Abstract
Insekticid resistens er et stort problem for malaria kontrolprogrammer. Myg tilpasse sig til en bred vifte af ændringer i miljøet hurtigt, hvilket gør malaria styre en allestedsnærværende problem i tropiske lande. Fremkomsten af insekticid resistente populationer berettiger udforskningen af nye target narkotika veje og forbindelser til bekæmpelse af smittebærende myg. Epigenetiske lægemidler er veletablerede i kræftforskning, men ikke meget om deres virkninger på insekter. Denne undersøgelse giver en enkel protokol til at undersøge de toksikologiske virkninger af 3-Deazaneplanocin A (DZNep), en eksperimentel epigenetisk lægemiddel til kræftbehandling på malaria vektor Malariamyg. En koncentrationsafhængig stigning i dødeligheden og fald i størrelse blev observeret i umodne myg udsat for DZNep, mens forbindelsen reduceret frugtbarhed af voksne myg i forhold til at kontrollere behandlinger. Derudover var der en lægemiddel-afhængigt fald i S -adenosylhomocystein (SAH) hydrolase aktivitet i myg efter udsættelse for DZNep forhold til kontrol behandlinger. Disse protokoller give forskeren en enkel, trin-for-trin procedure til vurdering af flere toksikologiske endpoints for en eksperimentel medicin og til gengæld demonstrere en unik multi-prong tilgang for at udforske de toksikologiske virkninger af vandopløselige epigenetiske lægemidler eller forbindelser af interesser mod vektor myg og andre insekter.
Introduction
Malaria er ansvarlig for det højeste antal insekt dødsfald i verden. Skønsmæssigt 219 mio tilfælde årligt på verdensplan, hvilket resulterer i ca. 660.000 dødsfald, primært i Afrika 1. Trods en fælles indsats malaria programmer, står flere udfordringer. Mens insekticide behandlede myggenet og indendørs sprøjtning formular centrale elementer i programmet, resistens over for insekticider i de lokale befolkninger hindre disse bestræbelser 2. Den hurtige stigning i insekticid resistente myg befolkninger er i vid udstrækning tilskrives evne malaria myg til hurtigt at tilpasse sig ændringer i deres miljø og udnytte forskellige nicher 3,4,5. For at overvinde de eksisterende mekanismer insekticidresistens, er udforskningen af nye insekticid mål og næste generation forbindelser berettiget. En simpel, trin-for-trin-protokol til bestemmelse af effektiviteten af eksperimentelle insekticider på de forskellige stadier af malaria mosquitoes vil i væsentlig grad øge disse bestræbelser.
Farmakologiske undersøgelser af effekter narkotika på cellelinjer og dyremodeller har etableret brugen af epigenetiske lægemidler som et nyttigt redskab til modulering af genetik og fysiologi af celler og organismer. DNA-methylering og histon modifikation er to epigenetiske mekanismer, der påvirker genekspression i flercellede organismer uden at ændre den underliggende DNA-sekvens 6. Indlæg translationelle modifikationer såsom methylering spiller en afgørende rolle i at opretholde cellulær integritet og genekspression, og kan påvirke flere grundlæggende processer 7,8,9. Forskning i nogle insektarter har understreget betydningen af epigenetik i processer, der involverer oogenesen og stamcelle vedligeholdelse 10, samt dosering kompensation 11. Men sådanne aspekter sygdomsvektorer endnu at blive udforsket. Ved hjælp af en forbindelse til at modulere dette system i myg kan give os iseværdigheder i de hidtil ukendte insekticid target pathways. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) er en kendt histon-methyleringsinhibitor, der påvirker forskellige typer af kræft er blevet undersøgt 12,13,14,15,16. DZNep er en stabil vandopløselig epigenetisk lægemiddel, der indirekte inhiberer histon lysin N -methyltransferase (EZH2), en bestanddel af Polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2) i pattedyrceller. PRC2 spiller en vigtig rolle i reguleringen af væksten af stamceller i flercellede organismer, og histon methylering er et centralt aspekt af PRC2 medieret gendæmpning. I immunokompromitterede mus, har celler forbehandlet med DZNep vist sig at være mindre tumorigene 17. Dette stof er ved at blive brugt til at studere andre sygdomme, såsom ikke-alkoholisk fedtlever, hvor EZH2 er impliceret 18. DZNep er en etableret S -adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase inhibitor 19, 20. Inhiberingen af SAH hydrolase resulterer i enakkumulering af SAH og til gengæld fører til hæmning af methyltransferase aktivitet ved at begrænse tilgængelige methyl donorgrupper. SAH er et aminosyrederivat anvendes af mange organismer, herunder insekter i deres metaboliske veje. En nylig undersøgelse har vist, at DZNep i lave doser kan påvirke diapause og forsinke udviklingen i insekter 21.
Her er en robust protokol til at undersøge virkningerne af en vandopløselig forbindelse på forskellige stadier af myg udvikles. De tre dele i denne protokol omfatter instruktioner til at undersøge virkningerne af en vandopløselig forbindelse på umodne myg, hunner voksne blod-fodring og enzymaktiviteten af voksne mandlige og kvindelige myg. Først DZNep opløst i vand for at studere umodne mosquito udvikling og overlevelse. Dette udføres ved to koncentrationer til at sammenligne eventuelle forskelle, der opstår fra 10 gange stigning i narkotika eksponering. At udforske effekten af lægemidlet på voksen kvindelige myg, DZNeptilsættes til defibrilleres får blod og fodret blodet kunstigt til hunner. Efterfølgende resultatet af lægemidlet på frugtbarhed undersøgt. Endelig er en enzymaktivitet assay udført under anvendelse af 5,5'-dithiobis- (2-nitrobenzoesyre) (DTNB) som en indikator for at bestemme virkningen af DZNep på SAH-hydrolase hæmning hos voksne mandlige og kvindelige myg. Mens denne protokol er udviklet med en malaria myg, Malariamyg, kan det let tilpasses til at studere virkningerne af forbindelser af interesse på alle arter af myg eller andre insekter. De teknikker, der er beskrevet i denne protokol, kan ikke effektivt anvendes til et lægemiddel med begrænset eller ingen opløselighed i vand eller vandige medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: De tre dele af protokollen beskriver vandige eksponering af DZNep lægemidlet til larver myg, en eksponering blod baseret på DZNep til voksne kvinder til at studere dens virkning frugtbarhed, og SAH hydrolase hæmning af DZNep målt ved anvendelse af en simpel kolorimetrisk teknik. En skematisk gengivelse af disse assays er vist i figur 1.
1. Umodne Mosquito Udvikling og efterladte assays
BEMÆRK: I dette afsnit forklares brugen af et vandopløseligt stof, der påvirker myggelarver udvikling og overlevelse.
- Hatch A. gambiae æg ved 28 ° C i destilleret vand (dH 2 O) og bag dem til 2. stadiums larver.
- Tag en seks-brønds DNAse, RNase-frit cellekultur plade og hæld 10 ml dH2O til hver brønd.
- Vælg myggelarver på 2. stadium og tilsættes 15 larver per brønd. Før du tilføjer 2. instar larver til plade, sut dem på et stykke køkkenrulle for 2-3 sek for at fjerne overskydende vand.
- Label brønde med farvekodede bånd til randomisering eksperiment. Etiket 2 brønde pr testkoncentration på hver plade (figur 2).
- Forbered en 1 mM DZNep hydrochlorid (MW = 298,73) stamopløsning ved at opløse 0,3 mg DZNep i 1 ml dH 2 O. Tilføj stamopløsning af DZNep.HCl mærkede brønde for at opnå en slutkoncentration på 0,5 uM og 5,0 uM.
BEMÆRK: Stamopløsningen kan opbevares ved 4 ° C til kortvarig (1 dag til en måned) eller -20 ° C i lang sigt (mere end en måned).
BEMÆRK: Tilsætning af stamopløsningen for ovennævnte koncentrationer vil ikke ændre den mængde vand i brøndene betydeligt. Men i tilfælde af meget højere koncentrationer, er det tilrådeligt at opløse forbindelsen i larvestadiet medium for at undgå unødvendig fortynding af forbindelsen. - Tilføj samme mængde flake fiskefoder til hver brønd. Dæk pladens og inkubere dem ved 28 ° C i en inkubator.
- Optag dødeligheden for DZNep-behandlede og ubehandlede larver myg efter en 24-timers udsættelse periode. Fjern og kassér eventuelle døde larver. Gentag denne optagelse hver dag, indtil alle larver dør eller forpupper sig og fremstå som voksne. Optag størrelsen af larver hver anden dag, dvs. dag 0, 2, 4, 6, 8, indtil de forpupper.
- Analyser larveudvikling og dødelighed data ved hjælp af en passende statistisk analyse software.
BEMÆRK: Et søjlediagram kan anvendes til at repræsentere data dødeligheden i Microsoft Excel. Multivariate variansanalyse (MANOVA) udføres med en software som JMP eller SPSS vil afsløre, om forskellige doser af lægemidlet medføre signifikant forskellig overlevelse myggelarver.
2. Frugtbarhed Assay ved at administrere lægemidlet gennem kunstig Feeder til kvindelige myg
BEMÆRK: Dette afsnit indeholder oplysninger om tilføjelse af lægemidlet til blodet and tilføre den til voksne kvindelige myg ved anvendelse af en kunstig fødesystem.
- Opsætning voksen myg bure med lige mange mandlige og kvindelige myg til kontrol og test bur. Giv 10% sukkeropløsning dyppet i vatkugler til både bure indtil hunnerne er klar til fodring (3-5 dage er optimal for Malariamyg).
- 2 timer før blodet fodring, fjerne vatkugler at sikre hunner er sulten.
- Saml to kunstige blod foderautomater, der består af en omvendt tragt bred bund glas (diameter = 50 mm, længde = 70 mm) og en omgivende plast forseglet med industriel lim. Vedhæft plastrør (diameter = 7 mm) til to fødere 'forretninger (diameter = 10 mm) via stik til tilgang og afgang af vand. Mærk de to foderautomater som "Control" og "5 uM DZNep."
- Ved hjælp af en kommercielt tilgængelig varmeelement, der er oprettet af programmet for fodring. I "Menu" gå til "Indstillinger"og vælg "Setpunkter"; forudindlæste programmer vises. Vælg "SP1", og indstil temperaturen til 37 ° C.
BEMÆRK: Varmelegemet sikrer, at blod administreres holdes ved en konstant temperatur. Yderligere indstillinger program kan anvendes til forskellige myg eller insektarter. - Fyld en spand med vand og nedsænkes varmeelementet i vandet.
- Skær et firkantet stykke Parafilm (50 mm x 50 mm) og strække den til at lave en tynd membranøs film. Dæk bunden af de kunstige foderautomater med Parafilm. Klip et stykke Parafilm (50 mm x 10 mm), strække det og forsegle kanterne af foderautomater.
- Saml systemet forbinder fødere og varmeelement af rørene. Når du er færdig, tænde for systemet, og vælg "SP1". Tryk på "Enter" for at starte systemet.
BEMÆRK: Vandet får opvarmet til 37 ° C og holdes ved denne temperatur. - Overvåg the temperatur af vand ved hjælp af et termometer i vandet spand.
BEMÆRK: Stikkene og rør hjælpe med at opretholde en konstant cirkulation af vand gennem systemet, således at temperaturen af blodet forbliver på 37 ° C. - Fyld en fladbundet bakke med 10% blegemiddel løsning, der vil blive brugt til at dekontaminere nogen spildt blod.
- Tilsæt 2 ml defibrilleres får blod til et mikrocentrifugerør. Mærk dette som "kontrol". Gentag processen for den eksperimentelle rør mærket som "5 uM DZNep" .Add 6 pi DZNep stamopløsning (se trin 1.5) til den eksperimentelle rør mærket "5 uM DZNep" Bland forsigtigt blodet og narkotika ved at vende det flere gange. Inkubér røret 10 minutter ved stuetemperatur.
- Ved hjælp af en pipette, tilsættes 2 ml kontrol og blodprøve til toppen af tilsvarende mærkede foderautomater. Kassér pipetten i blegemiddel løsning. Dæk buret med en mørk taske og indånder luft på bur jævne mellemrum for at fremme females til fodring.
- Lad myg foder til ca. 30 min. Når fodring er afsluttet, slukkes varmelegemet, tage automaterne ud og fratage Parafilm. Soak feeder i blegemiddel løsning for omkring 5 min og skyl godt i deioniseret vand.
- Fjern foderautomater og sætte vatkugler med sukker vand på burene i 48 timer. Placer en æg skålen, der indeholder vand og filterpapir i burene natten over for at lette æglægning. Mærk hver æg skålen med den respektive test eller kontrol koncentration.
- Fjern æg skålen næste dag og undersøge antallet og sammensætningen af æg under et stereo mikroskop. Anskaf billeder ved hjælp af Q-colors5 software. Tæl antallet af æg. Analyser forskel i antallet af æg fra test- og kontrol- bure.
BEMÆRK: en uparret t-test kan anvendes til at bestemme, om antallet af æg er signifikant forskellige (p ≤0.05).
3. Biokemisk assay af Mosquito enzyminhiberingved Drug
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver et enzym aktivitet under anvendelse af DTNB som indikator for at bestemme virkningen af DZNep om SAH hydrolase hæmning hos voksne mandlige og kvindelige myg.
- Forbered en 0,1 M Na 2 HPO 4 (dinatriumphosphatheptahydrat) ved tilsætning af 14,19 g Na 2 HPO 4 til 1 L af dH 2 O. Dernæst forberede en 0,1 M NaH 2 PO 4 (monobasisk natriumphosphat) opløsning ved tilsætning af 13,79 g NaH 2 PO 4 til 1 L af dH 2 O.
- 0,1 M Na 2 HPO 4 opløsningen med 0,1 M NaH 2 PO 4-opløsning til pH 8,5 titreres.
BEMÆRK: Dette vil være det arbejde stamopløsning af 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). - Der fremstilles en homogenisering opløsning af 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) ved tilsætning af 0,3% Triton X-100.
BEMÆRK: homogenisering opløsning kan opbevares ved 4 ° C. - Prepare en 1,6 mM SAH (MW = 384,4) opløsning ved at opløse 6,15 mg SAH i 10 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5).
- Der fremstilles en 1,6 mM DTNB (MW = 396,4) opløsning ved at opløse 6,3 mg af DTNB i 10 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Hold friske DTNB løsning på is indtil brug.
- Forbered en 1 mM DZNep.HCl (MW = 298,73) opløsning ved at opløse 0,3 mg DZNep i 1 ml dH 2 O. Dernæst fortyndes 1 mM DZNep løsning i en række koncentrationer fra 1000 pM til 0,002 pM i dH 2 O.
- Til måling af SAH-hydrolase inhibering med DZNep forberede et råt enzymekstrakt af myg: homogeniseres 10 ikke-blod-fed voksne myg i 1 ml iskold 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), indeholdende 0,3% Triton X- 100, ved hjælp af et glas vævshomogenisator. Overfør homogenatet til en 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Centrifugeres homogenatet i 5 minutter ved 10.000 xg ved 4 ° C. Supernatanten overføres til en ren1,5 ml mikrocentrifugerør. Brug supernatanten som enzymkilden til SAH biokemisk assay.
- For blindprøven behandling (dvs. ingen DZNep, intet enzym), tilsættes 50 pi 1,6 mM SAH, 50 pi 1,6 mM DTNB, og 100 pi 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) til de enkelte brønde i en 96-brønds, fladbundet mikroplade.
- Til kontrol (dvs. ingen DZNep), tilsættes 50 pi 1,6 mM SAH, 50 pi 1,6 mM DTNB, 50 pi 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) og 50 pi enzym (SAH-hydrolase opnået fra rå ekstrakt) til den enkelte brønde.
- For DZNep behandlinger, tilsættes 50 pi 1,6 mM SAH, 50 pi 1,6 mM DTNB, 50 pi enzym og 50 pi valgt DZNep fusions individuelle brønde. Forbered 4 replikater pr behandling og kontrol.
- Læs den optiske densitet (OD) af SAH enzymprøver ved 405 nm i 5 minutter ved 20 sek intervaller ved hjælp af en 96-brønds mikropladelæser.
- Træk den tomme OD fra kontrol and behandling OD opnået fra hver brønd. Beregn procent resterende SAH hydrolase aktivitet ved hjælp af følgende ligning:% resterende aktivitet = (Behandling OD / Kontrol OD) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 er en skematisk repræsentation af assays; Det beskriver de forskellige trin i proceduren og opført i denne artikel. Da protokollen er baseret på forskellige livsstadier af myg, er der ingen særlig sekvens, der skal følges for forsøgene beskrevet her. Brugeren kan vælge at udføre et eller flere assays på samme tid, afhængigt af prøven tilgængelighed.
Figur 2 viser pladen oprettet for de umodne myg udvikling og efterladte assays. Antallet af testkoncentrationer og replikater kan ændres afhængigt af brugerens krav og narkotika tilgængelighed. For umodne mosquito assay blev 1 mM stamopløsning af DZNep tilsat til vand indeholdende myg for at opnå en slutkoncentration på 0,5 um og 5 um sammen med en kontrol gryde med brønde, der indeholder en stoffri befolkning. Forsøget viste, at mere larver og pupper Ovived i kontrolbrøndene end i DZNep-behandlede brønde.
Figur 3 viser virkningen af DZNep på den samlede efterladte af malaria myg under eksperimentet. Resultaterne viser, at den epigenetiske lægemiddel DZNep undertrykker vækst og udvikling og inducerer dødeligheden af umodne myg. Størstedelen af myg udsat for 0,5 uM døde på dag 10 af eksperimentet, mens et stort antal af de personer, der er udsat for 5 um døde ved dag 8. I modsætning hertil dødeligheden af myg i kontrolgruppen behandling (ingen lægemiddel) forblev upåvirket og flere opstået som voksne på dag 8 af eksperimentet. En omvendt forhold blev observeret mellem medikamentkoncentration og myg kropsstørrelse (figur 4).
Figur 5 illustrerer virkningen af DZNep på myg frugtbarhed. Voksne kvindelige myg fodret med blod indeholdende DZNep udviste et signifikant reduction i antallet af levedygtige æg. Figur 5A viser æg fra kontrol bur (intet lægemiddel). Figur 5B viser æggene opnået fra test bur. Et stort antal æg fra test bur var mørkere i farven og manglede flåd (luftfyldte udvidelser af exochorion) sammenlignet med æg opnået fra normale blod-fed kvindelige myg (figur 6). Fraværet af flåd sammen med mørkere farvede æg indikerer potentielle rolle epigenetik i exochorion formation.
Figur 7 viser virkningen af DZNep på SAH-hydrolase-aktivitet i voksne mandlige og kvindelige myg. En DZNep-afhængig nedgang i OD er observeret for hver lægemiddelbehandling sammenlignet med kontrolgruppen behandling (intet lægemiddel) at DZNep inhiberer SAH-hydrolase-aktivitet.
Figur 1:. Skematisk fremstilling af analyser ved anvendelse af en epigenetisk lægemiddel på malaria myg Den venstre del af ordningen viser udviklingen og efterladte assays under anvendelse af umodne myg. Den centrale del viser frugtbarhed analysen via blod-fodring lægemidlet til voksne kvinder. Den højre del viser den biokemiske assay af enzyminhibering ved lægemidlet.
Figur 2: plade afbilder den umodne myg udvikling og efterladte assay label "C" mærker kontrolbrønde.. Label "0.5" viser brønde med 0,5 uM DZNep. Label "5" angiver brønde med 5 uM DZNep.
Figur 3: Effekt af DZNep om efterladte af malaria myg. Koncentration-afhængig dødelighed observeres med umodne myg.
Figur 4:... Virkning af DZNep om udvikling af umodne myg (A) Larva fra kontrol behandling (size = 5 mm) (B) Larva behandlet med 0,5 uM DZNep (size = 4 mm) (C) Larva behandlet med 5 uM DZNep (size = 3 mm). Alle larver blev målt på samme dag af forsøget.
Figur 5:. Effekt af DZNep om myg frugtbarhed æg skålen fra kontrol behandling (intet lægemiddel) myg indeholder langt større antal æg (A) virksomrød med æg skålen af hunner behandlet med 5 pM DZNep (B).
Figur 6: Virkning af DZNep på æg struktur myg ses under et mikroskop. (A) Æg fra kontrol behandling (ingen medicin) myg vise flåd og roset-lignende forsamlinger. (B) æg fra myg behandlet med 5 pM DZNep mangler flåd og roset-lignende forsamlinger.
Figur 7:. SAH hydrolase hæmning af DZNep i malaria myg DZNep forårsager et fald i OD sammenlignet med kontrol behandling (intet lægemiddel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere trin er afgørende for en vellykket gennemførelse af denne protokol. For larver assay, bør man sørge for at mærke og kopiere hver testkoncentration korrekt. Randomisering testprøver og tilsætte den udpegede mængde lægemiddel til respektive testbrønde er en vigtig del af denne eksperimentelle oprettet. Før du tilføjer 2. instar myggelarver til en 96-brønds mikroplade, kan hver larve sættes på et stykke køkkenrulle for 2-3 sek for at fjerne overskydende vand. For at undgå udtørring, skal larver straks overført til mikropladebrøndene ved hjælp af en stump pincet. Dette sikrer mængden af vand i hvert mikropladebrønd og koncentration af lægemiddel forbliver som tilsigtet. Ved overførsel larver for at måle deres kropslængde, anbefales det at sætte larverne på is i få minutter for at holde dem stille. Ved tilpasningen af denne protokol for en anden forbindelse, skal man sørge for at bestemme mængden af stamopløsningen til hverbrønd. I sådanne tilfælde kan det være bedre at opløse den beregnede mængde af forbindelsen i vand umiddelbart inden tilsætning af larver i hver mikropladebrønd.
For blod fodring analyser, er det afgørende, at myg er udsultet hensigtsmæssigt ved at fjerne sukker vand mindst 2 timer før af eksperimentet. I modsat fald kan resultere i ufuldstændig fodring og ringe effekt på voksne kvindelige ægproduktion. Grundig blanding og ensartet fordeling af lægemidlet i blodet er et vigtigt skridt såvel, som DZNep tager et par minutter for at opløse. Hvis lægemidlet behandlede blod tilføres straks DZNep ikke bliver ligeligt fordelt i mosquito system. Det anbefales kraftigt, at det defibrilleres blod er frisk (dvs. mindre end en uge siden udvinding dato) for bedre resultater.
Der er flere trin afgørende for succes af et biokemisk assay med en forbindelse af interesse. Koncentrationer af hver stamopløsning anvendes i denne proto KOL er blevet optimeret til DZNep. For at tilpasse protokol for en anden forbindelse, foreslår vi at teste en række forskellige pH, SAH, DTNB koncentrationer og insekt stikprøvestørrelser at fastlægge de mest pålidelige resultater. Fremstilling af rå enzymekstrakt er den mest tidskrævende trin i denne procedure. Det anbefales under homogenat forberedelse til at anvende ikke mere end 10 voksne myg, lipider til stede i supernatanten kan hindre absorbansaflæsning. For at undgå dette problem, kan det øverste lag af lipider i supernatanten (ved hjælp af en enkelt kanal mikropipette) fjernes efter trin 3.8. Supernatant skal overføres til et rent mikrocentrifugerør. Trin 3.8 skal gentages for at kassere eventuelle resterende viskose lipider. Den resterende klare supernatant skal puljet fra alle rør og blandet forsigtigt. En multikanal-pipette kan bruges til øget effektivitet for at tilføje SAH i brøndene. DTNB anvendes som en indikator i assayet, og bør være forberedt sidste og holdes på is.
nt "> Denne protokol giver brugeren enkle trin til at afprøve effekten af en forbindelse på forskellige livsstadier af myg. Der er dog nogle begrænsninger for anvendelsen af denne protokol. Denne teknik afhænger primært af opløselighed DZNep vand. Umodne larver udsættes for lægemidlet opløst i deres omgivende medium. Hvis forbindelsen, der testes, er uopløselige i vandige medier, kan det gøre denne protokol mindre effektiv. For at teste frugtbarhed vi udsat de voksne hunner til lægemiddel opløst i defibrilleres fåreblod. Denne ville ikke være muligt, hvis et laboratorium rears mosquito kolonier på blod af pattedyr direkte (dvs. anvender mus eller marsvin til fodring myg).Kombinationen af forskellige assays er beskrevet i denne artikel, giver brugeren en ny måde at teste effekten af en vandopløselig forbindelse på insekter. DZNep er for det meste tilføjet til cellelinier in vitro til kræftforskning; men denne protokol giver user til at undersøge eventuelle effekter på forskellige stadier af et insekt in vivo. Desuden, det giver også forskeren med trin-for-trin retningslinjer for toksikologiske analyser. I den nuværende litteratur, er viden begrænset med hensyn til virkningerne af epigenetiske lægemidler på insekter. Brug DZNep som et eksempel, vi giver en procedure, der kan anvendes som en forudsætning skridt mod at udforske andre epigenetiske lægemidler eller nye forbindelser som potentielle insekt bekæmpelsesmidler. Selv om denne protokol er udviklet til malaria myg, kan det være indrettet til at teste virkningen af DZNep eller enhver vandopløselig forbindelse af interesse i andre myg eller insektarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
| Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
| Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
| Egg dish cups | |||
| Filter papers | Fisher | 09-795E | |
| Glass feeders | Virginia Tech | ||
| Glass tissue homogenizer | |||
| Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
| Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| Plate reader | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- CDC Report. , Available from: http://www.cdc.gov/malaria (2010).
- Gatton, M. L., et al. The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa. Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).
- Sternberg, E. D., Thomas, M. B. Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases. Trends in Parasitology. , (2014).
- Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. 2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae. Malaria Journal. 8, 147 (2009).
- Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).
- Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. Update on Cancer Therapeutics. Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1. Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).
- Conrad, T., Akhtar, A. Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription. Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).
- Miranda, T. B., et al. DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation. Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).
- Cui, B., et al. PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep). J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).
- Fujiwara, T., et al. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation. The Journal of Biological Chemistry. , (2014).
- Li, Z., et al. The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer. Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).
- Nakagawa, S., et al. Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells. Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).
- Crea, F., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer. Molecular Cancer. 10, 40 (2011).
- Vella, S., et al. EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD. International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).
- Tan, J., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells. Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).
- Chiang, P. K., Cantoni, G. L. Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo. Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).
- Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).
