Summary
Les nématodes entomopathogènes sont des vers ronds terricoles qui parasitent une grande variété d'insectes. Nous démontrons méthodes d'échantillonnage utilisées pour l'isolement de ces nématodes dans le sol au moyen de deux techniques: l'appâtage des insectes et le piège blanc modifié, pour la récupération des nématodes à partir d'échantillons de sol et de cadavres d'insectes infectés, respectivement.
Abstract
Les nématodes entomopathogènes (aka EPN) représentent un groupe de nématodes terricoles qui parasitent une grande variété d'insectes. Ces nématodes appartiennent à deux familles: Steinernematidae et Heterorhabditidae. Jusqu'à présent, plus de 70 espèces ont été décrites dans le Steinernematidae et il ya environ 20 espèces dans le Heterorhabditidae. Les nématodes ont un partenariat mutualiste avec des bactéries Enterobacteriaceae et ensemble, ils agissent comme un puissant complexe insecticide qui tue un grand nombre d'espèces d'insectes.
Ici, nous nous concentrons sur les techniques les plus courantes en considération pour la collecte de l'EPN du sol. La deuxième partie de cette présentation se concentre sur la technique de l'insecte-appâts, une approche largement utilisée pour l'isolement de l'EPN à partir d'échantillons de sol, et la technique de piège Blanc modifié qui est utilisé pour la récupération de ces nématodes des insectes infectés. Ces méthodes et ces techniques sont les principales étapes pour la mise en place réussie de l'EPN culteres dans le laboratoire et également former la base pour d'autres essais biologiques qui considèrent que ces nématodes comme organismes modèles pour la recherche dans d'autres disciplines biologiques. Les techniques présentées dans cette présentation correspondent à ceux exécutés et / ou conçu par les membres du SP Stock laboratoire ainsi que ceux décrits par différents auteurs.
Introduction
Beaucoup de nématodes sont associés avec des insectes, et leurs interactions hôte vont de bénéfique à préjudiciable. Ici, nous nous concentrons sur un groupe de nématodes qui sont des agents pathogènes d'insectes, aussi connu comme nématodes entomopathogènes (ou EPN). Deux familles de nématodes appartiennent à ce groupe de nematodes: Steinernematidae et Heterorhabditidae 11,13. Leur effet pathogène est en effet conféré par leur interaction avec les bactéries entériques facultatives anaérobies (bactéries Xenorhabdus associent steinernematids et bactéries Photorhabdus associer à heterorhabditids) 2. Les bactéries sont vectorisés d'un insecte hôte à un autre par la seule étape sans nématodes vivant, le mineur infectieux de la troisième étape (également connu sous le nom dauer juvénile, juvénile infectieux ou IJ), qui vit dans le sol. Une fois à l'intérieur de l'insecte, les nématodes libèrent les bactéries dans l'hémolymphe de l'insecte, qui tuent l'hôte de l'insecte par septicémie massif. Les bactéries aussidégrader les tissus de l'insecte et deviennent la source de nourriture des nématodes, ce qui leur permet de mûrir et de se multiplier. Habituellement, une ou deux générations de nématodes adultes sont produits dans le cadavre d'insecte. La descendance des dernières réassocie génération adulte avec quelques cellules bactériennes dans un plus spécialiser de manière que leur relation nutritionnel précédente, et de nourrir ces cellules dans leurs intestins comme ils se déplacent hors de la carcasse de l'insecte dans le sol où ils attendront un autre insecte à parasiter 6,11,14 (Figure 1).
Depuis leur découverte en 1927, l'EPN ont été considérés comme des alternatives valables aux pesticides chimiques, car ils peuvent parasiter un large éventail d'insectes qui sont nuisibles agricoles 3,4,5. Cependant, au cours des deux dernières décennies, ces nématodes et leurs bactéries symbiotiques ont été reconnus comme un système modèle pour l'étude malléable aspects biologiques, écologiques et évolutifs de l'hôte microbe INTERACTIONns 14.
Le but de cette présentation est de montrer les méthodes et les techniques les plus couramment utilisées pour l'échantillonnage et l'isolement de l'EPN sol. Une variété d'outils est disponible et peut être utilisé pour prélever des échantillons de sol, y compris: carottiers du sol, truelles, pelles post-trous, tarières, des tubes d'échantillonnage, pelles à la main, entre autres (figure 2).
Selon le but de l'étude, deux stratégies d'échantillonnage peuvent être envisagées: a) stratifié, b) un échantillonnage aléatoire (Figure 3). L'échantillonnage stratifié est habituellement utilisé dans le cadre d'une étude intensive dans une zone déterminée ou démarquée sur une période de temps donnée. En général, un transect est démarquée et des échantillons de sol sont prélevés à des intervalles prévus dans le transect sur une période de temps (figure 3A) 15. L'échantillonnage aléatoire est généralement utilisé lorsqu'on se concentre sur une vaste zone. Cette stratégie d'échantillonnage a été utilisée pour étudier la diversité des EPN felon une grande surface ou d'une région géographique (figure 3B) 12. Un certain nombre de facteurs peut être considéré en fonction de l'objet de l'étude, y compris un large éventail de hauteurs, textures de sol et des habitats (p. ex., Les champs cultivés, les forêts, les pâturages, parcs, bords de mer, les zones riveraines, etc.)
Nous montrons la technique de l'insecte-appâts, qui a été initialement décrit par Literie et Akhurst 1 et représente une alternative simple et sélective pour la récupération de l'EPN à partir d'échantillons de sol. Il s'agit d'une procédure sélective qui est basée sur la prémisse que les nématodes (stade IJ) seront attirés par un insecte hôte et parasitent il. Cette technique peut également être envisagée pour l'isolement d'autres agents pathogènes tels que les insectes, les champignons et les bactéries 8,10.
Nous démontrons également la technique de piège blanc modifié qui est utilisé pour récupérer la descendance des nématodes chez des hôtes d'insecte infectées 7,14. Il s'agit d'un effort rencontréhod qui offre l'avantage de récupérer un «propre» nématode progéniture libre de débris des cadavres d'insectes dégradantes.
Enfin, les techniques décrites et présentées dans cet article correspondent à ceux conçus et / ou réalisés dans notre laboratoire ainsi que ceux décrits par divers collègues et collaborateurs.
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Protocol
1. Sol de prélèvement des échantillons
- Considérez couvrant une superficie minimale de 2 - 4 m 2 pour chaque site d'échantillonnage.
- Prélever des échantillons de sol à une profondeur d'au moins 15 cm (Figure 4).
- Prenez au moins 5 échantillons aléatoires dans ce domaine.
- Prendre 3 sous-échantillons par échantillon. Selon l'objectif de l'étude, soit combiner les sous-échantillons ou les garder séparés.
- Placer chaque échantillon dans un sac en plastique. Considérez double ensachage pour éviter les fuites d'échantillons (Figure 4).
- échantillons d'étiquettes avec un marqueur à encre indélébile. Inclure les informations suivantes pour chaque site d'échantillonnage: l'information du site (y compris localité / région / nom et coordonnées GPS site d'information), la date, l'habitat, la végétation associée, la température, l'altitude, etc
REMARQUE: Le cas échéant, recueillir et / ou d'enregistrer la présence d'insectes ou autres invertébrés récoltés à l'échantillon pour identification ultérieure. Ils peuvent représenter natur potentielhôtes al EPN. - Outils de collecte propres entre les échantillons par lavage à l'eau et / ou les désinfecter avec 70% d'éthanol ou d'eau de Javel à 0,5%.
- Conserver les échantillons dans un refroidisseur (8-15 ° C) pendant le transport vers le laboratoire.
- Prendre une partie de l'échantillon de sol pour analyse afin d'obtenir des informations sur la composition du sol, la texture, l'humidité, la conductivité électrique ou d'autres paramètres relatifs au sol souhaitées.
. 2 nématode Isolement à partir des échantillons de sol: Technique de l'insecte-appâts
- Enlevez tous les débris (c'est à dire., Roches, des morceaux de bois ou d'écorce, feuilles, etc.) Recueillies avec vos échantillons pour éviter la contamination par des micro-organismes saprophytes.
- Ajouter de l'eau pour humidifier le sol et faciliter la circulation des nématodes.
REMARQUE: Utilisez un vaporisateur d'augmenter lentement le niveau du sol de l'humidité. - Placer environ 200 à 250 ml d'un sol humide dans un récipient en plastique propre avec un couvercle.
- Ajouter appâts insectes. Considérons 5 à 10 insectes à la surface du sol de chaque échantillon (figure 5).
- Couvrir le récipient avec un couvercle et tournez récipients à l'envers.
- Maintenir les récipients dans l'obscurité et à température ambiante (généralement 22-25 ° C).
- Vérifiez tous les récipients 2 - 3 jours et enlever les insectes morts.
REMARQUE: ajouter insectes sains supplémentaires pour chaque conteneur pour plus d'appâtage de l'échantillon de sol. - Retirer les insectes morts des conteneurs. NOTE: Les cadavres avec une brune ou ocre coloration sont généralement parasités par steinernematids, alors que la brique rouge à violet foncé cadavres sont parasités par heterorhabditids.
- Rincer cadavres dans l'eau stérile.
- Placez cadavres dans un piège blanc modifié pour la récupération des nématodes progéniture (voir la procédure ci-dessous).
Piège Blanc modification:. 3 nématode récupération de cadavres infectés
- Placez le haut de 50 (ou 60) mm de diamètre. Boîte de Petri dans un plat plus grand (100 mm).
- Définir un péchépapier filtre circulaire GLE (Whatman n ° 1) à l'intérieur du petit plat.
- La place des cadavres sur le papier filtre du plus petit plat s'assurer que les cadavres ne se touchent pas les uns des autres pour éviter toute contamination.
- Remplissez le extérieure (plus grande) boîte de Pétri avec ca. 20 ml d'eau distillée stérile. Ne pas ajouter de l'eau dans le plat qui contient les cadavres.
- Couvrir la grande boîte de Pétri et son contenu avec le couvercle (Figure 6).
- Étiqueter plats en conséquence. Ajoutez les informations suivantes: nom nématodes (espèces / isolé), la date de l'infection (infection de date a été fixée) et la date de piège (il s'agit de la date à laquelle le piège est mis en place).
- Gardez piège à température ambiante jusqu'à la levée des stades juvéniles infectieux (JI) se produit. Ce processus peut prendre entre 10 - 25 jours selon les espèces et / ou souche considérée nématodes.
- l'eau de récolte avec JI en enlevant le plus grand plat du piège et verser de l'eau par des nématodes dans un bécher.
- Permettre aux nématodes à décanter au fond de la beaker. Ce processus peut prendre quelques minutes.
- Versez de l'eau avec précaution, en s'assurant que les nématodes restent dans le fond du récipient.
- Rincer les nématodes en ajoutant plus d'eau et permettant nématodes à décanter. Cette étape peut être répétée 2 à 3 fois jusqu'à ce que l'eau est propre.
- Placer nématodes en suspension dans un flacon de culture tissulaire (250 ml). Maintenir la concentration de la suspension à 1000 - 3000 nématodes / ml.
- fiole de magasin avec des nématodes en suspension dans une chambre froide ou dans l'incubateur entre: 10 - 20 ° C.
REMARQUE: consultez flacons stockés périodiquement la durée de vie de l'EPN est variable. Habituellement steinernematids peuvent être stockés pour les 6 - 12 mois sans la nécessité de repiquage, alors que heterorhabditids peuvent nécessiter plus de contrôles périodiques.
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Representative Results
Sol de prélèvement des échantillons
Troisième stade juvéniles infectieux de l'EPN sont les seules étapes de vie libre dans le cycle de vie de ces nématodes qui se trouvent dans le sol (figure 1). Par conséquent, la collecte des échantillons de sol est une méthode très efficace pour récupérer de ces nématodes. Figure 4 montre un profil de sol indiquant la profondeur à laquelle les échantillons doivent être prises. La préservation de l'humidité d'un échantillon est un facteur clé pour la survie des nématodes. Par conséquent, il est important de maintenir des échantillons de sol dans des sacs en plastique et de les maintenir à des températures fraîches pendant le transport vers le laboratoire (figure 4).
Nématode récupération
Dans la nature, les chances de trouver des insectes naturellement parasités par EPN sont moins de 3%, à moins d'une épidémie et un plus grand échantillon d'insectes avec EPN infestation est trouvé. Par conséquent, le harcèlement d'échantillons de sol avec des insectes est une pratique approche à améliorer la récupération de l'EPN de leur habitat naturel. Figure 5 représente la technique d'appâtage des sols. Dans ce cas, un récipient en plastique de 250 ml avec un bouchon à visser a été utilisé. Environ 250 g de sol sont placés dans le récipient et de 5 à 10 G. larves de mellonella ont été ajoutés sur la surface du sol (figure 5 à droite). Après 5 jours, le récipient a été ouvert pour récupérer les insectes morts avec des signes d'infection EPN. Notez les larves de nématodes infectés avec une coloration rouge (Figure 5 gauche).
La figure 6A montre une représentation schématique du piège blanc modifié. Figure 6B illustre la mise en place de la trappe. Notez que des cadavres infectés EPN ne se touchent pas les uns les autres et que le papier filtre dans la petite boîte de Petri reste sec. Figure 6C montre les JI émergeant de cadavres. Notez les «sentiers» de nématodes (JI) qui sont formées sur la boîte de Pétri qui se déplacent àpupilles de l'eau. Le temps d'apparition des cadavres IJ est variable selon les espèces de nématodes et dépend également de la température et de l'humidité à laquelle le piège est maintenue blanche. Figure 6D montre les JI déjà dans l'eau du plus grand plat de ce piège. Observez que les nématodes dans l'eau un aspect propre et exempt de tissus de l'insecte.
Figure 1. Cycle de vie des nématodes entomopathogènes.
Figure 2. Pelles et autres dispositifs utilisés pour la collecte des échantillons de sol. (A) classique point pelle. (B) pelle à main. (C) De gauche à droite: Viehmeyer le tube, à la truelle, tubes Oakfield, vide de sol.
Figure 3. Stratégies d'échantillonnage de sol. (A) stratifié. (B) aléatoire.
Figure 4. Représentation schématique de la stratégie d'échantillonnage de sol. L'image de gauche montre un profil de sol indiquant la profondeur souhaitée à laquelle les échantillons doivent être prises. Image de droite montre un échantillon de sol dans un sac en plastique avec un étiquetage approprié.
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Figure 5. Confit d'échantillons de sol avec des larves d'insectes. L'image sur la droite montre les larves saines, alors que l'image de gauche montre les larves mortes après une période d'appâtage 5 jours.
Figure 6. Représentation schématique (A) et de photographies (BD) d'un piège Blanc modifié. (B) Piège mis en place; (C) près d'un cadavre infecté montrant IJ émergence; (D) close-up montrant émergence massive de JI de cadavres dans l'eau.
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Discussion
Cette démonstration est le premier des deux présentations qui décrivent un certain nombre de techniques qui sont couramment utilisés pour l'étude de l'EPN et de leurs bactéries symbiotiques. Ces techniques constituent des étapes clés de la mise en place réussie des cultures de l'EPN dans le laboratoire et constituent également la base pour d'autres essais biologiques qui emploient EPN comme organismes modèles pour la recherche.
Diverses études de sol de l'EPN ont montré que leur abondance et la distribution peuvent varier selon les saisons, les habitats et les régions géographiques 4, 5,9,15. Des facteurs tels que la texture du sol, la teneur en humidité et de la température ainsi que la disponibilité de l'hôte peuvent jouer un rôle clé dans leur distribution. Par conséquent, il est essentiel que des données préliminaires sur un sondage. Une fois les échantillons sont prélevés, il est important qu'ils soient traités le plus tôt possible. Toutefois, si cela n'est pas possible, ils doivent être stockés dans une chambre froide ou un autre appareil à commande de température appropriée. Différentes températures peuvent êtrepris en considération pour le stockage des conteneurs d'appâtage des insectes en fonction de l'origine des échantillons. Habituellement, les températures plus fraîches (p. ex., 15 ° C) sont considérées comme des échantillons tempérées et des échantillons des régions tropicales, les températures plus chaudes (p. ex., 30 ° C) sont pour envisagée.
La technique des insectes appâtage est la méthode la plus couramment utilisée pour la récupération de l'EPN à partir d'échantillons de sol. Il s'agit d'une stratégie pratique qui permet la récupération de l'EPN dans le laboratoire. Dernier stade larvaire de la plus grande fausse teigne Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) sont généralement considérés; cependant, d'autres insectes hôtes (c.-à-grillons, vers de farine, des larves de coléoptères, etc) et / ou des stades appropriés peuvent être pris en compte et sont encouragés à utiliser. Quelques études ont montré que le cycle d'extraction unique de la méthode Galleria-appât est souvent insuffisante pour déterminer la présence de l'EPN dans un échantillon particulier ou pour l'extraction de tous les EPN de l'échantillon de sols 15. Habituellement, les taux de récupération varient entre 20 - 40% 12,15.
Une alternative à l'amorçage des échantillons de sol en laboratoire est l'étude des appâts in situ. Il s'agit de la mise en place des appâts insectes dans le site d'échantillonnage. Dans ce cas, les insectes sont placés dans des cages (habituellement faites d'un métal ou d'un treillis en matière plastique) et sont laissées dans les sites démarqués dans la zone étudiée pendant une période de temps donnée. Les cages avec les insectes sont ensuite récupérés et examinés pour l'infection de l'EPN. Cependant, cette approche est de main-d'œuvre et de temps 15.
La technique de piégeage de nématode a été conçu à l'origine par White 10 et plus tard modifié par Kaya et Stock 6. La technique utilise l'attraction des nématodes à l'eau (c'est-à-hygrotropism positif) et récupère correctement stades infectieux de l'EPN libres de tissus d'insectes et / ou des débris.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les anciens membres de la Banque laboratoire: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta et Victoria Miranda-Thompson pour leurs contributions à l'amélioration de plusieurs de ces protocoles. Nous reconnaissons l'appui National Science Foundation (subventions IOS-0840932 et 0724978 IOS) à SP Stock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
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