Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

فحوصات السمية للاختبار تأثيرات جينية من المخدرات للتنمية، الخصوبة والوراثة من الملاريا البعوض

Published: January 16, 2015 doi: 10.3791/52041
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Entomology, Virginia Tech

Abstract

مقاومة الحشرات تشكل مشكلة كبيرة لبرامج مكافحة الملاريا. البعوض على التكيف مع مجموعة واسعة من التغيرات في البيئة بسرعة، مما يجعل مكافحة الملاريا مشكلة منتشرة في كل مكان في البلدان الاستوائية. ظهور مقاومة مبيدات الحشرات السكان يبرر استكشاف مسارات جديدة الهدف المخدرات والمركبات لمكافحة ناقلات البعوض. وتنشأ المخدرات جينية جيدا في أبحاث السرطان، ولكن لا يعرف الكثير عن تأثيرها على الحشرات. وتقدم هذه الدراسة بروتوكول بسيط لفحص الآثار السمية ل3-Deazaneplanocin ألف (DZNep)، وهو دواء جينية التجريبية لعلاج السرطان، على نواقل الملاريا، الأنوفيلة الغامبية. ولوحظ وجود زيادة تعتمد على التركيز في معدل الوفيات وانخفاض في حجم البعوض في غير ناضجة تتعرض لDZNep، في حين خفضت مجمع خصوبة البعوض البالغ النسبية للسيطرة على العلاجات. وبالإضافة إلى ذلك، كان هناك انخفاض تعتمد على المخدرات في S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) النشاط هيدرولاز في البعوض بعد التعرض لDZNep قريب للسيطرة على العلاجات. وتوفر هذه البروتوكولات الباحث مع ذلك، خطوة بخطوة إجراء بسيط لتقييم نهايات سمية متعددة للدواء التجريبية و، بدوره، يبرهن على وجود نهج متعدد الشق فريد لاستكشاف الآثار السمية للمخدرات أو مركبات جينية للذوبان في الماء الفائدة ضد البعوض الحامل للمرض والحشرات الأخرى.

Introduction

الملاريا هو المسؤول عن أكبر عدد من الوفيات المرتبطة حشرة في العالم. تحدث ما يقدر بنحو 219 مليون حالة سنويا في جميع أنحاء العالم، مما أدى إلى ما يقرب من 660،000 حالة وفاة، في المقام الأول في أفريقيا 1. على الرغم من الجهود المتضافرة، تواجه برامج مكافحة الملاريا العديد من التحديات. في حين المعالجة بمبيدات الحشرات ومكونات مفتاح شكل الرش الثمالي داخل المباني البرنامج، ومقاومة للمبيدات الحشرية في السكان المحليين تعرقل هذه الجهود 2. وتعزى الزيادة السريعة في مبيدات الحشرات أسراب البعوض المقاوم إلى حد كبير إلى قدرة البعوض الملاريا على التكيف بسرعة مع التغيرات في بيئتهم واستغلال منافذ مختلفة 3،4،5. للتغلب على الآليات القائمة لمقاومة المبيدات الحشرية، هناك ما يبرر استكشاف أهداف الحشرات رواية ومركبات الجيل القادم. A، خطوة بخطوة بروتوكول بسيط لتحديد مدى فعالية من المبيدات الحشرية التجريبية على مختلف مراحل حياة الملاريا مسوف osquitoes يعزز إلى حد كبير هذه الجهود.

وقد أثبتت الدراسات الدوائية من آثار المخدرات على خطوط الخلايا والنماذج الحيوانية استخدام العقاقير جينية كأداة مفيدة لتحوير علم الوراثة وعلم وظائف الأعضاء من الخلايا والكائنات الحية. مثيلة الحمض النووي وتعديل هيستون نوعان من آليات جينية تؤثر على التعبير الجيني في الكائنات متعددة الخلايا دون تغيير تسلسل الحمض النووي الأساسي 6. التعديلات آخر متعدية مثل مثيلة تلعب دورا حاسما في الحفاظ على سلامة الخلوية والتعبير الجيني، ويمكن أن تؤثر العديد من العمليات الأساسية 7،8،9. وقد أبرزت الأبحاث في بعض أنواع الحشرات أهمية علم التخلق في العمليات التي تنطوي على مراحل تكوين البويضات وتنبع صيانة خلية 10، فضلا عن تعويض الجرعة 11. ومع ذلك، لا يزال يتعين استكشاف هذه الجوانب في ناقلات الأمراض. باستخدام مركب لتعديل هذا النظام في البعوض يمكن أن توفر لنا مع فيمشاهد في رواية مسارات الهدف الحشرات. 3-Deazaneplanocin ألف (DZNep) غير معروف مثبط هيستون مثيلة، والتي تم دراستها تأثير على أنواع مختلفة من السرطانات 12،13،14،15،16. DZNep هو للذوبان في الماء المخدرات مستقرة جينية الذي يمنع بشكل غير مباشر هيستون يسين N -methyltransferase (EZH2)، وهو مكون من polycomb القمعي معقدة 2 (PRC2) في خلايا الثدييات. PRC2 يلعب دورا هاما في تنظيم نمو الخلايا الجذعية في الكائنات متعددة الخلايا، وهيستون مثيلة هو جانب رئيسي من PRC2 بوساطة إسكات الجينات. في الفئران المناعة، وقد ثبت الخلايا المعالجة قبل مع DZNep إلى أن تكون أقل مكون للأورام 17. وأصبح يستخدم هذا الدواء لدراسة أمراض أخرى، مثل مرض الكبد الدهني غير الكحولي، والتي EZH2 هو متورط 18. DZNep هو ثابت S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) هيدرولاز مثبط 19 و 20. تثبيط النتائج هيدرولاز SAH فيتراكم SAH و، بدوره، يؤدي إلى تثبيط النشاط ناقلة الميثيل عن طريق الحد من المجموعات المانحة الميثيل المتاحة. SAH هو مشتق من الأحماض الأمينية التي تستخدمها العديد من الكائنات الحية، بما في ذلك الحشرات، في ممراتها الأيض. وقد أظهرت دراسة حديثة أن DZNep في الجرعات المنخفضة قد تؤثر على السكون وتأخير التنمية في الحشرات 21.

هنا، يتم تطوير بروتوكول قوي للتحقيق في الآثار المترتبة على مجمع للذوبان في الماء على مختلف مراحل حياة البعوض. الأجزاء الثلاثة لهذا البروتوكول تتضمن تعليمات لدراسة الآثار المترتبة على مجمع للذوبان في الماء على البعوض غير ناضجة، الإناث الرضاعة الدم الكبار، ونشاط انزيم من الذكور البالغين وإناث البعوض. أولا، تم حل DZNep في الماء لدراسة تطوير البعوض غير ناضجة والبقاء على قيد الحياة. يتم تنفيذ ذلك في اثنين من تركيزات لمقارنة أي خلافات تنشأ عن زيادة بنسبة 10 أضعاف في التعرض للمخدرات. لاستكشاف تأثير المخدرات على إناث البعوض الكبار، DZNepيضاف إلى defibrillated الدم الأغنام وتغذية الدم اصطناعيا للإناث. وفي وقت لاحق، يتم فحص نتائج المخدرات على الخصوبة. وأخيرا، يتم تنفيذ انزيم النشاط فحص باستخدام 5،5'-dithiobis- (حمض 2-nitrobenzoic) (DTNB) كمؤشر لتحديد تأثير DZNep على SAH هيدرولاز تثبيط في الذكور البالغين وإناث البعوض. في حين تم تطوير هذا البروتوكول مع بعوضة الملاريا، الأنوفيلة الغامبية، ويمكن تكييفه بسهولة لدراسة آثار مركبات الفائدة على أي نوع من البعوض أو الحشرات الأخرى. التقنيات بالتفصيل في هذا البروتوكول قد لا يتم تطبيق بكفاءة لدواء مع الذوبان محدود أو معدومة في المياه أو وسائل الإعلام المائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: الأجزاء الثلاثة للبروتوكول تصف التعرض مائي من المخدرات DZNep للبعوض اليرقات، والتعرض القائم على دم DZNep إلى الإناث البالغات لدراسة تأثيرها على الخصوبة، وSAH هيدرولاز تثبيط من قبل DZNep تقاس باستخدام تقنية اللونية البسيطة. ويرد التمثيل التخطيطي من هذه المقايسات في الشكل 1.

1. غير ناضج تنمية البعوض والوراثة فحوصات

ملاحظة: يوضح هذا القسم استخدام دواء للذوبان في الماء الذي يؤثر على تطور يرقات البعوض والبقاء على قيد الحياة.

  1. هاتش A. البيض الغامبية في 28 ° C في الماء المقطر (DH 2 O) والخلفية منهم إلى 2 الثانية الطور اليرقات.
  2. اتخاذ الدناز ستة جيدا، ريبونوكلياز خالية لوحة زراعة الخلايا وتصب 10 مل درهم 2 O إلى كل بئر.
  3. حدد يرقات البعوض في 2 الثانية الطور وإضافة 15 يرقات لكل بئر. قبل إضافة 2 الثانية الطور اليرقات لوحة، صالتحرير لهم على منشفة ورقية لمدة 2-3 ثانية لإزالة الماء الزائد.
  4. آبار التسمية مع الأشرطة مرمزة بطريقة عشوائية التجربة. تسمية 2 آبار في تركيز الاختبار على كل لوحة (الشكل 2).
  5. إعداد هيدروكلوريد 1 ملم DZNep (MW = 298.73) حل الأسهم عن طريق إذابة 0.3 ملغ DZNep في 1 مل من درهم 2 O. إضافة محلول المخزون من DZNep.HCl إلى الآبار وصفت لتحقيق تركيز النهائي من 0.5 ميكرومتر و 5.0 ميكرومتر.
    ملاحظة: يمكن تخزين الحل السهم عند 4 ° C للالمدى القصير (1 يوم لمدة شهر) أو -20 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل (شهر أطول من واحد).
    ملاحظة: سوف إضافة محلول المخزون لتركيزات المذكورة أعلاه لا يغير من حجم المياه في الآبار بشكل كبير. ولكن في حالة تركيزات أعلى من ذلك بكثير، فإنه من المستحسن أن حل المجمع في المتوسط ​​اليرقات لتجنب أي تخفيف لزوم لها للمجمع.
  6. إضافة مبلغ مساو من الأسماك الغذاء تقشر إلى كل بئر. تغطية لوحةالصورة واحتضان لهم في 28 ° C في حاضنة.
  7. تسجيل وفيات للبعوض اليرقات DZNep المعاملة وغير المعالجة بعد فترة تعرض على مدار 24 ساعة. إزالة وتجاهل أي اليرقات الميتة. كرر هذا التسجيل كل يوم حتى جميع اليرقات يموت أو تخدر تصبح خادرة وتظهر وكأنها البالغين. تسجيل حجم اليرقات كل يوم الثاني على التوالي، أي يوم 0، 2، 4، 6، 8، حتى تخدر تصبح خادرة.
  8. تحليل البيانات تطوير وفيات اليرقات باستخدام برنامج التحليل الإحصائي المناسب.
    ملاحظة: رسم بياني شريط يمكن استخدامها لتمثيل البيانات وفيات في Microsoft Excel. تحليل التباين متعدد المتغيرات (MANOVA) يؤديها مع برامج مثل أحزاب اللقاء المشترك أو SPSS سوف تكشف إذا جرعات مختلفة من الدواء يؤدي إلى بقاء تختلف اختلافا كبيرا من يرقات البعوض.

2. الخصوبة الفحص بواسطة بإدارة المخدرات من خلال تغذية الاصطناعية لأنثى البعوض

ملاحظة: تفاصيل هذا القسم إضافة الدواء إلى دمالثانية تغذية أن إناث البعوض الكبار باستخدام نظام تغذية الاصطناعي.

  1. إنشاء أقفاص البعوض الكبار مع عدد متساو من البعوض من الذكور والإناث من أجل السيطرة واختبار القفص. توفير 10٪ من محلول السكر غارقة في كرات القطن إلى كل من الأقفاص حتى الإناث على استعداد لتغذية (3-5 أيام والأمثل لالأنوفيلة الغامبية).
  2. 2 ساعة قبل تغذية الدم، وإزالة كرات القطن لضمان الإناث الجائعة.
  3. تجميع اثنين من مغذيات الدم الاصطناعية التي تتكون من واسع مقلوب قمع القاع الزجاجي (القطر = 50 ملم، وطول = 70 ملم) والبلاستيك المحيطة مختومة مع الغراء الصناعي. إرفاق أنابيب بلاستيكية (القطر = 7 ملم) لاثنين من منافذ مغذيات "(القطر = 10 ملم) عن طريق وصلات لتدفق وتدفق المياه. تسمية مغذيات اثنين كما "السيطرة" و "5 ميكرومتر DZNep".
  4. باستخدام عنصر التسخين المتاحة تجاريا، وإعداد برنامج للتغذية. في "القائمة" انتقل إلى "إعدادات"وحدد "Setpoints". ستظهر البرامج المحملة مسبقا. حدد "SP1" وضبط درجة الحرارة لمدة 37 ° C.
    ملاحظة: يضمن عنصر التسخين أن دم تدار يتم الحفاظ على درجة حرارة ثابتة. ويمكن استخدام إعدادات البرنامج إضافية للأنواع البعوض أو الحشرات المختلفة.
  5. ملء دلو من الماء وتزج عنصر التدفئة في الماء.
  6. قطع قطعة مربع من بارافيلم (50 ملم × 50 ملم) وامتداد لتقديم فيلم غشائي رقيقة. تغطية الجزء السفلي من مغذيات اصطناعية مع بارافيلم. قطع قطعة أخرى من بارافيلم (50 ملم × 10 ملم)، وتمتد عليه وختم حواف مغذيات.
  7. تجميع النظام، وربط مغذيات وعنصر التسخين بواسطة الأنابيب. وبمجرد الانتهاء، والتحول على النظام وحدد "SP1". اضغط على "أدخل" لبدء النظام.
    ملاحظة: إن الماء سوف تحصل تسخينها إلى 37 ° C والحفاظ على أن درجة الحرارة.
  8. مراقبة عشردرجة الحرارة (ه) من الماء باستخدام ميزان حرارة في دلو الماء.
    ملاحظة: موصلات وأنابيب مساعدة في الحفاظ على دوران مستمر من المياه من خلال النظام بحيث أن درجة حرارة الدم لا يزال في 37 ° C.
  9. ملء علبة مسطحة القاع مع 10٪ محلول التبييض التي سيتم استخدامها لتطهير أي انسكابات الدم.
  10. إضافة 2 مل من الدم الأغنام defibrillated لأنبوب microcentrifuge. تسمية هذا ب "السيطرة". كرر العملية لأنبوب التجريبية وصفت بأنها "5 ميكرومتر DZNep" .Add 6 ميكرولتر من DZNep حل سهم (راجع الخطوة 1.5) إلى أنبوب التجريبي المسمى "5 ميكرومتر DZNep" المزيج برفق الدم والمخدرات عن طريق عكس ذلك عدة مرات. احتضان دقيقة أنبوب 10 في RT.
  11. باستخدام ماصة، إضافة 2 مل من السيطرة واختبار الدم إلى الجزء العلوي من مغذيات وصفت تبعا لذلك. تجاهل ماصة في محلول التبييض. تغطية القفص مع حقيبة سوداء وتنفس الهواء في القفص بشكل دوري لتشجيع وemales للتغذية.
  12. السماح للالبعوض تتغذى لحوالي 30 دقيقة. بمجرد الانتهاء من التغذية، وإيقاف عنصر التدفئة، واتخاذ مغذيات الخروج وتجريد بارافيلم. نقع وحدة التغذية في محلول التبييض لمدة 5 دقائق ويشطف جيدا في الماء منزوع الأيونات.
  13. إزالة مغذيات ووضع كرات من القطن مع الماء والسكر على الأقفاص لمدة 48 ساعة. وضع طبق البيض التي تحتوي على المياه ورقة الترشيح في أقفاص بين عشية وضحاها لتسهيل وضع البيض. تسمية كل طبق البيض مع اختبار أو السيطرة تركيز المعنيين.
  14. إزالة طبق البيض اليوم التالي ودراسة عدد وهيكل من البيض تحت المجهر ستيريو. الحصول على الصور باستخدام برنامج Q-colors5. حساب عدد البيض. تحليل الفرق في عدد البيض التي تم الحصول عليها من اختبار ومراقبة أقفاص.
    ملاحظة: إن أونبايريد اختبار t يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان عدد البيض تختلف اختلافا كبيرا (ع ≤0.05).

3. الكيمياء الحيوية الفحص من البعوض انزيم تثبيطمن المخدرات

ملاحظة: يصف هذا القسم مقايسة نشاط انزيم باستخدام DTNB كمؤشر لتحديد تأثير DZNep على SAH هيدرولاز تثبيط في الذكور البالغين وإناث البعوض.

  1. إعداد 0.1 M نا 2 هبو 4 (ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم) حل بإضافة 14.19 غرام من نا 2 هبو 4 الى 1 L من درهم 2 O. وبعد ذلك، إعداد 0.1 M ناه 2 PO 4 (أحادي فوسفات الصوديوم) حل بإضافة 13.79 غرام من ناه 2 PO 4 الى 1 L من درهم 2 O.
  2. عاير 0.1 M نا 2 هبو 4 حل مع 0.1 M ناه 2 PO 4 حل لدرجة الحموضة 8.5.
    ملاحظة: سوف يكون هذا هو الحل الأسهم العمل من 0.1 M نا 2 هبو 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5).
  3. يعد حل تجانس 0.1 M نا 2 هبو 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5) وذلك بإضافة 0.3٪ تريتون X-100.
    ملاحظة: يمكن تخزين حل التجانس في 4 درجة مئوية.
  4. العلاقات العامةepare 1.6 ملي SAH (MW = 384.4) حل عن طريق إذابة 6.15 ملغ من SAH في 10 مل من 0.1 M نا 2 هبو 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5).
  5. يعد حل 1.6 ملي DTNB (MW = 396.4) عن طريق إذابة 6.3 ملغ من DTNB في 10 مل من 0.1 M نا 2 هبو 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5). حافظ على حل DTNB الطازجة على الجليد حتى الاستخدام.
  6. إعداد 1 ملم DZNep.HCl (MW = 298.73) حل عن طريق إذابة 0.3 ملغ من DZNep في 1ML درهم 2 O. التالي، يخفف من 1 ملم DZNep حل في سلسلة من التركيزات من 1،000 ميكرومتر إلى 0.002 ميكرومتر في DH 2 O.
  7. لقياس هيدرولاز تثبيط SAH التي كتبها DZNep، وإعداد مستخلص إنزيم الخام من البعوض: التجانس 10 البعوض البالغ غير الدم التي تغذيها في 1 مل من الجليد الباردة 0.1 M ناه 2 PO 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5)، التي تحتوي على 0.3٪ تريتون X- 100، وذلك باستخدام الخالط الأنسجة الزجاجية. نقل جناسة لأنبوب 1.5ml ميكروسنتريفوج.
  8. أجهزة الطرد المركزي لجناسة لمدة 5 دقائق عند 10،000 x ج في 4 درجات مئوية. نقل طاف لتنظيف1.5 مل أنبوب microcentrifuge. استخدام طاف كمصدر للإنزيم للمقايسة البيوكيميائية SAH.
  9. لعلاج فارغة (أي، لا DZNep، لا إنزيم)، إضافة 50 ميكرولتر 1.6 ملي SAH، 50 ميكرولتر 1.6 ملي DTNB، و 100 ميكرولتر 0.1 M نا 2 هبو 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5) إلى الآبار الفردية ل96-جيدا، صفيحة ميكروسكوبية مسطحة القاع.
  10. من أجل السيطرة (أي، لا DZNep)، إضافة 50 ميكرولتر 1.6 ملي SAH، 50 ميكرولتر 1.6 ملي DTNB، 50 ميكرولتر 0.1 M نا 2 هبو 4 (الرقم الهيدروجيني 8.5) و 50 ميكرولتر انزيم (SAH هيدرولاز الحصول عليها من استخراج النفط الخام) للفرد الآبار.
  11. لعلاج DZNep، إضافة 50 ميكرولتر 1.6 ملي SAH، 50 ميكرولتر 1.6 ملي DTNB، 50 ميكرولتر انزيم و 50 ميكرولتر اختيار تركيز DZNep إلى الآبار الفردية. إعداد 4 مكررات لكل معاملة والسيطرة عليها.
  12. قراءة الكثافة الضوئية (OD) من العينات انزيم SAH في 405 نانومتر لمدة 5 دقائق في 20 ثانية فترات باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا.
  13. طرح OD فارغة من السيطرة علىالثانية العلاج OD تم الحصول عليها من كل جانب. حساب في المئة المتبقية SAH النشاط هيدرولاز باستخدام المعادلة التالية:٪ آخر المتبقية = (علاج OD / OD التحكم) × 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الرقم 1 هو تمثيل تخطيطي للفحوصات. فهو يصف الخطوات المختلفة من الإجراء المذكورة في هذه المقالة. كما هو أساس بروتوكول بشأن مراحل الحياة المختلفة من البعوض، وليس هناك تسلسل معين الواجب اتباعها للتجارب بالتفصيل هنا. قد يختار المستخدم لإجراء واحد أو أكثر المقايسات في نفس الوقت، وهذا يتوقف على توافر عينة.

يوضح الشكل 2 لوحة أنشئت من أجل تطوير البعوض والبقاء على قيد الحياة المقايسات غير ناضجة. قد يتم تغيير عدد من تركيزات الاختبار ومكررات اعتمادا على متطلبات المستخدم وتوفر المخدرات. للمقايسة البعوض غير ناضجة، أضيف 1 ملي حل الأوراق المالية من DZNep إلى المياه التي تحتوي على البعوض لتحقيق تركيز النهائي من 0.5 ميكرومتر و 5 ميكرومتر جنبا إلى جنب مع عموم التحكم مع الآبار التي تحتوي على السكان خالية من المخدرات. وأظهرت التجربة أن المزيد من اليرقات والعذارى survived في آبار المراقبة مما كانت عليه في الآبار DZNep المعاملة.

الشكل (3) يصور تأثير DZNep على البقاء على قيد الحياة عموما من البعوض الملاريا أثناء التجربة. وتظهر النتائج أن DZNep المخدرات جينية يقمع نمو والتنمية والحث على وفيات من البعوض غير ناضجة. الغالبية العظمى من البعوض يتعرض إلى 0.5 ميكرومتر توفيت بعد يوم 10 من هذه التجربة، في حين أن عددا كبيرا من الأشخاص الذين تعرضوا إلى 5 ميكرومتر توفي بعد يوم 8. وفي المقابل، ظلت وفيات من البعوض في علاج السيطرة (لا للمخدرات) ظهرت تتأثر والعديد من الكبار في يوم 8 من التجربة. وقد لوحظ وجود علاقة عكسية بين تركيز الدواء وحجم الجسم البعوض (الشكل 4).

ويوضح الشكل 5 تأثير DZNep على البعوض الخصوبة. إناث البعوض الكبار تتغذى على الدم تحتوي على DZNep عرضت على reductio كبيرن في عدد من البيض قابلة للحياة. ويبين الشكل 5A البيض تم الحصول عليها من قفص السيطرة (لا للمخدرات). ويبين الشكل 5B البيض تم الحصول عليها من اختبار القفص. وكان عدد كبير من البيض تم الحصول عليها من اختبار قفص قتامة في اللون وتفتقر إلى عوامات (التوسعات مليئة بالهواء من مشيماء أديمية ظاهرة) بالمقارنة مع البيض تم الحصول عليها من البعوض العادي الدم تغذية الإناث (الشكل 6). غياب يطفو جنبا إلى جنب مع البيض الملونة الداكنة يشير إلى الدور المحتمل للعلم التخلق في تشكيل مشيماء أديمية ظاهرة.

يوضح الشكل (7) وتأثير DZNep على SAH النشاط هيدرولاز في الذكور البالغين والبعوض والملاريا الإناث. ويلاحظ وجود انخفاض تعتمد-DZNep في OD لكل العلاج من تعاطي المخدرات مقارنة مع معاملة السيطرة (لا للمخدرات) مما يدل على أن DZNep يمنع SAH النشاط هيدرولاز.

الشكل (1) الشكل 1: تمثيل تخطيطي للفحوصات باستخدام المخدرات جينية على البعوض والملاريا ويبين الجزء الأيسر من المخطط المقايسات التنمية والبقاء على قيد الحياة باستخدام البعوض غير ناضجة. الجزء المركزي يوضح فحص الخصوبة عن طريق الدم الرضاعة الدواء إلى الإناث البالغات. في الجزء الأيمن يصور الفحص الكيميائي الحيوي لانزيم تثبيط من قبل المخدرات.

الشكل 2
الشكل 2: لوحة تصور تنمية البعوض غير ناضجة والبقاء على قيد الحياة الفحص تسمية "C" آبار المراقبة علامات. التسمية "0.5" يظهر الآبار مع 0.5 ميكرومتر DZNep. التسمية "5" تشير الآبار مع 5 ميكرومتر DZNep.

الشكل (3)
الشكل (3): تأثير DZNep على البقاء على قيد الحياة من البعوض والملاريا. الوفيات التي تعتمد على التركيز مع البعوض غير ناضجة.

الشكل (4)
الشكل 4:... تأثير DZNep على التنمية من البعوض غير ناضجة (A) اليرقة من العلاج السيطرة (حجم = 5 ملم) (B) اليرقة تعامل مع 0.5 ميكرومتر DZNep (حجم = 4 مم) (C) اليرقة تعامل مع 5 ميكرومتر DZNep (حجم = 3 مم). تم قياس جميع اليرقات في نفس اليوم من التجربة.

الرقم 5
الشكل 5: تأثير DZNep على البعوض الخصوبة طبق البيض من العلاج السيطرة (لا للمخدرات) البعوض يحتوي على عدد أكبر بكثير من البيض (A) المقارنةالأحمر مع طبق البيض من الإناث تعامل مع 5 ميكرومتر DZNep (B).

الشكل (6)
الشكل 6: تأثير DZNep على هيكل البيض في البعوض والملاريا ينظر تحت المجهر. (A) بيض من العلاج السيطرة (لا للمخدرات) البعوض عرض يطفو والجمعيات تشبه ردة. (ب) بيض من البعوض تعامل مع 5 ميكرومتر DZNep تفتقر يطفو والجمعيات تشبه ردة.

الرقم 7
الرقم 7: SAH هيدرولاز تثبيط من قبل DZNep في البعوض والملاريا يسبب DZNep انخفاض في OD مقارنة مع العلاج التحكم (لا للمخدرات).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك عدة خطوات حيوية لنجاح تطبيق هذا البروتوكول. للمقايسة اليرقات، ينبغي الحرص على تسمية بشكل صحيح وتكرار كل تركيز الاختبار. التعشءه عينات الاختبار وإضافة كمية معينة من المخدرات إلى الآبار اختبار كل جزء مهم من هذا التجريبية اقامة. قبل إضافة 2 الثانية الطور يرقات البعوض إلى صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا، ويمكن وضع كل يرقة على منشفة ورقية لمدة 2-3 ثانية لإزالة الماء الزائد. لمنع جفاف، يجب أن يتم نقل اليرقات فورا إلى آبار صفيحة ميكروسكوبية باستخدام زوج من الملقط حادة. وهذا يضمن حجم المياه في كل صفيحة ميكروسكوبية جيدا ويبقى تركيز الدواء على النحو المنشود. عند نقل اليرقات لقياس طول الجسم، فمن المستحسن لوضع اليرقات على الجليد لبضع دقائق من أجل الاحتفاظ بها ثابتة. عندما التكيف مع هذا البروتوكول لمركب مختلف، يجب توخي الحذر لتحديد كمية المحلول يضاف إلى كلأيضا. في مثل هذه الحالات، قد يكون من الأفضل أن تذوب كمية محسوبة من المركب في المياه مباشرة قبل إضافة اليرقات في كل صفيحة ميكروسكوبية أيضا.

لفحوصات الدم التغذية، فمن الأهمية بمكان أن البعوض وجوعا بشكل مناسب عن طريق إزالة الماء والسكر على الأقل 2 ساعة قبل التجربة. قد يؤدي عدم القيام بذلك سيؤدي في التغذية غير مكتملة وأثر يذكر على إنتاج البويضة الكبار. خلط دقيق وتوزيع موحد للدواء في الدم هو خطوة هامة أيضا، كما يأخذ DZNep بضع دقائق لتذوب. إذا تم تغذية الدم المخدرات تعالج على الفور، DZNep لا يحصل موزعة بالتساوي في النظام البعوض. من المستحسن أن الدم defibrillated هو جديد (أي أقل من أسبوع منذ تاريخ الاستخراج) للحصول على نتائج أفضل.

هناك خطوات متعددة الحاسمة لنجاح مقايسة البيوكيميائية مع مجمع الفائدة. تركيزات كل حل الأسهم المستخدمة في هذا بروتو عمود تم الأمثل لDZNep. لتكييف بروتوكول للمركب مختلف، نقترح اختبار مجموعة من درجة الحموضة المختلفة، SAH، وتركيزات DTNB وأحجام العينات الحشرية لتحديد النتائج الأكثر موثوقية. إعداد استخراج الخام الانزيم هو الأكثر تستغرق وقتا طويلا خطوة في هذا الإجراء. أثناء إعداد جناسة فمن المستحسن استخدام لا يزيد عن 10 البعوض البالغ، والدهون موجودة في طاف قد تعوق القراءة الامتصاصية. لتجنب هذه المشكلة، الطبقة العليا من الدهون في طاف (باستخدام قناة ممص مكروى واحد) يمكن إزالتها بعد خطوة 3.8. يجب نقل طاف لأنبوب microfuge نظيفة. وينبغي تكرار الخطوة 3.8 لتجاهل أي الدهون اللزجة المتبقية. يجب تجميع طاف واضح المتبقية من جميع الأنابيب ومختلطة بلطف. ماصة متعدد القنوات يمكن استخدامها لزيادة الكفاءة لإضافة SAH في الآبار. يستخدم DTNB كمؤشر في الفحص، ويجب أن يكون مستعدا الماضي وأبقى على الجليد.

الإقليم الشمالي "> هذا البروتوكول يوفر للمستخدم مع خطوات بسيطة لاختبار تأثير مركب على مراحل الحياة المختلفة من البعوض. ومع ذلك، هناك بعض القيود على استخدام هذا البروتوكول. هذه التقنية تعتمد في المقام الأول على الذوبان في الماء من DZNep. غير ناضج تتعرض اليرقات إلى المخدرات المنحل في وسائل الإعلام المحيطة بها. إذا كان المركب يجري اختبارها غير قابل للذوبان في الأوساط المائية، قد يجعل هذا البروتوكول أقل كفاءة. لاختبار الخصوبة، فإننا تعرض الإناث البالغات إلى المخدرات الذائبة في defibrillated الدم الأغنام. هذا لن يكون ممكنا إذا مختبر يربي مستعمرات البعوض على دم الثدييات مباشرة (أي يستخدم الفئران أو خنازير غينيا لتغذية البعوض).

مزيج من فحوصات مختلفة بالتفصيل في هذه المقالة يوفر للمستخدم مع طريقة جديدة لاختبار آثار مجمع للذوبان في الماء على الحشرات. في الغالب أضاف DZNep لخطوط الخلايا في المختبر لأبحاث السرطان. ومع ذلك، هذا البروتوكول يتيح شسر لدراسة أي آثار على مختلف مراحل حياة حشرة في الجسم الحي. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر أيضا الباحث مع خطوة بخطوة المبادئ التوجيهية لفحوصات السمية. في الأدب الحالي، والمعرفة محدودة فيما يتعلق آثار المخدرات جينية على الحشرات. باستخدام DZNep كمثال، ونحن نقدم إجراء من شأنه أن يمكن استخدام كخطوة قبل اللازمة نحو استكشاف المخدرات جينية أخرى أو مركبات جديدة وكلاء المحتملين مكافحة الحشرات. على الرغم من أن وضعت هذا البروتوكول للبعوض الملاريا، يمكن تكييفها لاختبار تأثير DZNep، أو أي مجمع للذوبان في الماء من الفائدة، في أنواع البعوض أو الحشرات الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplate Fisher Scientific 12565561
Cell culture plate CytoOne CC7682-7506
Centrifuge Sorvall Fresco 76003758 A different centrifuge can be used
Colored tape rolls Fisher S68134
Dissection microscope Olympus SZ
DTNB Sigma Aldrich D8130
DZNep.HCl Sigma Aldrich SMLO305
Egg dish cups
Filter papers Fisher 09-795E
Glass feeders Virginia Tech
Glass tissue homogenizer
Heating element Fisher Scientific NC0520091
Incubator Percival scientific I36VLC8 A different incubator can be used
Microcentrifuge tube, 2 ml Axygen 22-283
Microcentrifuge tube, 1.5 ml Axygen MCT-150-C
Micropipette Eppendorf 4910 000.069
Na2HPO4 Fisher Scientific M-3154
NaH2PO4 Fisher Scientific M-8643
pH meter  Mettler Toledo 7easy S20
Plate reader Spectramax M2
SAH Sigma Aldrich A9384 store at -20 °C
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. CDC Report. , Available from: http://www.cdc.gov/malaria (2010).
  2. Gatton, M. L., et al. The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa. Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).
  3. Sternberg, E. D., Thomas, M. B. Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases. Trends in Parasitology. , (2014).
  4. Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. 2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae. Malaria Journal. 8, 147 (2009).
  5. Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).
  6. Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. Update on Cancer Therapeutics. Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).
  7. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).
  8. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  9. Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
  10. Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1. Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).
  11. Conrad, T., Akhtar, A. Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription. Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).
  12. Miranda, T. B., et al. DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation. Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).
  13. Cui, B., et al. PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep). J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).
  14. Fujiwara, T., et al. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation. The Journal of Biological Chemistry. , (2014).
  15. Li, Z., et al. The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer. Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).
  16. Nakagawa, S., et al. Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells. Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).
  17. Crea, F., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer. Molecular Cancer. 10, 40 (2011).
  18. Vella, S., et al. EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD. International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).
  19. Tan, J., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells. Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).
  20. Chiang, P. K., Cantoni, G. L. Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo. Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).
  21. Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).

Tags

الأمراض المعدية، العدد 95،
فحوصات السمية للاختبار تأثيرات جينية من المخدرات للتنمية، الخصوبة والوراثة من الملاريا البعوض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, A., Anderson, T. D.,… More

Sharma, A., Anderson, T. D., Sharakhov, I. V. Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes. J. Vis. Exp. (95), e52041, doi:10.3791/52041 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter