Summary
Entomopathogenic nematoder er jordlevende rundorm som parasitize et bredt spekter av insekter. Vi viser prøvetakingsmetoder som benyttes for isolering av disse nematoder fra jordsmonnet ved hjelp av to teknikker: insekt lokkemat, og den modifiserte hvite felle, for utvinning av nematoder fra jordprøver og infiserte insekt kadavre hhv.
Abstract
Entomopathogenic nematoder (aka EPN) representerer en gruppe av jordlevende nematoder som parasitize et bredt spekter av insekter. Disse nematoder tilhører to familier: Steinernematidae og Heterorhabditidae. Til nå har mer enn 70 arter er beskrevet i Steinernematidae og det er ca 20 arter i Heterorhabditidae. De nematoder har en mutualistic samarbeid med Enterobacteriaceae bakterier og sammen opptre som en kraftig insekticid kompleks som dreper et bredt spekter av insektarter.
Heri, fokuserer vi på de mest vanlige teknikker vurderes for å samle EPN fra jord. Den andre delen av denne presentasjonen fokuserer på insekt-lokkemat teknikk, en mye brukt metode for isolering av EPN fra jordprøver, og den modifiserte hvite felle teknikk som anvendes for utvinning av disse nematoder fra infiserte insekter. Disse metodene og teknikkene er viktige skritt for en vellykket etablering av UPN kulttiltak i laboratoriet og også danne grunnlag for andre biologiske tester som vurderer disse nematoder som modellorganismer for forskning i andre biologiske disipliner. Teknikkene som er vist i denne presentasjonen tilsvarer de som ble utført og / eller utformet av medlemmer av SP Stock laboratoriet, så vel som de som er beskrevet av forskjellige forfattere.
Introduction
Mange nematoder er forbundet med insekter og deres verts interaksjoner varierer fra gunstig for skadelig. Heri, fokuserer vi på en gruppe av nematoder som er patogener av insekter, også kjent som entomopathogenic nematoder (eller UPN). To nematode familier tilhører denne gruppen av nematoder: Steinernematidae og Heterorhabditidae 11,13. Deres patogene effekten er faktisk gitt av deres interaksjon med fakultative anaerobe tarmbakterier (Xenorhabdus bakterier forbinder med steinernematids og Photorhabdus bakterier forbinder med heterorhabditids) 2. Bakteriene vectored fra ett insekt vert til en annen ved den eneste frittlevende nematode scenen, den tredje fasen infeksiøs juvenil (også kjent som dauer juvenile, infeksiøs juvenile eller IJ), som lever i jorda. Når du er inne insekt, de nematoder slipper bakterier inn i insekt hemolymph, som dreper insekt vert ved massiv septikemi. Bakteriene ogsådegradere insekt vev og bli nematoder 'matkilde, slik at de kan modnes og formere seg. Vanligvis er en eller to generasjoner av voksne nematoder produsert innenfor insekt kadaver. Avkommet av voksne siste generasjon reassociates med noen bakterieceller på en mer spesialisere måte enn de tidligere ernæringsmessig forhold, og gi næring til disse cellene i tarmen etter hvert som de beveger seg ut fra insekt skrotten i jorden hvor de avventer et annet insekt å parasitize 6,11,14 (Figur 1).
Siden oppdagelsen i 1927, har UPN blitt ansett som verdifulle alternativer til kjemiske plantevernmidler som de kan parasitize et bredt spekter av insekter som er skadedyr i jordbruket 3,4,5. Men i løpet av de siste to tiårene, disse nematoder og deres symbiotiske bakterier har blitt anerkjent som en formbar modellsystem for å studere biologiske, økologiske og evolusjonære aspekter av host-mikrobe interactions 14.
Målet med denne presentasjonen er å vise de metoder og teknikker som oftest brukes for jordprøver og isolering av EPN. En rekke verktøy er tilgjengelig og kan brukes til å samle inn jordprøver inkludert: jord corers, trowels, post-hulls graveredskap, naver, Prøverør, hånd spader, blant andre (figur 2).
Avhengig av formålet med studien, kan to strategier prøvetaking vurderes: a) stratifisert, b) stikkprøvekontroll (figur 3). Den stratifisert prøvetaking er vanligvis brukt som en del av en intensiv studie i en bestemt eller demarked området over en gitt tidsperiode. Generelt, blir en transekt demarked og jordprøver er tatt ved fastsatte intervaller i den transekt over en tidsperiode (figur 3A) 15. Stikkprøvekontrollen er vanligvis ansatt når du fokuserer på et stort område. Denne prøvetakingsstrategi har vært brukt for å studere mangfoldet av UPN fROM et stort geografisk område eller region (Figur 3B) 12. En rekke faktorer kan vurderes avhengig av fokus for studien, inkludert en rekke ulike høyder, jord teksturer og habitater (f.eks., Dyrket mark, skog, beite, parker, strender, elvebreddebufferen områder, osv.).
Vi viser insekt-baiting teknikken, som opprinnelig ble beskrevet av sengetøy og Akhurst 1 og representerer en enkel og selektiv alternativ for å gjenopprette EPN fra jordprøver. Dette er en selektiv prosedyre som er basert på premisset om at de nematoder (IJ scenen) vil bli tiltrukket av et insekt vert og parasitize det. Denne teknikken kan også bli vurdert for isolering av andre insekt patogener slik som sopp og bakterier 8,10.
Vi viser også den modifiserte hvite felle teknikk som brukes for å hente nematode avkom fra infiserte insekt verter 7,14. Dette er en uanstrengt møtthod som har fordelen av å hente en "ren" nematode avkom fri for rusk fra den nedverdigende insekt kadavre.
Til slutt, de teknikker som er beskrevet og vist i denne artikkel tilsvarer de unnfanget og / eller utført i vårt laboratorium, så vel som de som er beskrevet av forskjellige kolleger og medarbeidere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Jord Prøvetaking
- Betrakt som dekker et minimumsareal på 2 - 4 m 2 for hvert prøvetakingssted.
- Samle jordprøver i en dybde på minst 15 cm (figur 4).
- Ta minst 5 stikkprøver innenfor dette området.
- Ta tre underutvalg per prøve. Avhengig av formålet med studien, enten kombinere underutvalg eller holde dem atskilt.
- Plasser hver prøve i en plastpose. Tenk dobbel-bagging å unngå lekkasje av prøvene (figur 4).
- Etikett prøver med en vannfast tusj. Ta med følgende informasjon fra hvert prøvetakingssted: nettsteds (inkludert lokalitet / område / områdenavn og GPS koordinere informasjon), dato, habitat, tilhørende vegetasjon, temperatur, høyde, osv.
MERK: Hvis det er aktuelt, samle inn og / eller registrere tilstedeværelsen av insekter eller andre virvelløse dyr som samles med prøven for senere identifisering. De kan representere potensiell natural EPN verter. - Rene oppsamlingsverktøy mellom prøver med grundig vasking med vann og / eller desinfisering av dem med 70% etanol og 0,5% blekemiddel.
- Holde prøvene i en kjøler (8 - 15 ° C) under transport til laboratoriet.
- Ta en porsjon av jordprøven for analyse for å skaffe informasjon om jord sammensetning, konsistens, fuktighet, elektrisk ledningsevne eller andre ønskede parametere jord.
. 2 nematode Isolasjon fra jordprøver: Insect-baiting Teknikk
- Fjern eventuelle rester (f.eks., Steiner, trestykker eller bark, blader, etc.) Samlet med dine prøver å unngå forurensing med saprobic mikroorganismer.
- Tilsett vann til å fukte jord og lette bevegelsen av nematoder.
MERK: Bruk en sprayflaske å sakte øke fuktighetsnivået i jorda. - Plasser omtrent 200-250 ml fuktig jord i en ren plast-beholder med lokk.
- Legg insekt agn. Betrakt 5 til 10 insekter til jordoverflaten av hver prøve (figur 5).
- Dekk beholder med lokk og skru containere opp ned.
- Oppretthold beholdere i mørke og ved RT (vanligvis 22-25 ° C).
- Sjekk containere hver 2 - 3 dager og fjerne døde insekter.
MERK: legge til flere sunne insekter til hver container for videre egning av jordprøven. - Fjern døde insekter fra containere. MERK: Cadavers med en brun eller oker farge er vanligvis parasitized av steinernematids, mens mursteinsrød til mørk lilla kadavre er parasitized av heterorhabditids.
- Skyll kadavre i sterilt vann.
- Plasser kadavre i en modifisert Hvit felle for utvinning av nematode avkom (se fremgangsmåten nedenfor).
. 3 nematode Recovery fra infiserte Cadavers: Modifisert Hvit Trap
- Plasser toppen av en 50 (eller 60) mm diam. Petriskål inne i en større antenne (100 mm).
- Sett en syndgle sirkulær filterpapir (Whatman # 1) på innsiden av mindre tallerken.
- Plasser kadavre på filterpapiret av de mindre fatet gjør at kadavre ikke berøre hverandre for å unngå forurensning.
- Fyll den ytre (større) petriskål med ca. 20 ml sterilt destillert vann. Ikke tilsett vann i fatet som holder kadavre.
- Dekk store petriskål og dens innhold med lokket (figur 6).
- Etiketten retter deretter. Legg til følgende informasjon: nematode navn (arter / isolat), infeksjon (datoen infeksjon ble satt) og felle dato (dette er datoen fellen er satt opp).
- Hold felle ved RT til fremveksten av smittsomme juvenile stadier (IJs) oppstår. Denne prosessen kan ta mellom 10 - 25 dager, avhengig av nematode arter og / eller belastning vurderes.
- Innhøstingen vann med IJs ved å fjerne større antenne av fellen og helle vann med nematoder i et begerglass.
- Tillat nematoder å dekanteres til bunnen av bEaker. Denne prosessen kan ta noen minutter.
- Hell vann nøye og pass på nematoder forbli i bunnen av begeret.
- Skyll nematoder ved tilsetning av mer vann og tillater nematoder å dekantere. Dette trinnet kan bli gjentatt 2-3 ganger inntil vannet er rent.
- Plasser nematode suspensjon i en vevskultur kolbe (250 ml). Hold konsentrasjonen av suspensjonen til 1000 - 3000 nematoder / ml.
- Butikk kolbe med nematode suspensjon i et kaldt rom eller i kuvøse mellom 10 - 20 ° C.
MERK: sjekk lagret kolber jevne som holdbarhet på EPN er variabel. Vanligvis steinernematids kan lagres i 6 - 12 måneder uten behov for ompodning, mens heterorhabditids kan kreve mer periodisk kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jord Prøvetaking
Tredje stadium infektive yngel av EPN er de eneste frittlevende stadier i disse nematoder livssyklus som bor i jorda (Figur 1). Derfor samle jordprøver er en svært effektiv metode for å gjenvinne disse nematoder. Figur 4 viser et jordprofil som angir dybde hvor prøvene tas. Bevare fuktigheten i en prøve er en nøkkelfaktor for overlevelse av nematoder. Følgelig er det viktig å holde jordprøver i plastposer og opprettholde dem i kjølige temperaturer under transport til laboratoriet (figur 4).
Nematode Recovery
I naturen, sjansene for å finne insekter naturlig parasitized av EPN er mindre enn 3%, med mindre det er en epidemi, og et større utvalg av insekter med UPN angrep blir funnet. Derfor er egning av jordprøver med insekter en enkel caoach for å forbedre utvinningen av EPN fra deres naturlige miljø. Figur 5 viser jordegne teknikk. I dette tilfelle ble en 250 ml plastbeholder med en skrukork som brukes. Omtrent 250 g jord ble anbragt i beholderen og 5-10 G. mellonella larver ble tilsatt på overflaten av jordsmonnet (figur 5 til høyre). Etter fem dager, ble containeren åpnet for å hente døde insekter med tegn på UPN infeksjon. Legg merke nematode-infiserte larver med rød farge (Figur 5 venstre).
Figur 6A viser en skjematisk fremstilling av den modifiserte hvite felle. Figur 6B viser oppsettet av fellen. Legg merke til at EPN infiserte kadavre ikke berører hverandre, og at filterpapir i den lille petriskål forblir tørr. Figur 6C viser IJs dukker opp fra kadavre. Legg merke til "stier" av nematoder (IJs) som dannes på petriskål som de flytter tilmenigheter vannet. Tiden for IJ veksten fra kadavre er variabel avhengig av nematode arter og også avhengig av temperatur og fuktighet ved hvilken det hvite felle holdes. Figur 6D viser IJs som allerede er i vannet av den større skål av denne fellen. Observer at nematoder i vannet ser rent og fri for insekt vev.
Figur 1. Livssyklusen til entomopathogenic nematoder.
Figur 2. Spader og andre enheter som brukes for å samle inn jordprøver. (A) klassisk pek-spade. (B) hånd spade. (C) Fra venstre til høyre: Viehmeyer tube, sparkel, Oakfield rør, corers jord.
Figur 3. Jordprøver strategier. (A) lagdelt. (B) Random.
Figur 4. Skjematisk fremstilling av jordprøver strategi. Bildet til venstre viser en jordprofil som angir ønsket dybde hvor prøvene skal tas. Bilde av høyre viser en jordprøve i en plastpose med passende merking.
3/52083fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5. Bating av jordprøver med insektlarver. Bildet til høyre viser sunn larver, mens bildet til venstre viser døde larver etter en fem dagers baiting periode.
Figur 6. Skjematisk representasjon (A) og fotografier (BD) av en modifisert hvit felle. (B) Trap satt opp, (C) nærbilde av infiserte kadaver viser IJ veksten, (D) nærbilde som viser massiv veksten av IJs fra kadavre i vannet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne demonstrasjonen er den første av to presentasjoner som beskriver en rekke teknikker som ofte brukes for å studere EPN og deres symbiotiske bakterier. Disse teknikkene representerer viktige skritt for en vellykket etablering av EPN kulturer i laboratoriet, og også danne grunnlag for andre biologiske prøvene som ansetter EPN som modellorganismer for forskning.
Ulike undersøkelser av EPN jord har vist at deres overflod og distribusjon kan variere på tvers av årstider, naturtyper og geografiske regioner 4, 5,9,15. Faktorer som jord tekstur, fuktighetsinnhold og temperatur samt verts tilgjengelighet kan spille en nøkkelrolle i sin distribusjon. Derfor er det kritisk at en foreløpige data for undersøkelsen. Når prøvene er tatt, er det viktig at de er behandlet så snart som mulig. Imidlertid, hvis dette ikke er en mulighet, må de lagres i et kaldt rom eller annet passende temperaturstyrt enhet. Forskjellige temperaturer kan væreansett for lagring av insekt baiting containere avhengig av opprinnelsen av prøvene. Vanligvis er kjøligere temperaturer (f.eks., 15 ° C) anses for tempererte prøvene og for prøver fra tropiske regioner, varmere temperaturer (f.eks., 30 ° C) er for overveid.
Insektet baiting teknikken er den mest brukte metoden for utvinning av EPN fra jordprøver. Det er en praktisk strategi som gjør at henting av EPN i laboratoriet. Siste stadiums larver av større voks møll, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) er vanligvis betraktet; Men andre insekt verter (dvs., sirisser, melormer, bille larver, etc.) kan og / eller passende etapper vurderes og anbefales å bruke. Noen få studier har vist at en enkelt ekstraksjon syklus av Galleria-bait metode er ofte utilstrekkelig for å bestemme tilstedeværelse av EPN i en bestemt prøve eller for å trekke ut alle de EPN fra jordprøveS 15. Vanligvis utvinningsgraden varierer mellom 20 - 40% 12,15.
Et alternativ til egning av jordprøver i laboratoriet er betraktningen av lokkemat in situ. Dette er plasseringen av insekt agn i målepunktet. I dette tilfelle blir de insekter plassert i bur (vanligvis laget av en metall-eller plast mesh), og er igjen i demarked områder i undersøkelsesområdet for en gitt tidsperiode. Burene med insekter blir deretter hentet og undersøkt for UPN infeksjon. Imidlertid er denne fremgangsmåten arbeidskrevende og tidkrevende 15..
Den nematode fangst teknikken ble opprinnelig designet av Hvit 10 og senere modifisert av Kaya og lager seks. Teknikken utnytter tiltrekningen av nematoder til vann (dvs. positiv hygrotropism) og hell gjen infektive stadier av EPN fri for insekt vev og / eller rusk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke tidligere medlemmer av Stock lab: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta og Victoria Miranda-Thompson for deres bidrag til forbedring av mange av disse protokollene. Vi erkjenner at National Science Foundation støtte (tilskudd IOS-0.840.932 og IOS-0724978) til SP lager.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
- Bedding, R. A., Akhurst, R. J. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21, 109-110 (1975).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, N.Y. 473-488 (2007).
- Gaugler, R. Entomopathogenic Nematology. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2002).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. (1990).
- Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Lacey, L. A. Manual of techniques in invertebrate pathology. , Academic Press. London. (2012).
- McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae). Biological Control. 19, 182-190 (2000).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).
- Poinar, G. O. Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , CRC Press. Boca Raton. 23-61 (1990).
- Stock, S. P., Gress, J. C. Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona. Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).
- Stock, S. P., Hunt, D. J. Nematode morphology and systematics. Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. , CAB International Publishing. Wallingford, UK. 3-43 (2005).
- Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
- Stuart, R. J., Gaugler, R.
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
