Summary
Entomopathogene aaltjes-grondbewonende rondwormen die een brede waaier van insecten parasiteren. We tonen bemonsteringsmethoden voor de isolatie van deze nematoden uit de bodem met behulp van twee technieken: de insecten lokken en de gewijzigde White val, voor het herstel van nematoden uit bodemmonsters en geïnfecteerde insecten kadavers, respectievelijk.
Abstract
Entomopathogene nematoden (aka EPN) vormen een groep van-grondbewonende nematoden die een brede waaier van insecten parasiteren. Deze aaltjes behoren tot twee families: Steinernematidae en Heterorhabditidea. Tot nu toe hebben meer dan 70 soorten beschreven in de Steinernematidae en er zijn ongeveer 20 soorten in de Heterorhabditidea. De nematoden hebben een mutualistische partnership met Enterobacteriaceae bacteriën en samen vormen ze fungeren als een krachtig insecticide complex dat een breed scala aan soorten insecten doodt.
Hierin, richten we ons op de meest gebruikte technieken in aanmerking komen voor het verzamelen van EPN uit de bodem. Het tweede deel van deze presentatie richt zich op de insecten lokken techniek, een veel gebruikte aanpak voor de isolatie van EPN uit bodemmonsters, en de gewijzigde Witte trap techniek die wordt gebruikt voor het terugwinnen van deze nematoden uit besmette insecten. Deze methoden en technieken zijn belangrijke stappen voor de succesvolle oprichting van EPN cultgelen in het laboratorium en ook de basis vormen voor andere bioassays dat deze nematoden beschouwen als modelorganismen voor onderzoek in andere biologische disciplines. De in deze presentatie technieken overeenkomen met de uitgevoerde en / of door de leden van SP De laboratorium als die beschreven door verschillende auteurs.
Introduction
Veel nematoden worden geassocieerd met insecten en hun gastheer interacties variëren van gunstig schadelijk. Hierin, richten we ons op een groep van nematoden die ziekteverwekkers van insecten, ook wel bekend als entomopathogene nematoden (of EPN). Twee nematode families behoren tot deze groep van nematoden: Steinernematidae en Heterorhabditidea 11,13. Hun pathogene effect is in feite door hun interactie met facultatief anaërobe darmbacteriën (Xenorhabdus bacteriën associëren met steinernematids en Photorhabdus bacteriën associëren met heterorhabditids) 2 toegekend. De bacteriën worden gevectoriseerd van de ene host naar de andere insecten door de enige vrij levende aaltjes moment de derde-fase infectieuze juveniele (ook bekend als dauer jeugdcriminaliteit, infectieuze jeugdige of IJ), die leeft in de bodem. Eenmaal binnen het insect, de aaltjes laat de bacteriën in hemolymph het insect, die het insect host door massale bloedvergiftiging doden. De bacteriën ookdegraderen weefsels van het insect en word voedselbron de aaltjes ', waardoor ze om te rijpen en zich te vermenigvuldigen. Meestal een of twee generaties van volwassen nematoden worden geproduceerd binnen het insect kadaver. Het nageslacht van de laatste generatie volwassen reassociates met enkele bacteriële cellen in een meer gespecialiseerd wijze dan hun vorige voeding relatie, en voeden deze cellen in de darmen zoals zij uit te gaan van de insecten karkas in de grond waar andere insecten zullen wachten tot parasiteren 6,11,14 (figuur 1).
Sinds hun ontdekking in 1927, hebben EPN beschouwd als waardevolle alternatieven voor chemische bestrijdingsmiddelen als ze een breed scala aan insecten die landbouwongedierte 3,4,5 zijn kunnen parasiteren. Echter, in de afgelopen twee decennia, deze nematoden en hun symbiotische bacteriën zijn erkend als een kneedbare modelsysteem voor het bestuderen van biologische, ecologische en evolutionaire aspecten van gastheer-microbe Interactio14 ns.
Het doel van deze presentatie is om de methoden en technieken het meest gebruikt voor de bemonstering en de isolatie van EPN bodem vertonen. Een verscheidenheid aan instrumenten is beschikbaar en kan worden gebruikt voor het verzamelen van bodemmonsters inclusief: bodem corers, troffels, post-gatengravers, grondboren, bemonstering buizen, met de hand schoffelen, onder anderen (figuur 2).
Afhankelijk van het doel van het onderzoek kunnen twee monsters strategieën beschouwd: a) gestratificeerd, b) steekproefsgewijze (figuur 3). De gestratificeerde steekproef wordt meestal gebruikt als onderdeel van een intensieve studie in een specifieke of demarked gebied gedurende een bepaalde periode. In het algemeen wordt een transect demarked en bodemmonsters genomen vastgelegd intervallen in het transect gedurende een tijdsperiode (figuur 3A) 15. De aselecte steekproef wordt in het algemeen toegepast bij het scherpstellen op een uitgestrekt gebied. Deze bemonstering strategie werd gebruikt voor het bestuderen van de diversiteit van EPN from een groot geografisch gebied of regio (Figuur 3B) 12. Een aantal factoren kunnen worden beschouwd, afhankelijk van de focus van de studie, waaronder een diverse waaier van verhogingen, bodemtexturen en habitats (bv., Akkers, bossen, weilanden, parken, zeekusten, oeverstaten gebieden, etc.).
We tonen de insecten lokken techniek, die oorspronkelijk werd beschreven door Bedding en Akhurst 1 en staat voor een eenvoudige en selectieve alternatief voor het herstellen van EPN van bodemmonsters. Dit is een selectief procedure die is gebaseerd op de vooronderstelling dat de nematoden (IJ fase) wordt aangetrokken door een insect gastheer en het parasiteren. Deze techniek kan ook worden beschouwd voor isolatie van andere insecten pathogenen zoals schimmels, bacteriën en 8,10.
We tonen ook gemodificeerde Witte trap techniek die wordt gebruikt voor het ophalen nematode nakomelingen van geïnfecteerde insect gastheren 7,14. Dit is een moeiteloze voldaanhod dat het voordeel van het ophalen van een 'schone' nematode nakomelingen vrij van vuil uit de vernederende insect kadavers biedt.
Tenslotte, de beschreven en in dit artikel technieken overeen met die bedacht en / of uitgevoerd en in ons laboratorium die beschreven door verschillende collega's en medewerkers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Soil Sample Collection
- Overwegen met betrekking tot een minimale oppervlakte van 2-4 m 2 voor elk bemonsterd.
- Verzamel bodemmonsters op een diepte van ten minste 15 cm (figuur 4).
- Neem ten minste 5 steekproeven binnen dit gebied.
- Neem 3 submonsters per monster. Afhankelijk van het doel van de studie, ofwel combineren deelmonster of houd ze apart.
- Plaats elk monster in een plastic zak. Overweeg dubbel-zakken om het lekken van monsters (figuur 4) te vermijden.
- Label monsters met een watervaste stift. De volgende gegevens bevatten uit elke bemonstering site: Site informatie (inclusief plaats / regio / naam van de site en GPS coördinaat informatie), datum, habitat, bijbehorende vegetatie, temperatuur, hoogte, etc.
OPMERKING: Indien van toepassing, te verzamelen en / of opnemen van de aanwezigheid van insecten of andere ongewervelden verzameld met het monster voor latere identificatie. Zij kunnen potentiële natuur vertegenwoordigenal. EPN gastheren. - Clean verzamelen gereedschap tussen de monsters door het grondig wassen met water en / of desinfecteren met 70% ethanol of 0,5% bleekwater oplossing.
- Houd monsters in een koeler (8 - 15 ° C) tijdens het vervoer naar het laboratorium.
- Neem een deel van het grondmonster voor analyse naar informatie over bodemsamenstelling textuur, vochtigheid, geleidingsvermogen of andere gewenste bodemparameters verkrijgen.
. 2 Nematoden Isolatie van bodemmonsters: Insect-uitspanning Techniek
- Verwijder alle vuil (dwz., Rotsen, stukken hout of schors, bladeren, enz.) Verzamelde met uw monsters om besmetting met saprobische micro-organismen te voorkomen.
- Voeg water om de grond te bevochtigen en de beweging van nematoden vergemakkelijken.
OPMERKING: Gebruik een spray fles langzaam te verhogen het vochtgehalte van de bodem. - Plaats ongeveer 200 tot 250 ml vochtige grond in een schone plastic container met een deksel.
- Voeg insect aas. Overweeg 5 tot 10 insecten aan het bodemoppervlak van elk monster (Figuur 5).
- Bedek de container met een deksel en zet containers ondersteboven.
- Handhaaf containers in het donker bij kamertemperatuur (meestal 22-25 ° C).
- Controleer containers elke 2-3 dagen en het verwijderen van dode insecten.
OPMERKING: voeg extra gezonde insecten elke container voor verdere ophitsing van het bodemmonster. - Verwijder dode insecten uit de containers. OPMERKING: Kadavers met een bruine of okerkleurige kleur worden meestal geparasiteerd door steinernematids, terwijl steenrood tot donker paars kadavers worden geparasiteerd door heterorhabditids.
- Spoel kadavers in steriel water.
- Plaats kadavers in een gewijzigde Wit val voor herstel van de nematode nageslacht (zie onderstaande procedure).
. 3 Nematoden Herstel van Infected Cadavers: Gewijzigde Wit Trap
- Plaats de bovenkant van een 50 (of 60) mm diam. Petrischaal in een grotere schaal (100 mm).
- Stel een zondegle cirkelvormige filtreerpapier (Whatman nr. 1) in de kleinere schaal.
- Plaats kadavers op het filterpapier van de kleinere schaal en zorg ervoor kadavers elkaar niet aanraken om verontreiniging te voorkomen.
- Vul het buitenste (grotere) petrischaal met ca. 20 ml steriel gedistilleerd water. Geen water toe te voegen in het gerecht dat de kadavers houdt.
- Bedek de grote petrischaal en de inhoud van het deksel (figuur 6).
- Label gerechten dienovereenkomstig. Voeg de volgende informatie: naam Nematoden (soorten / isolaat), infectie (datum besmetting werd vastgesteld) en val datum (dit is de datum van de val is ingesteld).
- Houd val bij KT tot ontstaan van infectieuze juveniele stadia (IJs) optreedt. Dit proces kan tussen de 10 nemen - 25 dagen, afhankelijk van de nematode soort en / of stam beschouwd.
- Oogst water met IJs door het verwijderen van de grotere schaal van de val en het gieten van water met nematoden in een bekerglas.
- Laat nematoden bezinken naar de bodem van de bEaker. Dit proces kan enkele minuten duren.
- Giet water voorzichtig, waarbij u nematoden blijven in de bodem van het bekerglas.
- Spoel nematoden door het toevoegen van meer water en het toestaan van nematoden te decanteren. Deze stap kan worden herhaald 2-3 keer totdat het water schoon is.
- Plaats nematode suspensie in een weefselkweek kolf (250 ml). Houd concentratie van de suspensie tot 1000 - 3000 nematoden / ml.
- WINKEL kolf nematode suspensie in een koude kamer of in incubator van 10 - 20 ° C.
NB: controleer opgeslagen flessen periodiek houdbaarheid van EPN is variabel. Meestal steinernematids kan worden opgeslagen voor 6 - 12 maanden, zonder de noodzaak van subcultuur, terwijl heterorhabditids meer periodieke check-ups kunnen vereisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grondmonster Collection
Derde fase infectieuze jonge exemplaren van EPN zijn de enige vrij levende stadia in de levenscyclus van deze nematoden 'die wonen in de bodem (figuur 1). Daarom grondmonsters is een zeer efficiënte methode om te herstellen van deze nematoden. Figuur 4 toont een bodemprofiel waarin de diepte waarop de monsters moeten worden genomen. Het behoud van het vocht van een monster is een belangrijke factor voor de overleving van de nematoden. Daarom is het belangrijk om bodemmonsters in plastic zakken te houden en te handhaven op koele temperaturen tijdens het transport naar het laboratorium (figuur 4).
Nematode Recovery
In de natuur, is de kans op het vinden van insecten natuurlijk geparasiteerde door EPN zijn minder dan 3%, tenzij er een epidemie en een grotere steekproef van insecten met EPN besmetting wordt gevonden. Daarom, het lokken van grondmonsters met insecten is een handige ca.oach aan het herstel van EPN uit hun natuurlijke leefomgeving te verbeteren. Figuur 5 toont de bodem uitspanning techniek. In dit geval, een 250 ml plastic container met een schroefdop werd gebruikt. 10 G. - Ongeveer 250 g grond werden de houder en 5 geplaatst mellonella larven werden op het oppervlak van de bodem (figuur 5 rechts). Na 5 dagen werd de houder geopend om dode insecten halen met tekenen van EPN infectie. Merk-nematode geïnfecteerde larven met rode kleuring (Figuur 5 links).
Figuur 6A toont een schematische weergave van de gewijzigde Witte val. Figuur 6B toont de set-up van de val. Merk op dat EPN besmette kadavers elkaar niet en dat filterpapier raken in de kleine petrischaal droog blijft. Figuur 6C toont IJs die uit kadavers. Let op de 'paden' van nematoden (IJs) die worden gevormd op de petrischaal als ze verhuizen naarweert het water. De tijd voor IJ ontstaan uit kadavers, hangt af van nematoden en ook afhankelijk van de temperatuur en vochtigheid waarbij de White val blijft. Figuur 6D toont IJs al het water van de grotere schotel deze val. Merk op dat de aaltjes in het water er schoon en vrij van insecten weefsels.
Figuur 1. Levenscyclus van entomopathogene nematoden.
Figuur 2. Schoppen en andere apparaten die worden gebruikt voor het verzamelen van bodemmonsters. (A) Klassieke point-shovel. (B) handschop. (C) Van links naar rechts: Viehmeyer buis, troffel, Oakfield buizen, bodem corers.
Figuur 3. Grondmonsternemings strategieën. (A) Gestratificeerde. (B) Random.
Figuur 4. Schematische weergave van de bodem bemonsteringsstrategie. Afbeelding links toont een bodemprofiel aangeeft gewenste diepte waarop de monsters moeten worden genomen. Afbeelding van rechts toont een grondmonster in een plastic zak met een passende etikettering.
3/52083fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 5. Bating van grondmonsters met insectenlarven. Afbeelding rechts toont gezonde larven, terwijl afbeelding aan de linkerkant toont dode larven na een 5 daagse lokken periode.
Figuur 6. Schematische weergave (A) en foto (BD) van een gemodificeerd White controleren. (B) Trap opgericht; (C) close-up van besmette kadaver IJ opkomst; (D) close-up toont massale opkomst van IJs van kadavers in het water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit is de eerste demonstratie van twee vormen die een aantal technieken die algemeen worden gebruikt voor het bestuderen EPN en hun symbiotische bacteriën beschrijven. Deze technieken vormen belangrijke stappen voor de succesvolle oprichting van EPN culturen in het laboratorium en vormen tevens de basis voor andere bioassays die EPN in dienst als modelorganismen voor onderzoek.
Diverse bodemonderzoeken van EPN hebben aangetoond dat hun omvang en de verspreiding kan variëren over seizoenen, habitats en geografische regio's 4, 5,9,15. Factoren zoals bodemtextuur, het vochtgehalte en de temperatuur alsook de beschikbaarheid gastheer kan een belangrijke rol spelen in hun distributie. Daarom is het essentieel dat een voorlopige gegevens over het onderzoek. Wanneer monsters worden genomen, is het belangrijk zij zo snel mogelijk verwerkt. Indien dit niet mogelijk, moeten worden opgeslagen in een koude kamer of andere geschikte temperatuur bestuurde eenheid. Verschillende temperaturen kunnenoverwogen voor het opslaan insecten lokken containers afhankelijk van de oorsprong van de monsters. Meestal koelere temperaturen (bijvoorbeeld., 15 ° C) worden beschouwd voor gematigde monsters en monsters van tropische gebieden, hogere temperaturen (bijvoorbeeld., 30 ° C) Voor overwogen.
Het insect baiting techniek is de meest gebruikte methode voor het terugwinnen van EPN van bodemmonsters. Het is een handige strategie die het ophalen van EPN in het lab maakt. Larven laatste instar van de grotere wasmot, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) worden meestal beschouwd; echter andere insecten systemen (bijvoorbeeld, krekels, meelwormen, keverlarven, enz.) en / of geschikte fasen beschouwd en worden aanbevolen om te gebruiken. Enkele studies hebben aangetoond dat een enkele extractie cyclus van de Galleria aas methode vaak onvoldoende voor het bepalen aanwezigheid van EPN in een bepaald monster of voor de extractie van alle EPN uit bodemmonsters 15. Meestal herstel variëren tussen 20 - 40% 12,15.
Een alternatief voor het lokken van grondmonsters in het laboratorium is de behandeling van lokken in situ. Dit is de plaatsing van insecten aas in het bemonsterd. In dit geval worden de insecten in kooien (meestal gemaakt van metaal of plastic mesh) geplaatst en worden achtergelaten in demarked plaatsen in het onderzoeksgebied gedurende een bepaalde periode van tijd. De kooien met de insecten worden vervolgens opgehaald en EPN infectie onderzocht. Deze benadering is arbeidsintensief en tijdrovend 15.
De nematode trapping techniek werd oorspronkelijk ontworpen door White 10 en later bewerkt door Kaya en Stock 6. De techniek maakt gebruik van de aantrekkingskracht van nematoden aan water (dat wil zeggen, positief hygrotropism) en met succes herstelt infectieuze stadia van EPN vrij van insecten weefsels en / of puin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen het verleden leden van de voorraad lab bedanken: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta en Victoria Miranda-Thompson voor hun bijdragen aan de verbetering van vele van deze protocollen. Wij erkennen de National Science Foundation steun (subsidies IOS-0840932 en IOS-0724978) SP Stock.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
- Bedding, R. A., Akhurst, R. J. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21, 109-110 (1975).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, N.Y. 473-488 (2007).
- Gaugler, R. Entomopathogenic Nematology. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2002).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. (1990).
- Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Lacey, L. A. Manual of techniques in invertebrate pathology. , Academic Press. London. (2012).
- McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae). Biological Control. 19, 182-190 (2000).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).
- Poinar, G. O. Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , CRC Press. Boca Raton. 23-61 (1990).
- Stock, S. P., Gress, J. C. Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona. Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).
- Stock, S. P., Hunt, D. J. Nematode morphology and systematics. Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. , CAB International Publishing. Wallingford, UK. 3-43 (2005).
- Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
- Stuart, R. J., Gaugler, R.
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
