Summary
Entomopatojenik nematodlar böcek geniş bir yelpazede parasitize toprakta yaşayan yuvarlak solucan bulunmaktadır. Sırasıyla toprak örneklerinin ve enfekte olmuş böcek kadavra, nematod geri kazanılması için böcek kızdırma ve modifiye edilmiş beyaz tuzak: iki teknikler kullanılarak topraktan bu nematod izolasyonu için kullanılan örnekleme yöntemlerini göstermektedir.
Abstract
Entomopatojenik nematodlar (aka EPN) böceklerin geniş bir yelpazede parasitize toprakta yaşayan nematod bir grubu temsil eder. Steinernematidae ve Heterorhabditidae: Bu nematod iki aileye aittir. Şimdiye kadar, 70'in üzerinde tür Steinernematidae tarif edilmiştir ve yaklaşık 20 tür Heterorhabditidae de vardır. Nematodlar Enterobacteriaceae bakteri ile bir ortaklık mutualistik ve birlikte böcek türlerinin geniş bir yelpazede öldüren kuvvetli bir insektisid kompleksi olarak hareket ederler.
Bu yazıda, topraktan EPN toplamak için düşünülen en yaygın teknikler üzerinde durulacak. Bu sunumun ikinci bölümü böcek-kızdırma tekniği, toprak örneklerinden EPN izolasyonu için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, ve enfekte olmuş böcekler bu nematod kurtarma için kullanılan modifiye Beyaz tuzak tekniği üzerinde duruluyor. Bu yöntemler ve teknikler EPN kültünün başarılı kurulması için önemli adımlarLaboratuvarda ayrıca ures diğer biyolojik disiplinlerde araştırma için bir model organizma bu nematod dikkate diğer biyoanalizlere için temelini oluşturur. Bu sunumda gösterilen teknikler SP Stock laboratuar üyelerinin yanı sıra, çeşitli yazarlar tarafından tarif edilenler ile gerçekleştirilebilir ve / ya da tasarlanmış karşılık gelir.
Introduction
Birçok nematod böcekler ile ilişkili, ve ev sahibi ilişkileri yararlı gelen zararlı değişir edilir. Burada, aynı zamanda entomopatojenik nematod (veya EPN) olarak bilinen böcek patojen nematodlara, bir grup üzerinde odaklanır. Steinernematidae ve Heterorhabditidae 11,13: İki nematod aile nematod bu gruba aittir. Onların patojenik etkisi fakültatif anaerobik enterik bakteriler (Wenorhabdus bakteri heterorhabditids ile ilişkilendirmek steinernematids ve Fotorhabdus bakteri ile ilişkilendirmek) 2 ile etkileşimi tarafından kazandırılan aslında. Bakteri toprakta yaşayan tek serbest yaşayan nematod aşamasında, (ayrıca Dauer yavru, enfektif yavru veya IJ olarak da bilinir) üçüncü aşama enfektif yavru, tek böceğin diğerine vectored edilir. Bir kez böcek içinde, nematodlar büyük septisemi ile böcek ev sahibi öldüren, böceğin hemolimf içine bakteri bırakın. Ayrıca, bakterilerböceğin dokularını aşağılamak ve onları olgun ve çoğalmaya izin nematodların 'besin kaynağı olur. Genellikle, yetişkin nematod bir veya iki kuşak böcek kadavranın içinde üretilmektedir. Birkaç bakteri hücreleri ile son nesil yetişkin yeniden ilişkilendirir soy, daha önceki beslenme ilişki daha şekilde uzmanlaşmış ve onlar parasitize başka böcek bekleyecek toprağa böcek karkas dışarı hareket olarak bağırsaklarında bu hücreleri beslemek 6,11,14 (Şekil 1).
Onlar tarım zararlıları 3,4,5 olan böceklerin geniş bir yelpazede parasitize gibi 1927 yılında keşfedilmesinden bu yana, EPN'dir kimyasal pestisitlerin değerli alternatifleri kabul edilmiştir. Ancak, son iki yılda, bu nematodlar ve simbiyotik bakterilerin konak-mikrop ETKİLEŞİMİ biyolojik, ekolojik ve evrimsel yönlerini incelemek için uysal bir model sistem olarak kabul edilmiştirns 14.
Bu sunumun amacı yöntemleri ve en yaygın toprak örneklemesi ve EPN izolasyonu için kullanılan teknikleri göstermektir. Çeşitli araçlar mevcuttur ve dahil olmak üzere toprak örnekleri toplamak için kullanılabilir: Toprak corers, mala, post-delik kazma, burgular, örnekleme tüpleri, el kürek, diğerleri arasında (Şekil 2).
Çalışmanın amacına bağlı olarak, iki örnekleme stratejileri olarak kabul edilebilir: a) tabakalı, b) rastgele örnekleme (Şekil 3). Tabakalı örnekleme genellikle belirli bir zaman süresi boyunca belirli bir ya da demarked alanda yoğun bir çalışmanın bir parçası olarak kullanılır. Genel olarak, bir transect demarked ve toprak örnekleri belirli bir süre (Şekil 3A) üzerinde 15 transect belirtilen aralıklarla alınır. Geniş bir alanda odaklanarak zaman rastgele örnekleme genellikle kullanılır. Bu numune alma stratejisi EPN f çeşitliliğini incelemek için kullanılmıştırgeniş bir coğrafi alana veya bölge (Şekil 3B) 12 rom. Bir dizi faktör yüksekliklerde, toprak dokular ve habitatları (örn.., Ekili alanlar, ormanlar, meralar, parklar, kıyılarda, nehir kıyısı alanları, vb) çeşitli bir yelpazede de dahil olmak üzere çalışmanın odak bağlı olarak kabul edilebilir.
Başlangıçta yatak ve Akhurst 1 tarafından tarif edildiği ve toprak numunelerinden EPN geri kazanılması için basit ve seçici bir alternatif temsil eder böcek yem tekniği göstermektedir. Bu nematod (IJ aşama) bir böceğin çekti ve onu parasitize olacağını öncül dayalı bir seçici işlemdir. Bu teknik aynı zamanda, diğer böcek mantar gibi patojenlerin ve bakterilerin izolasyonu için 8,10 olarak kabul edilebilir.
Ayrıca enfekte olmuş böcek ana 7,14 ikinci nematod döl almak için kullanılan modifiye edilmiş beyaz tuzak tekniği göstermektedir. Bu araya bir zahmetsizaşağılayıcı böcek kadavra enkaz ücretsiz 'temiz' bir nematod döl alma avantajı sunuyor hod.
Son olarak, tarif edilen ve bu makalede gösterilen teknikler tasarlanmış ve / veya laboratuarda yanı sıra çeşitli arkadaşları ve arkadaşları tarafından tarif edilenlere gerçekleştirilen edilenlere tekabül eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Toprak Örnek Toplama
- Her örnekleme site için 4 m 2 - 2 minimum alanı kapsayan düşünün.
- En az 15 cm derinlikte (Şekil 4) de toprak örnekleri toplamak.
- Bu alanda en az 5 rastgele numune almak.
- Örnek başına 3 Alt-numûnelerin al. , Çalışmanın amacı bağlı numûnelerin birleştirmek veya onları ayrı tutmak ya.
- Bir plastik torba içinde her örnek yerleştirin. Numunelerin sızmasını (Şekil 4) önlemek için çift torbalama düşünün.
- Su geçirmez bir işaretleyici ile etiket örnekleri. Vb (yerellik / alan / site adı ve GPS koordinat bilgileri dahil) Site bilgileri, tarih, habitat, ilişkili bitki örtüsü, sıcaklık, yükseklik,: Her örnekleme sitesinden aşağıdaki bilgileri içerir
NOT: Varsa, böcekler ya da sonraki tanımlama için numune toplanan diğer omurgasız varlığını toplamak ve / veya kaydedin. Bunlar potansiyel natur temsil edebilirarkadaşları EPN ana. - Bol su ile yıkama ve / veya% 70 etanol ya da% 0.5 'lik ağartıcı çözeltisi ile dezenfekte edilmesi ile örnekler arasında temiz toplama araçları.
- Laboratuara taşınması sırasında - (15 ° C 8) bir soğutucu örnekleri tutun.
- Toprak yapısı, doku, nem, elektrik iletkenliği veya diğer istenen toprak parametreleri hakkında bilgi elde etmek için analiz için toprak numunesinin bir kısmını al.
. Toprak Örneklerinin 2 Nematod İzolasyon: Böcek-kızdırma Tekniği
- Herhangi bir enkaz kaldırmak (yani., Kayalar, vb ahşap veya ağaç kabuğu, yaprak, parçaları.) Saprobik mikroorganizma ile kirlenmesini önlemek için örnekleri ile toplanır.
- Toprak nemlendirmek ve nematod hareketini kolaylaştırmak için su ilave edilir.
Not: yavaşça toprağın nem seviyesini artırmak için bir sprey şişesi kullanın. - Bir kapak ile temiz bir plastik kap içinde nemli toprağın yaklaşık 200-250 ml yerleştirin.
- Böcek yemler Ekle. Her bir numunenin toprak yüzeyine (Şekil 5) 5-10 böcekler düşünün.
- Bir kapakla örtün ve kabı ters kapları çevirin.
- (- 25 ° C, genellikle 22), karanlıkta ve oda sıcaklığında muhafaza kapları.
- 3 gün ve ölü böcekler çıkarın - her 2 kapları atın.
NOT: toprak numunesinin daha fazla kızdırma için her kaba ilave sağlıklı böcekleri ekleyin. - Kaplardan ölü böcekler çıkarın. NOT: Koyu mor kadavra kırmızı tuğla heterorhabditids tarafından parazitlenmiş oysa bir kahverengi ya da koyu sarı renk ile Cadavers genellikle steinernematids tarafından asalaklanmış edilir.
- Steril su içinde kadavra durulayın.
- (Aşağıdaki prosedüre bakınız) nematod döl yeniden elde edilmesi için bir modifiye edilmiş beyaz kapanında kadavra yerleştirin.
. Enfekte Disseksiyon 3 Nematod Kurtarma: Modifiye Beyaz Trap
- 50 (veya 60) mm çap üst yerleştirin. Daha büyük bir tabak (100 mm) iç petri.
- Bir günah Setküçük bir tabak içinde gle dairesel filtre kağıdı (Whatman # 1).
- Emin kadavra yapma küçük çanak filtre kağıdının üzerine yerleştirin kadavra herhangi bir bulaşmayı önlemek için birbirlerine dokunmayın.
- Ca ile dış (daha büyük) Petri çanağı doldurun. Steril damıtılmış su, 20 ml. Kadavra tutan çanak su katmayın.
- Büyük Petri kabı ve kapağı ile içeriği (Şekil 6) kapsamaktadır.
- Buna göre yemekler etiketleyin. Nematod adı (tür / izole), enfeksiyon tarih (tarih enfeksiyon kuruldu) ve tuzak tarih (bu tuzak kurmak tarihidir): Aşağıdaki bilgileri ekleyin.
- Enfektif genç safhalardan (IJs) ortaya çıkışı oluşana kadar oda sıcaklığında tuzak tutun. Nematod türlerinin ve / veya kabul gerginlik bağlı olarak 25 gün - Bu işlem 10 arasında sürebilir.
- Tuzak büyük çanak kaldırılması ve bir behere nematod ile su dökerek IJs ile hasat su.
- Nematodlar b dibine süzün izin verEaker. Bu işlem birkaç dakika sürebilir.
- Emin nematodlar beher dibinde kalacak yapma, dikkatli bir şekilde su dökün.
- Daha fazla su ilave edilir ve nematod boşaltmak için izin vererek nematodları durulayın. Su temiz olana kadar 3 kez - Bu adım 2 tekrar edilebilir.
- Bir doku kültür şişesine (250 mi) içinde süspansiyon nematod yerleştirin. 3000 nematod / ml - süspansiyonun konsantrasyonu 1.000 tutun.
- C. ° 20 - soğuk bir odada veya inkübatör nematod süspansiyon ile mağaza şişesi 10 arasında
NOT: EPN raf ömrü değişkendir periyodik olarak saklanan şişeler kontrol edin. Heterorhabditids daha periyodik olarak check-up gerektirebilir oysa, alt kültür gerek olmadan 12 ay - Ortalama steinernematids 6 saklanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Toprak Örnek Toplama
EPN Üçüncü aşama enfektif gençler toprakta (Şekil 1) ikamet bu Nematodlar 'yaşam döngüsü içinde sadece özgür yaşam evreleri vardır. Bu nedenle toprak örnekleri toplayarak bu nematod kurtarmak için çok etkili bir yöntemdir. 4 örnek alınması gereken hangi derinliğini gösteren bir toprak profili göstermektedir. Bir numunenin nem korunması nematodların hayatta kalmak için önemli bir faktördür. Dolayısıyla, plastik torbalarda toprak örnekleri tutmak ve laboratuvara geçiş (Şekil 4) sırasında serin sıcaklıklarda onları korumak için önemlidir.
Nematod Kurtarma
Bir salgın ve EPN istilası ile böceklerin büyük bir örnek bulundu olmadıkça doğada, doğal EPN tarafından parazitlenmiş böcekler bulma şansı az% 3 bulunmaktadır. Bu nedenle böcekler ile toprak örneklerinin kızdırma uygun bir yak olduğunukendi doğal yaşam EPN kurtarma geliştirmek için oach. Şekil 5. toprak canını sıkma tekniği gösteriyor. Bu durumda, bir vida, bir üst 250 ml plastik kap kullanıldı. 10 G. - toprağın yaklaşık 250 g kap ve 5 yerleştirildi mellonella larvaları toprak yüzeyine (sağ Şekil 5) üzerine ilave edildi. 5 gün sonra, konteyner EPN enfeksiyon belirtileri ile ölü böcekler almak için açıldı. Kırmızı renk ile iplik kurdu ile enfekte edilmiş larvaları (Şekil sol 5) dikkat edin.
Şekil 6A, modifiye edilmiş beyaz tuzak şematik bir temsilini göstermektedir. Şekil 6B, tuzak kurulum gösterir. EPN enfekte kadavra küçük petri birbirlerine ve filtre kağıdı dokunmayın fark kuru kalır. Şekil 6C IJs kadavra çıkan gösterir. Onlar hareket olarak Petri kabı üzerinde oluşturulmuş olan nematod 'yollar' (IJs) Notsu manuel olur. Kadavralarından IJ çıkması için zaman nematod türleri ve beyaz tuzak muhafaza edildiği sıcaklık ve nem de bağlı bağlı olarak değişkendir. Şekil 6D IJs Bu tuzağın büyük çanak su içinde zaten göstermektedir. Su nematod temiz ve böcek dokularındaki serbest bakmak gözlemleyin.
Entomopatojen nematodların Şekil 1.. Yaşam döngüsü.
Şekil 2. Kürekler ve toprak örnekleri toplamak için kullanılan diğer cihazlar. (A) Klasik nokta-kürek. (B) el küreği. Soldan sağa (C) Gönderen: Viehmeyer tüp, mala, Oakfield tüpler, toprak corers.
Şekil 3.. Toprak örnekleme stratejileri. (A) Tabakalı. (B) Rastgele.
Soldaki toprak örnekleme stratejisi. Image Şekil 4.. Şematik temsili numuneler alınmalıdır hangi istenen derinliği gösteren bir toprak profili gösterir. Sağ görüntü uygun etiketleme ile bir plastik torba içinde bir toprak örneği göstermektedir.
3/52083fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Sağdaki böcek larvaları. Image ile toprak örneklerinin Şekil 5. Sama, sağlıklı larvaları gösterir ise soldaki görüntü 5 günlük bir mola süre sonra ölü larva gösterir.
Şekil 6.. Şematik gösterimi (A) ve modifiye Beyaz tuzak fotoğrafları (BD). (D) yakın çekim suya Kadavradan IJs kitlesel çıkışını gösteren, (C) yakın IJ çıkışını gösteren enfekte kadavradan kadar, (B) Tuzak kurmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu gösteri genellikle EPN ve simbiyotik bakteri eğitim için kullanılan tekniklerin bir dizi tanımlamak iki sunumlar ilk. Bu teknikler laboratuvarda EPN kültürlerin başarılı kurulması için önemli adımlar temsil ve aynı zamanda araştırma için bir model organizma EPN kullanır diğer biyoanalizlere için temelini oluşturur.
EPN Çeşitli zemin etütleri onların bolluk ve dağıtım mevsim, habitatlar ve coğrafi bölgelere 4, 5,9,15 arasında farklılık olduğunu göstermiştir. Gibi toprak yapısı, nem içeriği, sıcaklık ve hem de konak durumu gibi faktörler dağılımı önemli bir rol oynayabilir. Bu nedenle, kritik anket ön veriler. Numuneler alınır sonra, onlar kısa sürede işlenir önemlidir. Bu bir olasılık değildir, ancak, bu soğuk bir oda ya da başka uygun bir ısı kontrollü biriminde muhafaza edilmelidir. Farklı sıcaklıklarda olabilir,Numunelerin kaynağına bağlı olarak böcek kızdırma depolanması için kapları olarak. Düşünülen genellikle, soğutucu sıcaklıkları (örn.., 15 ° C), tropik bölgelerden ılıman numuneler ve örnekler için kabul edilir, hava sıcaklıkları (örn.., 30 ° C).
Böcek canını sıkma tekniği toprak örneklerinden EPN kurtarma için en sık kullanılan yöntemdir. Bu laboratuarda EPN alınmasını sağlayan uygun bir stratejidir. Büyük bal mumu güvesi Son dönem larva, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae), genellikle kabul edilir; Ancak, diğer böcek barındıran (yani, cırcır, mealworms, böcek larvaları, vb) ve / veya uygun aşamaları olarak kabul edilebilir ve kullanılması tavsiye edilir. Birkaç çalışma, Galleria yemli yöntemin tek bir döngü ekstre belirli bir numunede EPN varlığını belirlemek için ya da toprak örneğinden EPN tüm ayıklamak için çoğu zaman yetersiz olduğunu göstermiştir15 s. 12,15% 40 - Genellikle, iyileşme oranları 20 arasında değişmektedir.
Laboratuvarda toprak örneklerinin kızdırma için alternatif bir yerinde yem arasında bir husustur. Bu örnekleme sitede böcek yemler yerleştirilmesidir. Bu durumda, böcekler (genellikle, bir metal ya da plastik ağdan yapılmıştır) kafeslere yerleştirilir ve belirli bir zaman süresi için, çalışma alanında çizgili sitelerinde bırakılır. Böcekler ile kafesler daha sonra alınan ve EPN enfeksiyonu için incelenir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, yoğun emek gerektirir ve zaman 15 alıcıdır.
Nematod bindirme tekniği başlangıçta Beyaz 10 tarafından tasarlanmış ve daha sonra Kaya ve Stock 6 tarafından modifiye edildi. Tekniği, su (yani, pozitif hygrotropism) için nematod cazibe kullanır ve başarılı böcek doku ve / veya enkaz serbest EPN enfektif aşamalarını kurtarır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu protokollerin birçok iyileştirme katkıları için Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta ve Victoria Miranda-Thompson: Yazarlar Stock laboratuar geçmiş üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz Ulusal Bilim Vakfı desteği kabul SP Stoku (hibe IOS-0840932 ve IOS-0724978).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
- Bedding, R. A., Akhurst, R. J. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21, 109-110 (1975).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, N.Y. 473-488 (2007).
- Gaugler, R. Entomopathogenic Nematology. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2002).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. (1990).
- Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Lacey, L. A. Manual of techniques in invertebrate pathology. , Academic Press. London. (2012).
- McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae). Biological Control. 19, 182-190 (2000).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).
- Poinar, G. O. Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , CRC Press. Boca Raton. 23-61 (1990).
- Stock, S. P., Gress, J. C. Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona. Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).
- Stock, S. P., Hunt, D. J. Nematode morphology and systematics. Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. , CAB International Publishing. Wallingford, UK. 3-43 (2005).
- Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
- Stuart, R. J., Gaugler, R.
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
