Summary
昆虫病原线虫是土栖线虫的寄生多种昆虫。我们展示了用于这些线虫使用两种技术的土壤隔离采样方式：昆虫引诱和修改后的白的陷阱，对于线虫的土壤样品和感染的昆虫尸体，分别回收。
Abstract
昆虫病原线虫（又名EPN）代表一组土栖线虫的寄生多种昆虫的。这些线虫属两个家庭：线虫和异。到现在为止，有超过70种已在Steinernematidae描述，并有大约20种的异小。线虫有肠杆菌科细菌互利共生的伙伴关系和他们一起作为一个有效的杀虫复杂，杀灭多种昆虫种类。
在此，我们重点考虑从土壤中采集EPN中的最常用的技术。这个演讲的第二部分着重于昆虫引诱技术，为EPN从土壤样品中分离一种广泛使用的方法，以及用于这些线虫从感染虫的复苏修改白色陷阱技术。这些方法和技术是成功建立EPN邪教的关键步骤在实验室中，也URES形成的基础，即认为这些线虫作为模式生物的研究在其他生物学科等生物测定。在此演示文稿中显示的技术对应于那些由SP联合实验室成员，以及那些由不同的作者进行描述和/或设计。
Introduction
许多线虫与昆虫有关，其宿主相互作用的范围从有利到不利的。在此，我们专注于一组的线虫是昆虫病原体，也被称为昆虫病原线虫（或EPN）。两种线虫的家庭属于这个组线虫：线虫和异11,13。其致病作用实际上是通过它们与兼性厌氧的肠道细菌（ 致病细菌与steinernematids和光杆状菌联想到heterorhabditids关联）2相互作用所赋予的。该细菌通过唯一的自由生活线虫阶段，第三阶段的感染幼年（也称为永久性幼虫少年，感染幼年或IJ），它生活在土壤中的向量从一个昆虫宿主到另一个。一旦昆虫体内，线虫释放细菌进入昆虫的血淋巴，后者通过大规模败血症的昆虫宿主。此外，细菌还降低昆虫的组织，成为线虫的食物来源，使他们走向成熟和繁殖。通常，一个或两个世代成年线虫是昆虫的尸体内产生。最后成年一代重新关联一些细菌细胞中的后代一个更专业的方式比他们以前的营养关系，并培养这些细胞在它们的肠子，因为他们从昆虫尸体搬出到土壤中，他们将等待另一个昆虫寄生6,11,14（ 图1）。
由于他们的发现于1927年，EPN被认为是有价值的替代化学杀虫剂，因为它们可以寄生在多种昆虫是农业害虫3,4,5。然而，在过去的二十年里，这些线虫及其共生菌已被确认为研究宿主 - 微生物interactio的生物学，生态学和进化方面的可塑性模型系统NS 14。
这个演讲的目的是显示的方法和技术最常用的土壤取样和EPN的隔离。各种工具可用，并且可以用于采集土壤样本，包括：土壤取样器，铲子，后孔挖掘机，螺旋钻，取样管，手铲，等等（ 图2）。
取决于研究的目的，两个采样策略可以考虑：1）分层，二）随机抽样（ 图3）。分层抽样通常用作在超过给定的时间周期的特定或区域划出了深入的研究的一部分。在一般情况下，一个样被划出和土壤采样在规定的时间间隔中的样条在一段时间（ 图3A）15。专注于一个广泛的区域时，随机抽样，一般使用。这种取样策略已经用于研究EPN f的多样性ROM中的较大的地理区域或地区（ 图3B）12。许多因素可以根据研究，包括海拔，土壤质地和栖息地（ 例如 。，耕地，森林，草场，公园，海岸，河岸地区等）的多元化的重点加以考虑。
我们展示了昆虫引诱技术，它最初是由床上用品和Akhurst 1描述和表示从土壤样品中恢复EPN一个简单的和有选择性的选择。这是基于这样的前提，该线虫（IJ阶段）将被吸引到昆虫宿主和寄生它选择性步骤。这种技术也可以考虑用于其他昆虫病原体如真菌，细菌和8,10隔离。
我们还证明其用于从受感染的昆虫宿主7,14检索线虫后代改性白阱技术。这是满足一个轻松HOD，提供检索一个'干净'线虫后代免于降解昆虫尸体碎片的优势。
最后，描述和本文中所述的技术对应于那些构思和/或在我们的实验室，以及那些由不同的同事和合作者描述进行。
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Protocol
1，土壤样品采集
- 考虑覆盖的2的最小面积- 4 平方公尺的每个采样点。
- 收集的土壤样品在一个深度至少为15厘米（ 图4）。
- 至少需要5个随机样本在此区域内。
- 取每个样品3子样本。根据研究的目的，无论是结合子样本，或让他们分开。
- 将每个样品在一个塑料袋。考虑双套袋，以避免样品泄漏（ 图4）。
- 标签样本具有防水标志。包括从每个采样点的以下信息：网站信息（包括本地/区域/网站名称和GPS坐标信息），日期，生地，相关的植被，温度，海拔等。
注意：如果适用，收集和/或记录昆虫或与样品用于后续识别收集的其他无脊椎动物的存在。他们可能是潜在的自然色人EPN主机。 - 通过用水充分洗涤和/或用70％乙醇或0.5％的漂白剂溶液消毒他们的样品之间干净的收集工具。
- 运输到实验室中 - （15℃8）保持样品冷却器。
- 对分析的土壤样品的一部分以获得对土壤成分，质地，水分，导电性或其它期望的土壤参数的信息。
2，从土壤样品线虫隔离：昆虫引诱技术
- 取出所有碎片（ 即 。，岩石，木材或树皮，树叶等的作品。）收集与您的样品，以避免污染人工林则与微生物。
- 加水以润湿土壤和促进线虫的运动。
注：使用喷雾瓶，慢慢增加了土壤的湿度水平。 - 将约200至250 mL潮湿的土壤中一个带盖子的干净的塑料容器。
- 添加昆虫诱饵。考虑5至10只昆虫，以每个样品的土壤表面（ 图5）。
- 盖上容器盖，把容器倒置。
- 保持容器在黑暗中，并在室温（通常为22 - 25℃）。
- 检查集装箱每2 - 3天，除去死虫。
注：添加额外的健康昆虫每个容器的土壤样品的进一步引诱。 - 从容器中取出死虫。注：标本组用褐色或赭石色通常由steinernematids寄生，而砖红色至暗紫色的尸体被heterorhabditids寄生。
- 在无菌水冲洗尸体。
- 尸体放置在修改后的白陷阱线虫后代的恢复（参见下面的步骤）。
3，线虫恢复从受感染的标本组：改良白色陷阱
- 放置一个50（或60）毫米直径的顶部。陪替氏培养皿内的一个较大的盘（100毫米）。
- 设置一个罪GLE圆形滤纸（Whatman公司＃1）内的小盘子。
- 对较小的盘子，确保尸体的滤纸地方尸体不互相接触，以避免任何污染。
- 与CA填写外（大）培养皿。将20ml无菌蒸馏水。请勿在保存尸体的菜加水。
- 覆盖大培养皿，其与盖的内容（ 图6）。
- 相应地标注菜肴。添加以下信息：线虫名（种/株），感染日期（日期感染被设置）和陷阱的日期（这是陷阱被设置的日期）。
- 陷阱保持在室温，直到感染幼年阶段（IJS）出现时。这个过程可能10之间取 - 26天视线虫种类和/或应变考虑。
- 通过删除陷阱较大菜和浇水线虫放入烧杯中水的收获与IJS。
- 允许线虫倾析将b的底部伊克。这个过程可能需要几分钟。
- 小心地倒入水中，并确保线虫保留在烧杯的底部。
- 通过加入更多的水，并允许线虫倒出洗净线虫。这个步骤可以重复2 - 3次，直到水是干净的。
- 放置线虫悬浮液在组织培养瓶（250毫升）。保持悬浮浓度为1,000 - 3,000线虫/毫升。
- 商店烧瓶线虫悬浮在冷室或培养箱中在10 - 20°C。
注：定期检查贮存瓶作为EPN的保质期是可变的。通常steinernematids可存放6 - 12个月不传代培养的需要，而heterorhabditids可能需要更多的定期检查。
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Representative Results
土壤样品采集
EPN的第三阶段感染性幼虫是在这些线虫的生活周期（ 图1），其驻留在土壤中的唯一的自由生活阶段。因此，采集的土壤样品，是要收回这些线虫的一种非常有效的方法， 图4示出了表示在该样品应采取深处的土壤剖面。保存的样品的水分对于线虫的存活的关键因素。因此，要保持土壤样品中的塑料袋和过境实验室（ 图4）中维护它们在凉爽的温度是很重要的。
线虫恢复
在自然界中，发现昆虫通过EPN自然寄生的机会都小于3％，除非有发现一种流行病和昆虫与EPN为患更大的样本。因此，土壤样品与昆虫的引诱是一种方便的APPRoach以增强EPN从它们的天然生境中恢复图5描绘了土壤诱饵技术。在这种情况下，用螺丝顶的250毫升塑料容器中使用。约250g土壤被放置在容器中，5 - 10 G。蜡螟幼虫加到土壤的表面（ 图5右）。 5天之后，该容器被打开以检索死昆虫与EPN感染的迹象。请注意线虫幼虫感染用红色着色（ 图5左）。
图6A示出了修改后的白阱的示意图。 图6B显示了设置了陷阱。请注意，EPN感染的尸体不相互接触和滤纸在小培养皿保持干燥。 图6C表示从尸体IJS出现。注意线虫形成在陪替氏培养皿，由于它们移动到'路径'（IJS）病房的水。取决于线虫物种和还依赖于它的白阱保持在温度和湿度的时间从尸体IJ出现是可变的。 图6D示出IJS已经在这个陷阱中较大的盘子的水。观察水中的线虫看起来干净，无虫组织。
昆虫病原线虫的图1。生命周期。
图2。铲，挖掘机及用于收集土壤样本等设备。（一）经典点铲（B）手铲。 （三）从左至右依次为：Viehmeyer管，抹子，OAKFIELD管，土壤取样器。
图3。土壤采样策略（A）分层（B）随机。
土壤采样策略。图片左边的图4。示意图显示表明在该样本应采取所需深度的土壤剖面。右侧的图像显示了在一个塑料袋用适当的标签土壤样品。
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土壤样品与昆虫幼虫。图片右侧的图5。：0084显示健康的幼虫，而在左边的图像显示死亡幼虫5天引诱期后。
图6。示意图（A）和修改后的白陷阱的照片（BD）。 （二）陷阱设置（C）接近受感染的尸体呈现IJ出现，（D）特写显示IJS的大量出现，从尸体入水。
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Discussion
该演示是第一次两个报告描述了若干常用于研究EPN及其共生菌技术。这些技术代表了成功建立EPN文化在实验室的关键步骤，也是形成的基础，雇用EPN作为模式生物用于研究其他生物测定。
EPN的各种土壤调查结果显示，他们的丰度和分布可以跨季节，生境和地理区域4，5,9,15有所不同。因素如土壤质地，水分含量和温度，以及主机的可用性可能在它们的分布起着关键的作用。因此，至关重要的是，在这项统计调查的初步数据。一旦抽取样本，重要的是他们尽快处理。然而，如果这不是一个可能性，它们应该被存储在冷室或其它适当的温度控制单元。不同温度下可以是考虑用于存储昆虫诱饵容器取决于样品的起源。通常情况下，更低的温度（ 例如 ，15℃）被认为是温和的样本和样本的热带地区，温暖的温度（ 例如 ，30℃）对拟。
昆虫诱饵技术是最常用的方法从土壤样品恢复EPN的。这是一个方便的策略，允许EPN的在实验室中进行检索。大蜡螟末龄幼虫， 大蜡螟 （鳞翅目：螟蛾科）通常被认为是;然而，其他的昆虫宿主（ 即蟋蟀，面包虫，甲虫幼虫等 ）和/或适宜的阶段可以考虑，并建议使用。一些研究已经表明， 拱廊诱饵方法的单个循环提取往往不足以用于确定EPN的特定样品中存在或为从土壤样品中提取所有的EPN的S15。 12,15 40％ -通常情况下，回收率20之间变化。
另一种土壤样品在实验室的诱饵是引诱原位的考虑。这是放置在采样点昆虫诱饵。在这种情况下，昆虫被放置在笼中（通常由金属或塑料网），并留在划出站点在研究区为给定的时间周期。与昆虫的笼子，然后检索和检查EPN感染。然而，这种方法是劳动密集且耗时15。
线虫捕捉技术最初是由白10的设计，后来被卡亚和库存6修改。该技术利用线虫的吸引力，以水（ 即，正hygrotropism）以及成功恢复EPN的自由昆虫组织和/或碎屑的感染阶段。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢过去的库存实验室的成员：萨姆 - 圭金，凯瑟琳Plichta和维多利亚米兰达 - 汤普森他们对许多这些协议的改进作出贡献。我们承认美国国家科学基金会的支持（资助IOS-0840932和IOS-0724978），以SP的股票。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
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