Summary
Nematóides entomopatogênicos são vermes que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Demonstramos métodos de amostragem utilizados para o isolamento destes nematóides do solo utilizando duas técnicas: a iscagem inseto ea armadilha Branco modificado, para a recuperação de nematóides de amostras de solo e cadáveres de insetos infectados, respectivamente.
Abstract
Nematóides entomopatogênicos (aka EPN) representam um grupo de nematóides que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Esses nematóides pertencem a duas famílias: Steinernematidae e Heterorhabditidae. Até agora, mais de 70 espécies já foram descritas no Steinernematidae e existem cerca de 20 espécies no Heterorhabditidae. Os nematóides têm uma parceria de mutualismo com bactérias Enterobacteriaceae e, juntos, eles agem como um complexo potente inseticida que mata uma grande variedade de espécies de insetos.
Aqui, vamos nos concentrar nas técnicas mais comuns considerados para a recolha de EPN do solo. A segunda parte desta apresentação centra-se na técnica de atracção de insectos, uma abordagem amplamente utilizada para o isolamento de EPN de amostras de solo, e a técnica de armadilha branco modificado, que é utilizado para a recuperação destes nematóides de insectos infectadas. Estes métodos e técnicas são passos fundamentais para o sucesso da criação EPN cultUres em laboratório e também servir de base para outros bioensaios que consideram estes nematóides como organismos modelo para a pesquisa em outras disciplinas biológicas. As técnicas indicadas nesta apresentação correspondem às realizadas e / ou concebida por membros da SP laboratório, bem como os descritos por vários autores.
Introduction
Muitos nematóides estão associados com insetos, e suas interações hospedeiro variam de benéfico para prejudicial. Aqui, vamos nos concentrar em um grupo de nematóides que são patógenos de insetos, também conhecido como nematóides entomopatogênicos (ou EPN). Duas famílias de nematóides pertencem a este grupo de nematóides: Steinernematidae e Heterorhabditidae 11,13. O seu efeito patogênico é de fato conferida pela sua interação com anaeróbios facultativos bactérias entéricas (bactérias Xenorhabdus associar steinernematids e bactérias Photorhabdus associar heterorhabditids) 2. As bactérias são vetorizado de um hospedeiro a outro por insetos a única fase livre nematóide de vida, a terceira fase juvenil infecciosa (também conhecida como juvenil Dauer, juvenil infecciosa ou IJ), que vive no solo. Uma vez dentro do inseto, os nematóides liberar as bactérias na hemolinfa do inseto, que matam o inseto hospedeiro por septicemia maciça. As bactérias tambémdegradam os tecidos do insecto e se tornar fonte de alimento dos nematóides, permitindo-lhes a amadurecer e multiplicar. Normalmente, uma ou duas gerações de nematóides adultos são produzidos dentro do cadáver do inseto. A progênie dos últimos reassociates geração de adultos com algumas células bacterianas em um mais especializar maneira que sua relação nutricional anterior e cultivar essas células em seus intestinos que se deslocam para fora do inseto carcaça no solo onde irão aguardar outro inseto parasitar 6,11,14 (Figura 1).
Desde sua descoberta em 1927, EPN foram consideradas alternativas valiosas para pesticidas químicos como eles podem parasitar uma grande variedade de insetos que são pragas agrícolas 3,4,5. No entanto, ao longo das últimas duas décadas, esses nematóides e suas bactérias simbióticas ter sido reconhecido como um sistema modelo para o estudo de aspectos maleável biológicos, ecológicos e evolutivos de host-micróbio interactions 14.
O objetivo desta apresentação é mostrar os métodos e técnicas mais comumente utilizadas para a amostragem do solo e isolamento de EPN. Uma variedade de ferramentas está disponível e pode ser usado para a coleta de amostras de solo, incluindo: corers solo, espátulas, escavadoras pós-buracos, brocas, tubos de amostragem, pás de mão, entre outros (Figura 2).
Dependendo do objectivo do estudo, duas estratégias de amostragem pode ser considerada: a) estratificado, b) amostragem (Figura 3). A amostragem estratificada é normalmente usado como parte de um estudo intensivo de uma área específica ou demarcada sobre um dado período de tempo. Em geral, uma seção transversal é demarcado e amostras de solo são tomadas a intervalos previstos na transecção ao longo de um período de tempo (Figura 3A) 15. A amostragem aleatória é geralmente empregada quando o foco em uma área extensa. Esta estratégia de amostragem foi usado para estudar a diversidade de EPN fesde uma grande área geográfica ou região (Figura 3B) 12. Uma série de fatores podem ser considerados, dependendo do foco do estudo, incluindo uma grande variedade de elevações, texturas de solo e habitats (por exemplo., Campos cultivados, florestas, pastos, parques, praias, matas ciliares, etc.)
Mostramos a técnica de atracção de insectos, que foi originalmente descrito por Bedding e Akhurst 1 e representa uma alternativa simples e selectiva para a recuperação a partir de amostras de solo de EPN. Este é um processo selectiva que é baseado na premissa de que os nemátodos (estádio IJ) será atraído para uma série de insectos e que parasitam. Esta técnica também pode ser considerada para o isolamento de outros agentes patogénicos de insectos, tais como fungos, bactérias e 8,10.
Também demonstramos a técnica armadilha branco modificado que é utilizado para a recuperação de nemátodo progenitura de hospedeiros infectados insectos 7,14. Este é um esforço method que oferece a vantagem de recuperar uma "limpa" nematóide progênie livre de restos de cadáveres de insetos degradantes.
Finalmente, as técnicas descritas e mostradas neste artigo correspondem aos concebido e / ou realizados no nosso laboratório, bem como os descritos por vários colegas e colaboradores.
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Protocol
1. Coleta de Amostras de solo
- Considere que cobre uma área mínima de 2 - 4 m 2 para cada local de amostragem.
- Recolha de amostras de solo a uma profundidade de pelo menos 15 cm (Figura 4).
- Tome pelo menos 5 amostras aleatórias dentro desta área.
- Tome 3 subamostras por amostra. Dependendo do objetivo do estudo, ou combinar as subamostras ou mantê-los separados.
- Coloque cada amostra em um saco plástico. Considere duplo ensacamento para evitar vazamento de amostras (Figura 4).
- Amostras de etiquetas com um marcador à prova d'água. Inclua as seguintes informações de cada local de amostragem: informações do site (incluindo localidade / área / nome do site e GPS coordenar informações), data, habitat, a vegetação associada, temperatura, altitude, etc
NOTA: Se for o caso, recolher e / ou registrar a presença de insetos e outros invertebrados coletados com a amostra para posterior identificação. Eles podem representar potencial naturhospedeiros al EPN. - Ferramentas de recolha limpos entre as amostras mediante a lavagem com água e / ou desinfectar as com etanol a 70% ou solução de lixívia a 0,5%.
- Manter as amostras em um refrigerador (8 - 15 ° C) durante o transporte para o laboratório.
- Pegue uma porção da amostra de solo para análise para obter informações sobre a composição do solo, textura, umidade, condutividade elétrica ou outros parâmetros do solo desejados.
. 2 Isolamento Nematóides de amostras de solo: Técnica do Inseto-baiting
- Remova todos os detritos (ie., Rochas, pedaços de madeira ou casca, folhas, etc.), Coletados com suas amostras para evitar a contaminação com microorganismos saprobic.
- Adicionar água para umedecer o solo e facilitar a circulação de nematóides.
NOTA: Use um frasco de spray para aumentar lentamente o nível de umidade do solo. - Colocar aproximadamente 200 a 250 ml de solo húmido num recipiente de plástico limpo com uma tampa.
- Adicionar iscas de insetos. Considere 5 a 10 insectos para a superfície do solo de cada amostra (Figura 5).
- Cobrir o recipiente com tampa e ligar recipientes de cabeça para baixo.
- Manter recipientes no escuro e à temperatura ambiente (normalmente 22-25 ° C).
- Verifique os recipientes a cada 2 - 3 dias, e remover insetos mortos.
NOTA: adicionar insetos saudáveis adicionais para cada recipiente para posterior baiting da amostra de solo. - Remover insetos mortos dos recipientes. NOTA: Cadáveres com um marrom ou ocre coloração geralmente são parasitados por steinernematids, enquanto tijolo vermelho para cadáveres roxo escuro são parasitados por heterorhabditids.
- Enxágüe cadáveres em água estéril.
- Coloque cadáveres em uma armadilha Branco modificado para recuperação de nematóide progênie (ver procedimento abaixo).
. 3 Nematode recuperação de cadáveres infectados: Modificado Armadilha Branco
- Coloque a parte superior de um diâmetro 50 (ou 60) mm. Placa de Petri dentro de um prato grande (100 mm).
- Definir um pecadopapel de filtro circular gle (Whatman # 1) no interior do prato menor.
- Coloque cadáveres sobre o papel de filtro do prato menor certificando-se de cadáveres não se tocam para evitar qualquer contaminação.
- Encha o exterior (maior) placa de Petri com ca. 20 ml de água destilada estéril. Não adicionar água no prato que contém os cadáveres.
- Cobrir a grande placa de Petri e seu conteúdo, com a tampa (Figura 6).
- Rotular pratos de acordo. Adicione as seguintes informações: Nome do Nemátodo (espécie / isolado), a data de infecção (infecção data foi definida) e data armadilha (esta é a data em que a armadilha está configurado).
- Mantenha a armadilha RT até a emergência dos estágios juvenis infectantes (IJS) ocorre. Este processo pode levar entre 10 - 25 dias, dependendo da espécie e / ou tensão considerado nematóides.
- Colheita de água com IJs removendo o maior prato da armadilha e despejar água com nematóides para um copo.
- Permitir nemátodos decantar para a parte inferior da bEaker. Este processo pode demorar alguns minutos.
- Despeje água cuidadosamente, certificando-se de nematóides permanecem no fundo do copo.
- Lavar nematóides, adicionando mais água e permitindo que os nemátodos para decantar. Este passo pode ser repetido 2-3 vezes, até que a água é limpa.
- Colocar a suspensão de nemátodos num balão de cultura de tecidos (250 ml). Manter a concentração da suspensão a 1.000 - 3.000 nemátodos / ml.
- Frasco loja com suspensão de nematóides em uma sala fria ou em estufa entre 10-20 ° C.
NOTA: verifique frascos armazenados periodicamente como a vida de prateleira de EPN é variável. Normalmente steinernematids pode ser armazenado por 6-12 meses, sem a necessidade de subcultura, enquanto heterorhabditids pode exigir mais check-ups periódicos.
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Representative Results
Coleta de Amostras de solo
Em estágio Terceiro juvenis infectantes de EPN são os únicos estágios gratuitos de vida no ciclo de vida desses nematóides que residem no solo (Figura 1). Portanto, a recolha de amostras de solo é um método muito eficiente para recuperar estes nemátodos. Figura 4 mostra um perfil de solo que indica a profundidade a que devem ser recolhidas amostras. Preservar a umidade de uma amostra é um fator chave para a sobrevivência dos nematóides. Consequentemente, é importante para manter as amostras de solo em sacos de plástico e mantê-las a temperaturas baixas durante o transporte para o laboratório (Figura 4).
Nematóides Recuperação
Na natureza, as chances de encontrar insetos naturalmente parasitados por EPN são menos de 3%, a menos que haja uma epidemia e uma amostra maior de insetos com EPN infestação é encontrado. Portanto, rinhas de amostras de solo com insetos é uma aprox convenienteoach para melhorar a recuperação de EPN de seu habitat natural. figura 5 ilustra o método de iscas solo. Neste caso, foi usado um recipiente de plástico de 250 ml com uma tampa de rosca. Aproximadamente 250 g de solo foram colocados no recipiente e 5 - 10 G. larvas mellonella foram adicionados na superfície do solo (Figura 5 para a direita). Após 5 dias, o contêiner foi aberto para recuperar insetos mortos com sinais de infecção EPN. Observe as larvas infectadas com o nematóide com coloração vermelha (Figura 5 esquerda).
A Figura 6A mostra uma representação esquemática da armadilha branco modificado. Figura 6B demonstra a configuração da armadilha. Observe que cadáveres infectados EPN não se tocam e que papel de filtro na pequena placa de Petri permanece seco. Figura 6C mostra IJs emergente de cadáveres. Nota dos trilhos "de nematóides (IJS) que são formados na placa de Petri como eles se movem pararepele a água. O tempo para IJ surgimento de cadáveres é variável dependendo da espécie de nematóides e também depende da temperatura e da humidade em que a armadilha branco é mantida. Figura 6D mostra IJs já na água do prato maior desta armadilha. Observa-se que os nematóides na água olhar limpo e livre de tecidos de insetos.
Ciclo de vida Figura 1. De nematóides entomopatogênicos.
Figura 2. Pás e outros dispositivos utilizados para a coleta de amostras de solo. (A) clássico point-pá. (B) pá de mão. (C) Da esquerda para a direita: tubo Viehmeyer, espátula, tubos Oakfield, corers solo.
Figura 3. Estratégias de amostragem do solo. (A) estratificada. (B) aleatória.
Representação Figura 4. Esquemático da estratégia de amostragem do solo. Imagem à esquerda mostra um perfil de solo indicando profundidade desejada em que devem ser colhidas amostras. Imagem da direita mostra uma amostra de solo em um saco plástico com uma rotulagem adequada.
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Figura 5. Purga de amostras de solo com larvas de inseto. Imagem à direita mostra larvas saudáveis, enquanto imagem da esquerda mostra larvas mortas depois de um período de cinco dias isca.
Figura 6. Representação esquemática (A) e fotografias (BD) de uma armadilha Branco modificado. (B) Armadilha configurar; (C) close-up de cadáver infectado mostrando IJ emergência; (D) close-up mostrando aparecimento maciço de IJs de cadáveres na água.
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Discussion
Esta demonstração é a primeira de duas apresentações que descrevem um número de técnicas que são comummente usados para estudar EPN e suas bactérias simbióticas. Estas técnicas representam passos fundamentais para o sucesso da criação culturas EPN em laboratório e também servir de base para outros bioensaios que empregam EPN como organismos modelo para a pesquisa.
Vários levantamentos de solos de EPN têm mostrado que a sua abundância e distribuição pode variar entre estações, habitats e regiões geográficas 4, 5,9,15. Factores tais como a textura do solo, conteúdo de humidade, e temperatura, bem como a disponibilidade de acolhimento pode desempenhar um papel-chave na sua distribuição. Portanto, é fundamental que um conjunto de dados preliminares sobre a pesquisa. Uma vez que as amostras são colhidas, é importante que eles são processados o mais rápido possível. No entanto, se esta não é uma possibilidade, eles devem ser armazenados em uma câmara fria ou a outra unidade de controlo de temperatura apropriados. Diferentes temperaturas podem serconsiderado para armazenar contentores de iscagem de insectos, dependendo da origem das amostras. Normalmente, as temperaturas mais frias (por exemplo., 15 ° C) são considerados para amostras temperadas e para amostras de regiões tropicais, as temperaturas mais quentes (por exemplo., 30 ° C) são para contempladas.
A técnica do inseto baiting é o método mais comumente utilizado para a recuperação de EPN de amostras de solo. É uma estratégia conveniente que permite a recuperação de EPN no laboratório. Última larvas da traça da cera, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) são geralmente considerados; no entanto, outros hospedeiros de insetos (ou seja, grilos, larvas de farinha, larvas de besouro, etc) e / ou fases apropriadas podem ser considerados e são recomendados para uso. Alguns estudos têm mostrado que um único ciclo de extracção do método Galleria-isca é muitas vezes insuficiente para determinar a presença de EPN numa amostra particular ou para a extracção de todo o EPN de amostra de solos 15. Normalmente, as taxas de recuperação varia entre 20 - 40% 12,15.
Uma alternativa para a atracção de amostras de solo no laboratório é a consideração de iscagem in situ. Esta é a colocação de iscos de insectos no ponto de amostragem. Neste caso, os insectos são colocados em gaiolas (geralmente feita de um metal ou de plástico de malha) e são deixados em locais demarcado na área de estudo para um dado período de tempo. As gaiolas com os insetos são então recuperados e examinados para infecção EPN. No entanto, esta abordagem é trabalhoso e demorado 15.
A técnica de interceptação de nematóide foi originalmente concebido por White 10 e mais tarde modificado por Kaya e Banco de 6. A técnica utiliza a atração de nematóides à água (ou seja, hygrotropism positivo) e recupera com sucesso estágios infectantes de EPN livres de tecidos e / ou restos de insetos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer aos membros anteriores do Banco de laboratório: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta e Victoria Miranda-Thompson por suas contribuições para a melhoria de muitos destes protocolos. Agradecemos o apoio da National Science Foundation (subvenções IOS-0840932 e IOS-0724978) a SP estoque.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
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