Summary
昆虫病原性線虫、昆虫の広い範囲に寄生する土壌に生息する回虫です。それぞれ、土壌サンプル、感染昆虫死体から線虫の回復のために、昆虫苦しませると変更されたホワイトトラップ：我々は2つの技術を使用した土壌からこれらの線虫を分離するために使用されるサンプリング方法を示しています。
Abstract
昆虫病原性線虫（別名EPN）は昆虫の広い範囲に寄生する土壌に生息する線虫の基を表す。 SteinernematidaeとHeterorhabditidae：これらの線虫は二つの家族に属しています。今まで、70以上の種がSteinernematidaeに記載されており、Heterorhabditidae約20種が存在する。線虫は、腸内細菌と共生のパートナーシップを持っており、彼らは一緒に昆虫種の広い範囲を殺す強力な殺虫複合体として機能します。
ここに、私たちは土壌から、EPNを収集するために考慮される最も一般的な技術に焦点を当てています。このプレゼンテーションの後半では、昆虫苦しませる技術、土壌サンプルからEPNを単離するために広く使用されているアプローチ、および感染した昆虫から、これらの線虫の回復のために使用されている修正されたホワイトトラップ技術に焦点を当てています。これらの方法および技術は、EPNカルトの成功確立のための重要なステップであるURES研究室でも、他の生物学の分野での研究のためのモデル生物として、これらの線虫を考え、他のバイオアッセイのための基礎を形成する。このプレゼンテーションに示す手法が実施され、/またはSPストック研究室のメンバーだけでなく、様々な著者が記載されているものが設計したものに相当する。
Introduction
多くの線虫、昆虫に関連付けられ、それらの宿主の相互作用が有益から有害な範囲である。ここに、我々はまた、昆虫病原性線虫（あるいはEPN）として知られている昆虫の病原体である線虫のグループに焦点を当てる。 SteinernematidaeとHeterorhabditidae 11,13：二つの線虫の家族が線虫のこのグループに属している。その病原性効果は、実際には通性嫌気性の腸内細菌との相互作用によって付与される（ ラブダス細菌がheterorhabditids関連付けるsteinernematidsとのPhotorhabdus細菌に関連付ける）2。細菌は土壌中に住んでいる唯一の自由生活線虫ステージによって別の昆虫宿主（またdauerの少年、感染少年やIJとして知られている）、3段目の感染性若年性からベクトル化されています。かつて昆虫の中に、線虫は、大規模な敗血症による昆虫宿主を殺す昆虫の血リンパに細菌を放出する。また、細菌昆虫の組織を分解し、それらが成熟し増殖することができ、線虫 '食料源となる。通常、成体線虫の1つまたは2つの世代の昆虫死体内に生成される。より以前の栄養の関係よりも、やり方を専門とし、彼らが寄生する他の昆虫を待ちます土に虫の死骸から外に移動するので、その腸内にこれらの細胞を育てる中で、いくつかの細菌細胞との最後の大人の世代の再アソシエートの子孫6,11,14（ 図1）。
彼らは、農業害虫3,4,5である昆虫の広い範囲に寄生することができるように1927年に発見されているので、EPNは化学農薬への貴重な選択肢と考えられてきた。しかし、過去20年間、これらの線虫とその共生細菌は、宿主微生物の生物生態や進化の側面を研究するための可鍛性のモデル系として認識されているinteractioNS 14。
このプレゼンテーションの目的は、方法及び最も一般的に土壌のサンプリングとEPNの単離のために使用される技術を示すことである。さまざまなツールが利用可能で、含む土壌試料収集するために使用することができます。土壌の芯抜き、こて、ポストホールディガー、オーガー、サンプリングチューブ、ハンドシャベル、とりわけ（ 図2）。
研究の目的に応じて、2つのサンプリング戦略を考慮することができる：a）層状と、b）ランダムサンプリング（ 図3）。層化サンプリングは、通常、所与の期間にわたって特定の又はdemarked領域における集中的な研究の一部として使用される。一般に、トランセクトはdemarkedされ、土壌サンプルを、一定期間（ 図3A）15上トランセクトに規定の間隔で採取する。広範な領域に着目すると、ランダムサンプリングが一般的である。このサンプリング戦略は、EPNのfの多様性を研究するために使用されているROM広い地域または地域（ 図3B）12。多くの要因は、標高、土壌のテクスチャや生息地の多様な範囲（ 例えば 、耕地、森林、牧草地、公園、海岸、水辺エリアなど）を含めた研究の焦点に応じて考えることができる。
私たちは、もともと寝具、Akhurst 1で説明した土壌サンプルからEPNを回復するための簡単かつ選択的な代替手段を表した昆虫苦しませる手法を示している。これは、線虫（IJステージ）昆虫宿主に引き付けられ、それに寄生されることを前提としている選択的な手順である。この技術はまた、真菌、および細菌8,10のような他の昆虫の病原体の単離のために考慮することができる。
我々はまた、感染した昆虫のホスト7,14から線虫の子孫を検索するために使用される修正されたホワイトトラップ技術を実証する。これが満たさ簡単です劣化昆虫死体からの不要な物を「クリーンな」線虫の子孫を取得する利点を提供していますHOD。
最後に、この記事で説明して示した技術が考案および/または、私たちの研究室だけでなく、様々な同僚や協力者によって記載されているもので行われるものに対応する。
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Protocol
1。土壌サンプルの採取
- 各サンプリングサイトは4m 2 - 2の最小面積をカバーすることを検討してください。
- 少なくとも15cmの深さ（ 図4）での土壌サンプルを収集します。
- この領域内に少なくとも5のランダムサンプルを取る。
- サンプルあたり3サブサンプルを取る。研究の目的は、サブサンプルを組み合わせて、または別のそれらを保つのどちらかによって異なります。
- ビニール袋に各サンプルを置きます。サンプル（ 図4）の漏れを回避するために二重の袋詰めを考えてみましょう。
- 防水マーカーでラベルサンプル。各サンプリングサイトから以下の情報が含まれる：（ローカリティ/エリア/サイト名やGPSなどの座標情報）サイト情報を、日付、生息地、関連する植生、温度、標高など
注：必要に応じて、その後の識別のための試料を用いて収集した昆虫や他の無脊椎動物の存在を収集し、および/または記録します。彼らは潜在的な漢方を表すことができアルEPNホスト。 - 水で徹底的に洗浄および/または70％エタノールまたは0.5％の漂白剤溶液でそれらを消毒することにより、サンプル間のきれいな収集ツール。
- 研究室への輸送中に - （15°C 8）クーラー内のサンプルを保管してください。
- 土壌の組成、質感、水分、導電性又は他の所望の土壌パラメータに関する情報を得るために分析用の土壌サンプルの一部を取る。
。土壌サンプルからの2線虫の分離：昆虫苦しませるテクニック
- ごみを取り除き（ すなわち 、岩などの木材や樹皮、葉の部分。）腐生の微生物による汚染を避けるために、サンプルを用いて収集した。
- 土を湿らせて、線虫の移動を容易にするために水を加える。
NOTE：ゆっくりと土壌の水分レベルを増加させるためにスプレーボトルを使用する。 - 蓋付きの清潔なプラスチック容器に湿った土壌の約200〜250ミリリットルを配置します。
- 昆虫の餌を追加。各サンプル（ 図5）の土壌表面に5から10昆虫を検討してください。
- 蓋付きの容器をカバーし、上下逆にコンテナを回す。
- （ - 25°Cの通常22）暗闇の中で、RTでコンテナを維持する。
- 3日、死んだ虫を削除 - すべての2の容器を確認してください。
注：土壌サンプルをさらに苦しませるために、各コンテナに追加の健全な昆虫を追加します。 - 容器から死んだ虫を取り除く。注：濃い紫色の死体に赤レンガをheterorhabditidsによって寄生されたのに対し、茶色や黄土色に着色した死体は、通常、steinernematidsによって寄生されています。
- 滅菌水に死体を洗浄します。
- （下記の手順を参照）、線虫の子孫の回収のために変更されたホワイトトラップに死体を置く。
感染した死体から3センチュウ回復：変更されたホワイト罠
- 50（または60）ミリメートル直径の上に置きます。大きなお皿（100ミリメートル）の内部ペトリ皿。
- 1罪を設定小さい皿の内側GLE円形の濾紙（ワットマン＃1）。
- 必ず死体を作るより小さな皿のフィルター紙の上に置いて、死体は汚染を避けるために、お互いに手を触れないでください。
- CAで外側（大きい）ペトリ皿を埋める。滅菌蒸留水20ml。死体を保持している皿に水を追加しないでください。
- 蓋（ 図6）を持つ大規模なシャーレとその内容をカバーしています。
- それに応じてお料理にラベルを付けます。線虫の名前（種/分離株）、感染日付（日付感染が設定された）とトラップの日付（これはトラップが設定されている日付です）：以下の情報を追加します。
- 感染幼虫期（IJS）の出現が起こるまで、室温でトラップしておいてください。線虫種および/または考慮さ菌株によって25日 - このプロセスは、10の間に取ることができます。
- トラップの大きなお皿を取り出し、ビーカーに線虫で水を注ぐことによってIJSで収穫水。
- 線虫は、Bの底にデカントすることができますエーカー。このプロセスには数分かかる場合があります。
- 必ず線虫は、ビーカーの底に残っていること、丁寧に水を注ぐ。
- より多くの水を追加し、線虫をデカントできるようにすることで、線虫を洗浄します。水がきれいになるまで3回 - このステップでは、2を繰り返すことができます。
- 組織培養フラスコ（250ml）に線虫サスペンションを配置します。 3000線虫/ mlに - 1000懸濁液の濃度を保つ。
- 20℃ - 低温室で、10間のインキュベーター内で線虫懸濁液と店のフラスコ
注：EPNの保存期間が可変であるように、定期的に保存されたフラスコを確認してください。 heterorhabditidsは、より定期的な検診が必要な場合があり、一方、継代培養を必要とせずに、12ヶ月 - 通常steinernematids 6のために保存することができます。
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Representative Results
土壌サンプルの採取
EPNの3段目の感染少年は、土壌（ 図1）に存在するこれらの線虫のライフサイクルの中で唯一の自由生活のステージです。したがって、土壌サンプルを採取することは、これらの線虫から回復するための非常に効率的な方法である。 図4は、サンプルを採取する位置の深さを示す土壌断面を示している。サンプルの水分を維持することは線虫の生存のための重要な要因である。これにより、プラスチックバッグに土壌サンプルを維持し、実験室（ 図4）の通過中に冷たい温度でそれらを維持することが重要である。
線虫の回復
流行とEPNの侵入と昆虫の大きなサンプル見つかるがない限り、自然の中で、自然にEPNによる寄生昆虫を見つける可能性は、3％未満である。したがって、昆虫と土壌サンプルの苦しませる便利APPRですその自然の生息地からEPNの回復を促進するためにoach。 図5は、土壌苦しませる手法を示している。この場合、ねじ蓋付き250mlのプラスチック容器を使用した。 10 G. -土壌の約250gを、容器5内に配置したmellonella幼虫は土の表面（右図5）に追加されました。 5日後、容器はEPN感染の兆候で死んだ虫を取得するために開設されました。赤色の着色（左図5）でのお届けの線虫に感染した幼虫。
図6Aは、修飾されたホワイトトラップの概略図を示す。 図6Bは、トラップのセットアップを示す。 EPN感染死体が互いに接触しないことに注意して、小さなペトリ皿のその濾紙を乾燥したまま。 図6Cは、死体から出てくるIJSを示しています。彼らが移動するペトリ皿の上に形成された線虫の「トレイル」（IJS）に注意し水区。死体からのIJ出現の時間が線虫種とホワイトトラップが保持される温度や湿気にも依存に応じて可変である。 図6Dは、IJSは、このトラップの大きな皿の水に既に示しています。水中での線虫がきれいで昆虫の組織の自由を見ていることを観察します。
図1。昆虫病原線虫のライフサイクル。
図2。シャベルや土壌サンプルを採取するために使用される他のデバイス（A）クラシックポイント·シャベル（B）ハンドシャベル。左から右へ（C）：Viehmeyerチューブ、こて、oakfieldチューブ、土壌の芯抜き器。
図3。土壌サンプリング戦略（A）層別（B）ランダム。
図4。土壌のサンプリング戦略の模式図。左の画像はサンプルを採取する位置の所望の深さを示す土壌断面を示している。右の画像は、適切なラベルとビニール袋での土壌サンプルを示しています。
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図5。昆虫の幼虫で土壌サンプルの〜を除いて。左の画像は、5日間苦しませる期間後に死んだ幼虫を示しているのに対し、右の画像は、健康的な幼虫を示しています。
図6変性ホワイトトラップの模式図（A）と写真（BD）。近くのIJ出現を示す感染した死体のアップ（C）、（B）に設定トラップ（D）クローズアップ水に死体からIJSの大規模な出現を示した。
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Discussion
このデモでは、一般的に、EPNとその共生細菌を研究するために使用されている多くの技術を説明する2つのプレゼンテーションの最初のものです。これらの技術は、実験室でのEPN培養の成功確立のための重要なステップを表し、また、研究のためのモデル生物として、EPNを採用し、他のバイオアッセイのための基礎を形成する。
EPNの様々な土壌調査では、その豊かさと分布は季節、生息地や地域4、5,9,15間で異なることが示されている。土壌テクスチャ、水分含量、温度、ならびに宿主の可用性などの要因は、それらの分布において重要な役割を果たし得る。そのため、調査に関する予備的データが重要である。サンプルが採取されたら、それらはできるだけ早く処理されることが重要である。これは可能性でない場合は、それらは、低温室又は他の適切な温度制御ユニットに記憶されるべきである。異なる温度であってよいサンプルの起源に依存昆虫ベイトコンテナを格納するために検討した。意図のために通常、低い温度（ 例えば 、15℃）は、熱帯地域から温帯のサンプルとサンプルのために考慮され、暖かい温度（ 例えば 、30℃）である。
昆虫ベイティング技術は、土壌サンプルからEPNを回収するための最も一般的に使用される方法である。それは実験室でEPNの検索を可能にする便利な戦略である。大きなワックス蛾の終齢幼虫、 ガレリアmellonella（鱗翅目：メイガ）は、通常考えられている。しかし、他の昆虫のホスト（ すなわち、コオロギ、ミルワーム、カブトムシの幼虫など ）および/ または適切な段階を考えることができ、使用することをお勧めします。いくつかの研究は、 ガレリア·ベイト法の単一抽出サイクルは、多くの場合、特定の試料中のEPNの存在を決定するため、または土壌試料からEPNのすべてを抽出するには不十分であることが示されている15秒 。 40％12,15 -通常、回収率は20間で異なる。
実験室での土壌サンプルの苦しませるの代替は、 その場で苦しませるの考慮事項です。これはサンプリング部位における昆虫の餌の配置である。この場合には、昆虫（通常は金属またはプラスチック製のメッシュ）ケージに入れ、一定時間の学習領域におけるdemarked部位に残される。昆虫のケージは、その後、取得され、EPN感染を調べる。しかし、このアプローチは、労働集約的で時間を消費する15である。
線虫の捕獲技術は、元々白10が設計し、後にカヤや在庫6で修正された。技術は、水（ すなわち、正hygrotropism）に線虫の誘引を利用し、正常に昆虫組織および/ または破片の自由EPNの感染の段階を回復します。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
これらのプロトコルの多くの改善に貢献し、サム·ギュキム、キャサリンPlichtaビクトリアミランダ·トンプソン：著者は、在庫ラボの過去のメンバーに感謝したいと思います。我々は、SP株式に（補助金のIOS-0840932およびIOS-0724978）国立科学財団の支援を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
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