毒理学化验一个后生药物对疟蚊的发育，繁殖和存活率测试效果
Summary
A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.
Abstract
杀虫性带来的疟疾控制规划的一大难题。蚊子适应范围广的变化迅速的环境中，使得疟疾控制一个无所不在的问题，在热带国家。杀虫剂抗性种群的出现值得新型药物靶点的途径和化合物矢量控制蚊子的探索。后生药物确立在癌症研究，但没有多少人知道他们对昆虫的影响。这项研究提供了一个简单的协议，用于检查3 Deazaneplanocin A（DZNep），实验后生药物用于癌症治疗的毒性作用，对疟蚊， 冈比亚按蚊 。在死亡率和降低尺寸的浓度依赖性增加，观察暴露于DZNep未成熟蚊子，而化合物还原成蚊相对于对照治疗的繁殖力。此外，还有S中的药物依赖性降低-腺苷高半胱氨酸（SAH）水解酶的蚊子暴露于DZNep相对于对照治疗活动。这些协议提供研究者用一个简单的，一步一步的程序，以评估多个毒理学终点的实验性药物，反过来，表现出探索的水溶性后生药物或化合物的毒性效应独特的多管齐下的方法利率对蚊子和其他昆虫。
Introduction
疟疾是负责的最高数目昆虫有关的死亡，在世界。每年发生大约2.19亿箱子全球，造成约66万死亡病例，主要是在非洲1。尽管共同努力，疟疾项目面临着一些挑战。而杀虫处理的蚊帐和程序室内滞留喷洒形式的关键部件，阻力在当地居民杀虫剂阻碍这些努力2。在杀虫剂抗性蚊子种群的快速增长在很大程度上归因于疟蚊的快速适应变化的环境，并利用不同的壁龛3,4,5的能力。为了克服抗药性的现有机制，新型杀虫剂目标和下一代化合物的探索是必要的。一个简单的，一步一步的协议确定的疟疾米不同人生阶段的实验杀虫剂的功效osquitoes将显著加强这些努力。
对细胞系和动物模型中药物作用的药理学研究已经建立的使用后生药物作为用于调节细胞和生物体的遗传学和生理学的有用工具。 DNA甲基化和组蛋白修饰是影响在多细胞生物体的基因表达不改变基本的DNA序列6 2后生机制。翻译后修饰，例如甲基化在维持细胞完整性和基因表达至关重要的作用，并且可影响几个基本过程7,8,9。研究在一些昆虫物种突出表观遗传学的重要性在涉及卵子发生过程和干细胞维持10，以及剂量补偿11。然而，这些方面在病媒尚待开发。用化合物调节该系统可蚊子为我们提供了在景点融入新颖杀虫剂目标的途径。 3- Deazaneplanocin A（DZNep）是一种已知的组蛋白甲基化抑制剂，其在不同类型的癌症的影响进行了研究12,13,14,15,16。 DZNep是一种稳定的水溶性后生药物间接抑制组蛋白赖氨酸 N- -methyltransferase（EZH2），在哺乳动物细胞中的Polycomb压制性复杂2（PRC2）的一个组件。 PRC2在调节干细胞的多细胞生物的生长中起重要作用，并且组蛋白甲基化是将PRC2介导的基因沉默的一个关键方面。在免疫缺陷小鼠中，细胞预先用DZNep已经显示出少致瘤17。这种药物正在成为用于研究其他疾病，如非酒精性脂肪肝疾病，其中EZH2牵连18。 DZNep是一个既定的S -adenosylhomocysteine（SAH）水解酶抑制剂19，20。的SAH水解导致一个抑制SAH的累积和，反过来，通过限制可用的甲基供体基团导致甲基转移酶活性的抑制。 SAH是由许多生物，包括昆虫，在他们的代谢途径利用的氨基酸衍生物。最近的一项研究表明，DZNep低剂量可能会影响滞育和延缓发展的昆虫21。
这里，一个强大的协议来调查对蚊子的各种生命阶段的水溶性化合物的效果十分发达。这个协议的三个部分，包括：用于检查在未成熟的蚊子，成人吸血雌性和雄性和雌性蚊子的酶活性的水溶性化合物的效果的说明。首先，DZNep溶解在水中以研究未成熟蚊发育和存活。这被执行以两种浓度进行比较，从在药物暴露10倍的增加所引起的任何差异。探索成人的雌蚊，DZNep药物的效果被添加到除颤羊血和供给血液中人为地女性。接着，对生殖力的药物的结果进行检测。最后，使用5,5'- dithiobis-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）作为指标来确定DZNep对成年雄性和雌性蚊子SAH水解酶抑制效果进行的酶活性测定。虽然该协议被显影用疟蚊， 冈比亚按蚊 ，它可以容易地适应于学习的任何种类的蚊子或其他昆虫感兴趣化合物的作用。在这个协议中详述的技术可能不被有效地应用到具有在水中或含水介质有限或没有溶解性的药物。
Protocol
Representative Results
Discussion
有几个步骤，这个协议的成功应用至关重要。对于幼虫检测，应注意正确的标签和复制每个测试浓度。随机化的测试样品和添加药物的指定量的各试验孔中是本实验装置的一个重要部分。之前加入第二龄蚊子幼虫到96孔微量，每个幼虫可以放在纸巾2-3秒，以除去多余的水。为了防止干燥，幼虫必须立即转移到用钝钳子的微孔板。这使水在各微孔板的体积以及与药物的浓度保持为意。当用于…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalgue Number | Comments |
| 96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
| Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
| Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
| Egg dish cups | |||
| Filter papers | Fisher | 09-795E | |
| Glass feeders | Virginia Tech | ||
| Glass tissue homogenizer | |||
| Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
| Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| Plate reader | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20C |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
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