدمة بين هيكل الفيبرين والخواص الميكانيكية باستخدام التجريبية والنهج الحاسوبية 41 </sup>. وكان التركيز في الدراسة الحالية لصياغة هياكل جلطة في ظل ظروف السكري والجلطة خلية المنجل محاكاة واستخدام متحد البؤر المجهري لفحص بنية ووظيفة جلطات في الدول المريضة. وتم تشكيل جلطات الليفين من الفيبرينوجين البشري، الثرومبين البشري، وFXIIIa. وهي lysed الجلطات باستخدام بلازمين. لمحاكاة الظروف السكري، وقد حضنت زيادة تركيز الفيبرينوجين في حل الجلوكوز للحث في المختبر الفيبرينوجين غلكأيشن. لمحاكاة الظروف تخثر مرض الخلية المنجلية، كانت مختلطة زيادة تركيز الفيبرينوجين مع الهيماتوكريت المنجلي تم جمعها من المرضى كما فعلت سابقا من قبل لدينا مجموعة 42. وقد استخدمت هذه الأساليب لدراسة هيكل ووظائف المشاركة في تشكيل جلطة الفيبرين وانحلال الفيبرين في ظل ظروف المريضة، فضلا عن الآليات التي تحفز الأمراض القلبية الوعائية. وبناء على المعلومات الحالية حول هذه الأمراض، كانت الهياكل الفيبرين جلطة السكري أكثر كثافة مع عدد أقل منالثانية المسام أصغر. وكانت جلطات الفيبرين مع خلايا الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي (كرات الدم الحمراء) أيضا أكثر كثافة وعرضها التجميع من كرات الدم الحمراء ومجموعات الفيبرين مكتل. وهذه ظاهرة راسخة الذي تم تحديده سابقا 43. وقد افترض أيضا أن معدل انحلال الفيبرين سيكون أقل من ذلك بكثير في تجلط الليفين السكري مع وبدون تخفيض بلازمين مقارنة صحي، الفيبرين العادي. وأظهرت النتائج أن للجلطات الفيبرين السكري، ولوحظت نتائج معدل تحلل مختلفة إلى حد كبير إلا في ظل ظروف انخفاض تركيز بلازمين. هذه التقنية التجريبية من استخدام متحد البؤر المجهري تقدم مزايا هامة على طرق التصوير الأخرى لأن الخلايا والبروتينات لا تزال في دولتهم الأم، والتي تمكن من التقاط الفيديو في الوقت الحقيقي لنشاط التخثر. هذا الأسلوب من تخثر حمل صناعي هو أيضا أرخص وأكثر كفاءة من الوقت الحصول على عينات من المرضى وتصفية فردالبروتينات والانزيمات. وعلاوة على ذلك، عن طريق استخدام البروتينات والانزيمات فصل لتجميع الجلطات، وموحدة للجلطات بحيث لم يكن هناك التباين بين العينات نتيجة لبروتينات أخرى في البلازما.
للحصول على بيانات ذات مغزى حول بنية آليات التخثر في الحالات المرضية، من المهم لعزل العوامل التي تدخل في تخثر لتحديد الآثار المترتبة على البروتينات والخلايا في هذه الظروف. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لأغراض التحقيق في هيكل جلطة الفيبرين في الدول السكري وSCD في المخت…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
PBS | Life Technologies | 10010031 | |
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
0.5 mL graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |