Eksperimentelle og Imaging Teknikker for Undersøke fibrinkoagel Structures i Normal og Syke States

Summary

In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

Abstract

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.

Introduction

Skade på en blodåre er endothelial fôr er reparert gjennom hemostatiske respons, eller dannelse av en blodpropp. Når blodgjennomsyrer i det ekstracellulære matrise, vev faktorer aktiverer blodplater i blodet som letter initiering av koagulasjonskaskaden. Nøkkelen mekaniske komponent av dette helbredelsesprosessen er den fibrin-matrise, som består av fibrin fibre som er meget elastiske og kan tåle store krefter ^1-4. Mange forskere har studert formasjonen struktur og funksjon av fibrin i stor utstrekning i de siste tiår ^5-13.

Pasienter med sykdommer slik som diabetes mellitus og sigdcelle har en økt risiko for utvikling av trombotiske komplikasjoner som myokardinfarkt, iskemisk hjertesykdom, slag og ^14-19. Over 2 millioner mennesker er nylig diagnostisert med diabetes mellitus hvert år i USA. Det er to typer av diabetes: Type I, derkroppen ikke klarer å fremstille tilstrekkelige mengder av insulin, og type II, hvor kroppen blir motstandsdyktig mot insulin. Blant pasienter med diabetes, er kardiovaskulær sykdom (CVD) på grunn til 80% av sykelighet og dødelighet i forbindelse med sykdommen ^20,21.

Sigdcelleanemi (SCD) er en genetisk blodsykdom som rammer mer enn 100.000 mennesker i USA ^22. SCD er en punkt-mutasjoner sykdom som fører til de røde blodcellene blir halvmåneformet, noe som gjør det vanskelig for cellene til å passere gjennom blod vaskulaturen ^23. Begge disse sykdomstilstander øker sjansene for å utvikle aterotrombotiske tilstander i kroppen. En av grunnene til dette er et resultat av endret fibrin struktur og funksjon i syke tilstander ^14,24-26.

I begge diabetes og sigdcelleanemi, er det hyperkoagulasjon og hypofibrinolysis aktivitet som induserer aterotrombose og kardiovaskulær sykdom (CVD) sammenlignet med friske pasienter ^17,27,28. Det er kjent at hypofibrinolysis fremmer åreforkalkning progresjon og skaper tilbakevend iskemiske hendelser for pasienter med tidlig koronarsykdom ^29. I dagens manuskript, undersøkte vi rollen som fibrin fysiske egenskaper i denne innstillingen. Fibrinkoagel strukturer i ikke-syke pasienter som er sammensatt av tynne fibre, større porer, og generelt mindre tett ^14,24. Den økede porøsitet og mindre tette fibrinkoageler hos friske pasienter har blitt funnet å lette fibrinolyse ^16. I hyperthrombotic tilstander slik som diabetes og sigdcelleanemi, er det en økning i fibrinogen produksjon, forårsaker fibrinogen-konsentrasjon til å øke mot normale nivåer av 2,5 mg / ml hos friske pasienter ^30-33. Fibrinkoageler dannet i diabetiske pasienter har blitt funnet å være mindre porøs, stivere, har flere forgreningspunkter, og tettere sammenlignet med friske, ikke-diaBetic pasienter ^14,24,33-35. Den endrede fibrin strukturen er et resultat av glycation mekanismer som forekommer i proteiner som er involvert i dannelse av blodpropper. Enzymatisk (irreversible) glykering oppstår når glukose molekyler binder seg til lysinrester på fibrinogen molekyl, som hemmer menneskelig faktor Xllla (FXIIIa) fra ordentlig kryss kobling glutamin og lysinrester ^33,36,37.

Den strukturelle analysen av fibrin nettverk har blitt studert inngå nylig. Spesielt har forskere benyttet elektronmikroskopi og 3D rekonstruksjon av fibrin-nettverk ^38, som er undersøkt hvordan både intravaskulære (endotelceller) celler og ekstravaskulære (fibroblaster og glatte muskelceller) celler påvirker fibrin struktur ^39, benyttet viskoelastisk og spektralanalyse for å analysere fibrin-strukturer ^40, og utviklede sammenhenger mellom fibrin struktur og mekaniske egenskaper ved hjelp av eksperimentell og beregningsorientert tilnærminger ⁴¹ </sup>. Fokuset i denne studien var å formulere blodpropp strukturer under simulerte diabetiker og sigdcelle trombose forhold og å bruke konfokalmikroskopi for undersøkelse av struktur og funksjon av blodpropp i sykt stater. Fibrinkoageler ble dannet fra humant fibrinogen, humant trombin, og FXIIIa. De klumper ble lysert ved hjelp av plasmin. Å simulere diabetic forhold, ble økt konsentrasjon av fibrinogen inkuberes i glukoseoppløsning for å indusere in vitro fibrinogen glykering. Å simulere sigdcelleanemi clotting forhold, ble økt fibrinogen konsentrasjoner blandet med sigdcelle hematokrit innsamlet fra pasienter som gjort tidligere av vår gruppe ^42. Disse metodene ble anvendt for å undersøke strukturen og funksjonene som er involvert i fibrin-klumpdannelse og fibrinolyse i henhold syke betingelser, samt mekanismer som induserer CVD. Basert på oppdatert informasjon om disse sykdommene, de glykerte fibrinkoagel strukturer var tettere med færre ennd mindre porer. De fibrinkoageler med røde blodceller fra pasienter med sigdcelle (RBC) ble også tettere og vist aggregering av de røde blodlegemer og fibrin agglomererte klaser. Dette er et veletablert fenomen som har blitt bestemt tidligere ^43. Det ble også en hypotese om at fibrinolyse raten ville være betydelig lavere i glykerte fibrinkoageler med og uten redusert plasmin i forhold til sunn, normal fibrin. Resultatene viste at for glykerte fibrinkoageler, signifikant forskjellige lyse sats resultater ble observert kun under betingelser med redusert plasmin konsentrasjon. Denne eksperimentelle teknikken med å bruke konfokalmikroskopi gir betydelige fordeler fremfor andre avbildningsmetoder fordi cellene og proteiner forblir i sin opprinnelige tilstand, noe som gjør det mulig å fange av sanntids video av clotting aktivitet. Denne metoden for syntetisk induserende blodpropp er også billigere og mer tidseffektiv enn å skaffe pasientprøver og filtrere ut enkelteproteiner og enzymer. Videre, ved hjelp av separerte proteiner og enzymer for å syntetisere propper ble klumper standardisert, slik at det ikke var variasjonen mellom prøver som et resultat av andre proteiner i plasma.

Protocol

MERK: Følgende protokoll følger de retningslinjer fastsatt av Institutional Review Board (IRB) ved Georgia Tech. 1. Blodprøvetaking og røde blodceller Isolation Prosedyre Samle 40-120 ml blod fra givere i 10 ml hepariniserte vacutainerrør. Starte PBMC (perifert blod mononukleærerte celle) isolasjon innen 4 timer av samlingen. I løpet av denne tiden holde blodet ved RT. MERK: O / N lagring av blod i RT eller i 4 ° C anbefales ikke da dette vil result…

Representative Results

Konfokalmikroskopi Analyse av glykosylert fibrinkoagel Structures De Konfokalmikroskopi bilder av normale og glykerte blodpropper er presentert i figur 3. Konfokalmikroskopi analyse av de normale og glykerte blodpropper avslører at glykerte blodpropper er tettere med mindre porer enn de normale klumper både med og uten tilsetning av FXIIIa under koagel polymerisasjon. I figur 3A og 3B, er det en lavere konsentrasjon fibrin som skapte en mi…

Discussion

For å oppnå meningsfylte data om strukturen av clotting mekanismer i sykdomstilstander, er det viktig å isolere de faktorer som er involvert i koagulering for å bestemme effekten av proteiner og celler i disse tilstandene. Denne protokollen ble utviklet for det formål å undersøke strukturen av fibrinklump i diabetiske og SCD tilstander in vitro.

Det er nødvendig å forstå mekanismene som er involvert i fibrindannelse og fibrinolyse i sykdomstilstander siden endrede betingel…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
PBS	Life Technologies	10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)	GE Healthcare	45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes	BD Biosciences	366643
Human Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate	Molecular Probes	F13191
0.5 mL graduated microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-120
Glucose powder	Life Technologies	15023-02
FXIIIa	Enzyme Research Laboratories	N/A
VIS Confocal Microscope	Zeiss LSM 510	LSM 510
50 mM Tris	Lonza	S50-642
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution	Life Technologies	L7781
Plasmin	Enzyme Research Laboratories	N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)	Life Technologies	AM9759
Statistical Modeling Software	IBM	SPSS Statistics 22