Summary
곤충 병원성 선충은 곤충의 다양한 기생 토양에 서식하는 회충 있습니다. 각각의 토양 샘플 및 감염된 곤충 사체에서 선충의 복구를 위해 곤충 유혹하고 수정 된 화이트 트랩, 우리는 두 가지 기술을 사용하여 토양 선충의 분리에 사용되는 샘플링 방법을 보여줍니다.
Abstract
곤충 병원성 선충 (일명 EPN)은 곤충의 광범위한 기생 토양 서식하는 선충의기를 나타낸다. Steinernematidae 및 Heterorhabditidae :이 선충이 두 가족에 속한다. 지금까지 70 개 이상의 종은 Steinernematidae에 설명 된 약 20 종은 Heterorhabditidae에 있습니다. 선충은 장내 세균과 공생 협력 관계를 가지고 함께 그들은 곤충 종의 넓은 범위를 죽이는 강력한 살충 복잡한 역할을합니다.
여기서, 우리는 토양에서 EPN를 수집하기 위해 고려하는 가장 일반적인 기술에 초점을 맞 춥니 다. 이 프레젠테이션의 두 번째 부분은 곤충 유혹의 기술, 토양 샘플에서 EPN의 분리를위한 널리 사용되는 방식, 감염 곤충에서이 선충의 복구에 사용되는 수정 된 화이트 트랩 기술에 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 방법과 기술은 EPN 숭배의 성공적인 설립을위한 핵심 단계입니다실험실에서 또한 URES 다른 생물 분야의 연구를위한 모델 생물로이 선충을 고려해 다른 생물 검정을위한 기초를 형성한다. 이 프리젠 테이션에 표시하는 기술은 SP 재고 실험실의 구성원뿐만 아니라 다양한 작가에 의해 설명 된 수행 및 / 또는 설계된에 해당합니다.
Introduction
많은 선충은 곤충과 관련된, 그리고 그들의 호스트 상호 작용으로부터 유리한 해로운 범위된다. 여기서, 우리는 또한 곤충 병원성 선충 (또는 EPN)로 알려진 곤충의 병원체이다 선충의 그룹에 초점을 맞 춥니 다. Steinernematidae 및 Heterorhabditidae 11,13 두 선충 가족이 선충이 그룹에 속한다. 그들의 병원성 효과는 통성 혐기성 장내 세균 (Xenorhabdus 박테리아 heterorhabditids와 연관 steinernematids 및 Photorhabdus 박테리아와 연관) 2과의 상호 작용에 의해 수여 사실이다. 박테리아는 토양에 살고있는 유일한 자유의 생활 선충 단계, (또한 영속 청소년, 감염성 청소년 또는 IJ라고도 함) 세 번째 단계 감염성 청소년에 의해 하나의 곤충 호스트에서 다른 벡터가된다. 일단 곤충 내부 선충 대규모 패혈증에 의한 곤충 호스트를 죽일 수있는 곤충의 체액에 박테리아를 놓습니다. 또한 박테리아곤충의 조직을 저하하고 성숙하고 번성 할 수 있도록, 선충 '음식 소스가됩니다. 보통, 성인 선충의 하나 또는 두 세대는 곤충 사체 내에서 생산됩니다. 몇 박테리아 세포와 마지막으로 성인 세대 다시 연결합니다의 자손보다 이전의 영양 관계보다 방식을 전문으로하고, 그들이 기생하는 다른 곤충을 기다리고 것이다 토양에 곤충의 시체에서 이사로 자신의 창자에있는 세포를 육성 6,11,14 (그림 1).
그들은 농업 해충 3,4,5입니다 곤충의 다양한 기생 수있는 1927 년 자신의 발견 이후, EPN은 화학 농약에 가치있는 대안을 고려하고 있습니다. 그러나, 지난 20 년 동안,이 선충과 공생 박테리아는 호스트 미생물 자원 활용의 생물 생태와 진화의 양상을 연구 전성 모델 시스템으로 인식되고있다NS 14.
이 프레젠테이션의 목표는 방법과 가장 일반적으로 토양 샘플링 및 EPN의 분리를 위해 사용되는 기술을 보여주는 것입니다. 다양한 도구를 사용할 수 있으며 포함하여 토양 샘플을 수집하는 데 사용 할 수 있습니다 토양 corers, 흙손, 포스트 홀 굴착기, 오거, 샘플링 튜브, 손 삽, 다른 사람의 사이에서 (그림 2).
연구의 목적에 따라,이 샘플링 전략이 고려 될 수있다 : a) 성층, b) 무작위 추출 (도 3). 층화 샘플링은 보통 주어진 시간 동안 특정 또는 demarked 영역에서 집중적 인 연구의 일부로서 사용된다. 일반적으로, 횡단는 demarked하고 토양 샘플은 일정 기간 (그림 3A) 15 이상 횡단에 규정 된 간격으로 촬영하고 있습니다. 광범위한 영역에 초점을 때 무작위 표본 추출은 일반적으로 사용된다. 이 샘플링 전략 EPN F의 다양성을 연구를 위해 사용되어왔다광범위한 지역 또는 지역 (그림 3B) 12 롬. 요인의 숫자는 고도, 토양의 질감과 서식지 (예., 경작지, 삼림, 목초지, 공원, 해안 미, 수변 지역 등)의 다양한 범위를 포함하는 연구의 초점에 따라 고려 될 수있다.
우리는 원래 침구 및 Akhurst 1에 의해 설명과 토양 샘플에서 EPN를 복구하는 간단하고 선택적 대안을 나타냅니다 된 곤충을 유혹 기술을 보여줍니다. 이 선충 (IJ 스테이지) 곤충 숙주 유인 해 기생됨을 전제로 선택적 절차이다. 이 기술은 또한 다른 곤충, 균류 등의 병원균, 박테리아 및 8,10의 분리를 위해 고려 될 수있다.
우리는 또한 감염된 곤충 호스트 7,14에서 선충의 자손을 검색하는 데 사용되는 수정 된 화이트 트랩 기술을 보여줍니다. 이 충족 손쉽게입니다분해 곤충 사체 부스러기가 '깨끗한'선충 자손을 검색하는 이점을 제공 HOD.
마지막으로, 설명이 문서에 나와있는 기술은 임신 및 / 또는 우리의 실험실에서뿐만 아니라 여러 동료들과 공동으로 기술 된 실시하는에 해당합니다.
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Protocol
1. 토양 시료 채취
- 각 샘플링 사이트에 4 평방 미터 - 2의 최소 면적을 고려.
- 적어도 15 cm의 깊이 (그림 4)에서 토양 샘플을 수집합니다.
- 이 영역에 적어도 5 무작위 샘플을 채취.
- 샘플 당 3 서브 샘플을 가져 가라. 이 연구의 목적에 따라 서브 샘플을 결합하거나 구분하지 않고 하나.
- 비닐 봉투에 각각의 샘플을 놓습니다. 시료의 누출 (그림 4)을 방지하기 위해 이중 자루에 넣기를 고려합니다.
- 방수 마커 라벨 샘플. 등 (지방 / 지역 / 사이트 이름 및 GPS 좌표 정보를 포함) 사이트의 정보, 날짜, 서식지, 관련 식물, 온도, 고도, 각 샘플링 사이트에서 다음과 같은 정보를 포함
참고 : 해당되는 경우, 곤충 또는 이후의 식별을위한 샘플 수집 다른 무척추 동물의 존재를 수집 및 / 또는 기록한다. 그들은 잠재적 인 타고난를 나타낼 수있다알 EPN 호스트. - 물로 잘 세척 및 / 또는 70 % 에탄올 0.5 % 표백제 솔루션을 소독하여 샘플 사이 청소 수집 도구.
- 실험실로 운송시 - (15 ° C에서 8) 쿨러에 샘플을 보관하십시오.
- 토양 조성, 조직, 습기, 전기 전도성 또는 다른 원하는 토양 매개 변수에 대한 정보를 얻기 위해 분석 토양 샘플의 일부를 가라.
. 토양 샘플에서 2 선충 격리 : 곤충을 유혹 기술
- 이물질을 제거합니다 (예., 바위, 등 나무 나 나무 껍질, 잎, 조각.) saprobic 미생물 오염을 방지하기 위해 샘플 수집.
- 흙을 묻혀 선충의 이동을 용이하게하기 위해 물을 추가합니다.
참고 : 천천히 토양의 수분 레벨을 증가시키기 위해 스프레이 병을 사용합니다. - 뚜껑이있는 깨끗한 플라스틱 용기에 촉촉한 흙의 약 200-250 ㎖를 놓습니다.
- 곤충 미끼 추가. 각 시료의 토양 표면 (그림 5)에 5 ~ 10 곤충을 고려하십시오.
- 뚜껑이있는 용기를 덮고 거꾸로 컨테이너를 켭니다.
- (- 25 ° C에서 보통 22) 어둠과 RT의 컨테이너를 유지합니다.
- 3 일 죽은 벌레를 제거 - 매 2 컨테이너를 확인합니다.
참고 : 토양 샘플의 추가 탄압 각 컨테이너에 추가 건강한 곤충을 추가합니다. - 컨테이너에서 죽은 벌레를 제거합니다. 참고 : 어두운 자주색 시체에 붉은 벽돌이 heterorhabditids에 기생하는 반면 갈색 또는 황토 채색 함께 시신은 일반적으로 steinernematids에 의해 기생됩니다.
- 멸균 물에 시체를 씻어.
- (아래 절차 참조) 선충 자손의 회복을위한 수정 된 화이트 함정에 시체를 놓습니다.
. 감염된 시체에서 3 선충류 복구 : 수정 된 화이트 함정
- 50 (60) mm의 DIAM의 상단을 놓으십시오. 큰 접시 (100mm) 내부 페트리 접시.
- 하나의 죄를 설정작은 그릇 안에 GLE 원형 여과지 (와트 만 # 1).
- 확실히 시체를 만드는 작은 접시의 필터 종이에 장소 사체는 오염을 방지하기 위해 서로 접촉하지 않습니다.
- 캘리포니아와 외부 (큰) 페트리 접시를 채우십시오. 멸균 증류수 20 ㎖. 시체를 보유하고 접시에 물을 추가하지 마십시오.
- 큰 페트리 접시와 뚜껑의 내용 (그림 6)을 포함한다.
- 그에 따라 요리를 레이블. 선충류 이름 (종 / 분리), 감염 날짜 (날짜 감염이 설정된) 및 트랩 날짜 (이것은 트랩이 설정된 날짜입니다) : 다음과 같은 정보를 추가합니다.
- 감염성 청소년 단계 (IJS)의 출현이 발생할 때까지 RT에서 트랩을 유지합니다. 선충 종 및 / 또는 고려 변형에 따라 25 일 -이 과정은 10 사이의 시간이 소요될 수 있습니다.
- 트랩의 큰 접시를 제거하고 비커에 선충 물을 부어 IJS 수확 물.
- 선충은 B의 바닥에 가만히 따르다 할 수 있도록 허용eaker. 이 과정은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 확인 선충이 비커의 바닥에 남아하고, 조심스럽게 물을 부어.
- 더 많은 물을 추가하고 선충은 가만히 따르다 할 수 있도록하여 선충을 씻어. 물이 깨끗해질 때까지 3 회 -이 단계 2를 반복 할 수 있습니다.
- 조직 배양 플라스크 (250 ㎖)에 선충 현탁액을 놓습니다. 3000 선충 / ㎖ - 현탁액의 농도를 1,000 보관하십시오.
- C. ° 20 - 추운 방에서 또는 인큐베이터에있는 선충 서스펜션 스토어 플라스크 (10) 사이
참고 : EPN의 수명은 변수로 주기적으로 저장 플라스크를 확인합니다. heterorhabditids 더 정기적 인 검진을 필요로 할 수있는 반면, 계대 배양의 필요없이 12 개월 - 보통 steinernematids 6 저장할 수 있습니다.
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Representative Results
토양 시료 채취
EPN의 세 번째 단계 감염성 청소년은 토양에 (그림 1) 상주 이러한 선충 '라이프 사이클의 유일한 자유의 생활 단계입니다. 따라서, 토양 시료를 수집하는 것은이 선충 복구하는 매우 효율적인 방법이다. 4 샘플들이 이동해야하는 깊이를 나타내는 토양 프로파일을 보여준다. 샘플의 수분을 보존하는 것은 선충의 생존을위한 핵심 요소입니다. 결과적으로, 비닐 봉투에서 토양 샘플을 유지하고 실험실에 전송 (그림 4) 동안 차가운 온도를 유지하는 것이 중요합니다.
선충 복구
전염병 및 EPN 감염과 곤충의 큰 샘플 발견이없는 한 자연 속에서, 자연 EPN에 의해 기생 곤충을 찾는 기회가, 3 % 미만이다. 따라서, 곤충과 토양 샘플의 유혹 편리 하거든 Appr입니다그들의 자연 서식지에서 EPN의 회복을 향상시킬 수 oach. 그림 5는 토양 유혹의 기술을 보여줍니다. 이때, 상부 덮개와 250 ml의 플라스틱 컨테이너를 사용 하였다. 10 G. - 토양의 약 250 g을 용기에 넣고, 5 mellonella 유충은 토양의 표면 (오른쪽 그림 5)에 추가되었습니다. 후에 5 일, 컨테이너는 EPN 감염의 징후와 죽은 곤충을 검색하기 위해 열렸다. 붉은 채색과 선충에 감염된 유충 (그림 왼쪽 5)를 알 수 있습니다.
도 6a가 변경됨 백색 트랩의 개략적 인 표현을 도시한다.도 6b는 트랩의 셋업을 보여준다. EPN 감염된 시체가 작은 페트리 접시에 각각 그 여과지를 만지지 않도록주의하는 것은 건조한 상태를 유지. 그림 6c는 IJS는 시체에서 신흥 보여줍니다. 그들은으로 이동 페트리 접시에 형성되는 선충의 '흔적'(IJS)를 참고물을 구. 시체에서 IJ의 출현 시간이 선충 종과 화이트 트랩이 유지되는 온도와 습기에 종속 된에 따라 변수입니다. 그림 6D는 IJS이 트랩의 큰 접시의 물에 이미 보여줍니다. 물에 선충이 깨끗하고 곤충 조직 무료 보는 것을 관찰한다.
곤충 병원성 선충의 그림 1. 수명주기.
그림 2. 삽과 토양 샘플을 수집하기 위해 사용되는 다른 장치. (A) 클래식 포인트 삽. (B) 손 삽. 왼쪽에서 오른쪽으로 (C)에서 : Viehmeyer 관, 흙, 위 Oakfield 튜브, 토양 corers.
그림 3. 토양 샘플링 전략. (A) 층화. (B) 임의의.
왼쪽의 토양 표본 추출 방법. 이미지의 그림 4. 도식 표현은 샘플을 촬영해야하는 요구 수준을 나타내는 토양의 프로필을 보여줍니다. 오른쪽의 이미지는 적절한 표시와 함께 비닐 봉투에서 토양 샘플을 보여줍니다.
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오른쪽에있는 곤충의 애벌레. 이미지와 토양 시료의 그림 5. 베이 팅은 건강한 애벌레를 보여줍니다 반면 왼쪽의 이미지는 오일 유혹 기간 이후에 죽은 애벌레를 보여줍니다.
그림 6. 도식 표현 (A)와 수정 된 화이트 트랩의 사진 (BD). (D) 확대 물에 시체에서 IJS의 대규모 출현을 보여주는, (C) 가까운 IJ의 출현을 보여주는 감염된 사체의 최대, (B) 트랩 설정합니다.
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Discussion
이 데모는 일반적으로 EPN과 공생 박테리아를 연구에 사용되는 다양한 기술을 설명하는 프레 젠 테이션의 첫 번째입니다. 이 기술은 실험실에서 EPN 문화의 성공적인 설립을위한 주요 단계를 대표하고 또한 연구를위한 모델 생물로 EPN을 채용 다른 생물 검정을위한 기초를 형성한다.
EPN의 다양한 토양 조사는 자신의 풍요 로움과 유통이 계절, 서식지와 지리적 영역 (4), 5,9,15에 걸쳐 될 수있는 것으로 나타났습니다. 토양 질감, 수분 함량 및 온도뿐만 아니라 호스트 가능 같은 요인, 그 분포에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 따라서 중요한 조사에 예비 자료가. 샘플이 촬영되면, 이들이 가능한 한 빨리 처리하는 것이 중요하다. 이것이 가능하지 않은 경우에는, 이들은 냉장실 또는 다른 적합한 온도 제어 장치에 기억되어야한다. 다른 온도가 될 수있다시료의 기원에 따라 곤충 탄압 용기를 저장하기위한 것으로 간주된다. 고려를 위해 일반적으로 쿨러의 온도 (예를 들면., 15 ° C)는 열대 지방에서 온대 샘플 및 샘플에 대한 고려, 따뜻한 온도 (예를 들면., 30 ° C)가 있습니다.
곤충 탄압 기술은 토양 샘플에서 EPN의 복구를 위해 가장 많이 사용되는 방법이다. 이는 실험실에서 EPN의 검색을 허용하는 편리한 전략이다. 큰 왁스 나방의 최종 령 유충, 갤러리아 mellonella은 (나비목 : Pyralidae) 일반적으로 간주된다; 그러나, 다른 곤충 호스트 (즉, 귀뚜라미, 밀웜, 딱정벌레 애벌레 등) 및 / 또는 적절한 단계가 고려 될 수는 사용하는 것이 좋습니다. 몇몇 연구는 갤러리아 미끼 방법의 하나의 추출 사이클이 특정 샘플에서 EPN의 존재를 결정 또는 토양 샘플에서 EPN 모두 추출 종종 불충분 한 것으로 나타났다15의. 12,15 % 40 - 보통, 회수율은 20 사이에 다릅니다.
실험실에서 토양 시료의 탄압에 대한 대안은 반응계에서 탄압의 고려 사항이다. 이것은 샘플링 위치에서 곤충 미끼의 배치이다. 이 경우, 곤충 (일반적으로 금속 또는 플라스틱으로 만들어진 메쉬) 케이지에 배치되고, 주어진 시간에 대한 연구 영역 demarked 사이트에 남아있다. 곤충 케이지은 다음 검색 및 EPN 감염을 조사하고 있습니다. 그러나,이 방법은 노동 집약적이고 시간 15이 소요됩니다.
선충 트래핑 기술은 원래 화이트 (10)에 의해 디자인 된 이후 가야와 스톡 (6)에 의해 수정되었습니다. 이 기술은 물 (즉, 긍정적 인 hygrotropism)에 선충의 매력을 활용하여 성공적으로 곤충 조직 및 / 또는 찌꺼기 EPN의 감염 단계를 복구합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이러한 여러 프로토콜의 개선에 기여한 샘 규 김, 캐서린 Plichta 빅토리아 미란다 - 톰슨 : 저자는 증권 연구소의 과거 회원을 감사드립니다. 우리는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 지원을 인정 SP 주식에 (보조금 IOS-0840932 및 IOS-0724978).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
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