Summary
हम macrophage- सी कल्पना करने के लिए कैसे का वर्णन neoformans (CN) डिजिटल प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस की प्रक्रिया पर विशेष जोर देने के साथ वास्तविक समय में बातचीत,. व्यक्तिगत रूप से संक्रमित मैक्रोफेज इस तकनीक का उपयोग इस घटना के विभिन्न पहलुओं का पता लगाने के लिए अध्ययन किया जा सकता है.
Abstract
क्रिप्टोकोकस neoformans से मैक्रोफेज के संक्रमण के कई पहलुओं को बड़े पैमाने पर अध्ययन किया और अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है. हालांकि, स्पष्ट रूप से समझ नहीं है कि एक विशेष बातचीत गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस है. इस प्रक्रिया में, खमीर कोशिकाओं मैक्रोफेज और CN व्यवहार्य दोनों को छोड़ देता है कि एक खराब समझ तंत्र द्वारा बाह्य अंतरिक्ष में जारी किए हैं. यहाँ, हम समय व्यपगत माइक्रोस्कोपी द्वारा एक 24 घंटा संक्रमण अवधि के लिए व्यक्तिगत रूप से संक्रमित मैक्रोफेज की एक बड़ी संख्या का पालन करने के लिए क्या करते हैं. संक्रमित मैक्रोफेज एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर के रूप में ही स्थितियां प्रदान करता है कि एक खुर्दबीन से जुड़ी एक सीओ 2 माहौल के साथ एक हीटिंग कक्ष में रखे जाते हैं. लाइव डिजिटल माइक्रोस्कोपी स्थिर छवियों से उपलब्ध नहीं है कि एक मेजबान और रोगज़नक़ के बीच गतिशील बातचीत के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. ठीक इसके विपरीत मैक्रोफेज फंगल संक्रमण कैसे संभाल के रूप में सुराग प्रदान कर सकते हैं और प्रत्येक संक्रमित कोशिका कल्पना करने में सक्षम होने के नाते. इस तकनीक को मैंएक जटिल घटना के पीछे हैं कि गतिशीलता के अध्ययन में एसए शक्तिशाली उपकरण.
Introduction
क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं और मैक्रोफेज के बीच एक कवक संक्रमण के चरणों में अच्छी तरह से 1-3 दर्ज हैं. खमीर कोशिकाओं मैक्रोफेज द्वारा किया जाता है, के बाद बातचीत की एक किस्म हो सकती है: बृहतभक्षककोशिका बाह्य अंतरिक्ष में अपने फंगल लोड रिहा lyse सकता है, या यह अपने सेलुलर झिल्ली 4 के अंदर खमीर कोशिकाओं रखने के द्वारा संक्रमण को नियंत्रित कर सकता है. गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस, एक बृहतभक्षककोशिका आसपास के वातावरण में क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं में से कुछ या सभी expunged जिसमें एक प्रक्रिया या एक पड़ोसी सेल और मेजबान और रोगज़नक़ दोनों 5 व्यवहार्य रहना: हालांकि, कई साल पहले एक नई परिणाम दो समूहों द्वारा स्वतंत्र रूप से वर्णित किया गया -8. कई अध्ययनों से इस बातचीत के पीछे आणविक तंत्र को समझने की कोशिश की है, लेकिन हम अभी भी इस घटना ड्राइव पर एक पूर्ण समझ नहीं है.
क्षमता वास्तविक समय में छवियों पर कब्जा करने और फिर बाद में कई संक्रमित का विश्लेषण करने के लिएएड मैक्रोफेज एक एक कवक संक्रमण के दौरान आकृति विज्ञान और मैक्रोफेज की भी तनाव में समय, स्थानिक क्षमता, परिवर्तन के संबंध में गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस आसपास के भौतिक गुणों के बारे में कई सवालों के जवाब देने की अनुमति देता है. कोशिकाओं एक मशीन के बराबर है कि एक वातावरण में रखे होने की अनुमति देकर, हम बृहतभक्षककोशिका कवक सेल बातचीत की गतिशील प्रकृति झलक सकता है. शोधकर्ताओं ने इस प्रक्रिया के विभिन्न घटकों का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. एक अन्य समूह गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस प्रोटीन डोमेन nucleating धो 10 नष्ट कर दिया था है कि कोशिकाओं में अवरुद्ध था कि दिखाने के लिए इस विधि का इस्तेमाल करते हुए इस प्रक्रिया में फेगोसोम की भूमिका, फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना और actin अवरुद्ध एजेंट 9 का उपयोग कर स्पष्ट कर दिया गया था. साइटोकाइन संकेत का असर भी वास्तविक समय माइक्रोस्कोपी 11 का उपयोग कर पता लगाया गया है. इस प्रक्रिया को सी तक सीमित नहीं है यह रूप neoformans भी कैंडिडा सफेद के साथ देखा गया है, anotheमैक्रोफेज 12 को संक्रमित करने की क्षमता है कि कवक रोगज़नक़ आर. इन निष्कर्षों को इस विधि के बारे में हम बहुत कम जानते एक क्षेत्र के लिए जानकारी का खजाना प्रदान कर सकते हैं कि कैसे के उदाहरण हैं.
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Protocol
सभी जानवर काम नियमों और मेडिसिन के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज में जानवरों के अध्ययन के लिए संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था.
सी के 1 विकास की स्थिति neoformans H99 (सीरोटाइप ए)
- व्यक्तिगत सी बढ़ो Sabouraud अगर प्लेटों पर neoformans (CN) कालोनियों.
- एक दिन प्रयोग करने से पहले, एक कॉलोनी का चयन करें और Sabouraud शोरबा के 10 एमएल टीका लगाना.
- संस्कृति 250 आरपीएम की गति से मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात विकसित करने की अनुमति.
2 अलगाव और C57 से प्राथमिक अस्थि मैक्रोफेज की तैयारी / BL6 चूहे
- अब कोई साँस लेने तक एक सीओ 2 चैम्बर में पशु रखकर चूहों euthanize. एक दूसरा उपाय के रूप में, cervically विच्छेदन की शुरुआत से पहले गर्दन हटाना. 70% एथिल शराब के साथ पूरे शरीर जीवाणुरहित.
- बाँझ DMEM में दोनों femurs और टिबिया और जगह हड्डियों निकालें.
- अतिरिक्त ऊतक और मांसपेशियों डे का उपयोग निकालेंहड्डियों को पूरी तरह से साफ कर रहे हैं जब तक licate पोंछे.
- 70% एथिल अल्कोहल युक्त एक पेट्री डिश में ही बरकरार हड्डियों प्लेस और एसोसिएटेड सूक्ष्मजीवों को मारने के लिए 3 मिनट के लिए सेते हैं. बाँझ DMEM के साथ पेट्री डिश में हड्डियों और जगह निकालें.
- ध्यान से हड्डियों के सिरों में कटौती. एक खाली 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब बर्फ पर रखा जाता है और प्रत्येक हड्डी के माध्यम से एक 25 जी सुई का उपयोग ठंड DMEM के 10 मिलीलीटर ध्यान से फ्लश के ऊपर हड्डी पकड़ो.
नोट: प्रत्येक माउस 4 हड्डियों (2 femurs, 2 tibias) निकलेगा. इसलिए एक माउस सेल निलंबन के लगभग 40 मिलीलीटर उपज चाहिए. - 650 x जी पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र.
- इस centrifugation के दौरान, तैयार करने और फिल्टर अस्थि मज्जा मैक्रोफेज 20% L929, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 10% एनसीटीसी-109, 1% पेन Strep, 1% HEPES, 1% एल Glutamine साथ पूरक DMEM के होते हैं जो मीडिया खिला बाँझ , गैर आवश्यक अमीनो एसिड 1%, 0.1% 2-mercaptoethanol.
- मीडिया को खिलाने के 10 एमएल के साथ Resuspend जिसके परिणामस्वरूप गोली. सेल सस्पेंस दर्रासेल clumps को बाधित और बड़े मलबे को हटाने के लिए एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से आयन.
- प्लेट (10 प्लेटों की कुल के लिए) टिशू कल्चर उपयोग के लिए निर्दिष्ट कर रहे हैं कि पेट्री डिश में खिला मीडिया के 10 एमएल में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर.
- कोशिकाओं 10% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर पालन करने की अनुमति. , 7 दिन पर दिन 3 पर ताजा खिला मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें पूरी तरह खिला मीडिया और मैक्रोफेज इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं की जगह.
- प्रयोग करने से पहले दिन, खिला मीडिया को निकाल कर थाली से मैक्रोफेज अलग और थाली अभिकर्मक अलग करना एक कोमल सेल की 5ml जोड़ें.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए सेते हैं और कोमल pipetting साथ मैक्रोफेज हटा दें.
- 10 मिनट के लिए 650 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं.
- मीडिया को खिलाने के 1 मिलीलीटर में resuspend गोली. एक 1:20 कमजोर पड़ने का उपयोग करना, एक रुधिरकोशिकामापी पर सेल निलंबन के 10 μl pipetting द्वारा मैक्रोफेज की एकाग्रता की गणना.
- पेट्री डिश में 14 मिमी गिलास तली का उपयोग करना, एक थालीसीधे 200 μl की एक अधिकतम रखती है जो भीतर की अच्छी तरह पर 1 एक्स 10 5 मैक्रोफेज की एकाग्रता, तो चित्रा 4 में दिखाया गया के रूप में इस मात्रा से अधिक नहीं करने के लिए सावधानी रखना.
- कोशिकाओं 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बर्तन रखकर कांच पेट्री डिश का पालन करने की अनुमति दें.
- 500 यू / एमएल में 1 मिलीग्राम / एमएल और IFNg में LPS के साथ पूरक मीडिया खिलाने के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं रातोंरात सेते दें.
प्राथमिक Murine मैक्रोफेज और सी के 3 सह ऊष्मायन neoformans
- प्रयोग के दिन, 420 x जी पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा रातोंरात टीका संस्कृति और गोली खमीर कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर हटा दें.
- ऊपर उल्लेख किया गति और समय पर polysaccharide glucuronoxylomannan (GXM) की तरह मीडिया और बाह्य क्रिप्टोकोकल उत्पादों को दूर करने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं 3 बार धोएं.
- 100 कमजोर पड़ने: बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर में Resuspend सेल गोली और एक 1 बनाते हैं. टी के पिपेट 10 μlवह एक रुधिरकोशिकामापी पर कमजोर पड़ने और कोशिकाओं गिनती. 1 के MOI में खमीर कोशिकाओं जोड़ें: 5. 1 एक्स 10 5 मैक्रोफेज अगर वहाँ उदाहरण के लिए, / खैर, CN की 5 एक्स 10 6 / एमएल के एक सेल निलंबन बनाने के लिए और 5 एक्स 10 5 Cn की कुल राशि के लिए इस समाधान के 100 μl जोड़ें.
- 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में मैब 18B7 एंटीबॉडी के साथ खिला मीडिया के 1 मिलीलीटर क्रिप्टोकोकल सेल निलंबन की गणना की मात्रा जोड़ें. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेल निलंबन सेते हैं.
- कांच से खिला मीडिया निकालें पेट्री डिश तली और बाँझ पीबीएस के साथ 1x धो लो. अच्छी तरह से करने के लिए सीधे opsonized CN की 100 μl जोड़ें.
- कोशिकाओं 10% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते दें.
- सह ऊष्मायन के बाद, मैक्रोफेज Cn भाँति है कि माइक्रोस्कोप से जांच ले. भाँति माना जाता है, क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं स्पष्ट रूप से मैक्रोफेज के अंदर देखा जाना चाहिए.
- बाँझ पीबीएस के साथ धो पेट्री डिश 3x किसी भी और सभी extracellula दूर करने के लिएआर Cn.
- 1-2 मैब 18B7 के अलावा बिना मीडिया को खिलाने की मिलीलीटर, और स्थापित माइक्रोस्कोप जोड़ें.
डिजिटल प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग वास्तविक समय में 4 Visualizing गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस
नोट: सीओ 2 वितरण और एक हीटिंग इकाई की आवश्यकता है शामिल है कि एक संलग्न incubating कक्ष के साथ आता है कि एक खुर्दबीन इन प्रयोगों को करने के लिए.
- प्रयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए incubating कक्ष पूर्व गर्म. सीओ 2 यूनिट प्रयोग के शुरू में 5% लिखा है कि यह सुनिश्चित करें.
- जगह कांच सीओ 2 ढक्कन के साथ कवर किया, और कोई गर्मी पलायन सुनिश्चित करने के लिए सभी दरवाजे बंद, खुर्दबीन मंच पर पेट्री डिश तली.
- चरण विपरीत में माइक्रोस्कोप के साथ 10x उद्देश्य का उपयोग, संक्रमित मैक्रोफेज की एक स्पष्ट क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित. प्रयोग के आधार पर अध्ययन करने की आवश्यकता है कि कितने मैक्रोफेज द्वारा प्रयोग किया जाता उद्देश्य का निर्धारण.
- प्रादेशिक सेना के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर सेट करेंएक छवि एक 24 घंटे की अवधि के लिए हर 4 मिनट KE.
- 24 घंटे के बाद, प्रयोग पूरा होने पर पहुँच गए हैं जाएगा और 361 छवियों की कुल एकत्र किया गया होगा. एक 5% संपीड़न पर .jpegs के रूप में इन छवियों को निर्यात. छवि जम्मू सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, प्रति सेकंड 5 फ्रेम पर एक दृश्य ढेर के रूप में छवियों को देखने. फिल्म प्रकाशन या एक प्रस्तुति के लिए देखा जा करने की जरूरत है, तो एक AVI या प्रारूप दर्शक के लिए सबसे अच्छा काम करता है जिस पर निर्भर करता है .Mov फ़ाइल रूप में या तो इसे बचाने के लिए.
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Representative Results
इस तकनीक का उत्पादन छवियों कि कोशिकाओं सी phagocytosed के बाद क्या होता है आसपास के जानकारी एकत्र करने के तरीकों की एक किस्म में विश्लेषण किया जा सकता है neoformans. चित्रा 1 में देखा, संक्रमित या असंक्रमित या तो कर रहे हैं कि लगभग 100 मैक्रोफेज कर रहे हैं. इन मैक्रोफेज में से हर एक दर्शक एक बहुत सूक्ष्म स्तर पर मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने का अवसर देता है. आंकड़े 2 और 3 शो के रूप में, अलग एक बृहतभक्षककोशिका और खमीर सेल के बीच हो सकता है कि परिणाम है, और यहां तक कि बृहतभक्षककोशिका-बृहतभक्षककोशिका के बीच कर रहे हैं. मैक्रोफेज गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस, सेल सेल हस्तांतरण, या हो सकता है कि किसी भी अन्य सेलुलर प्रक्रिया के दौर से गुजर के रूप में रन बनाए जा सकते हैं. संक्रमण के दौरान इस तरह की घटनाओं के समय भी फिल्म दर्ज की जा रही है जब सेट कर रहे हैं कि मापदंडों के आधार पर पता लगाया जा सकता है.
चित्रा 1:. संक्रमित मैक्रोफेज की फील्ड यह आंकड़ा एक 24 घंटा संक्रमण अवधि के शुरू में व्यक्तिगत रूप से संक्रमित मैक्रोफेज के एक पूरे क्षेत्र से पता चलता है. यह अधिक महत्वपूर्ण बात, यह मैक्रोफेज (एक बड़े नोक से संकेत के रूप में) संक्रमित और जो (एक छोटा सा तीर द्वारा संकेत के रूप में) नहीं फंगल कोशिकाओं को शामिल कर रहे हैं जो है कैसे स्पष्ट क्षेत्र कोशिकी Cn से मुक्त उल्लेखनीय है कि किया जाना चाहिए. स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
मूवी 1 : Macrophage- सी के दृश्य neoformans 24 घंटा संक्रमण काल. फिल्म की प्रारंभिक फ्रेम असंक्रमित हैं कि कुछ और क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं की मात्रा बदलती phagocytized है कि कुछ के साथ क्षेत्र भर में कई मैक्रोफेज से पता चलता है. फिल्म की प्रगति, कोशिकाओं की गिरफ्तारीई सब गतिशील और क्षेत्र के बारे में आगे बढ़ देखा जा सकता है. हम वे गुजरना सेलुलर प्रक्रिया किस तरह देखने के लिए इन मैक्रोफेज में से प्रत्येक का पालन करने में सक्षम हैं.
चित्रा 2:. प्राथमिक Murine मैक्रोफेज के दौर से गुजर गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस (एक सफेद नोक ने संकेत पैनल,) एक संक्रमित बृहतभक्षककोशिका गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस की शुरुआत चरणों के दौर से गुजर देखा जाता है. फेगोसोम (पैनल ई.पू.) विस्तार करने के लिए शुरू होता है और फंगल लोड शिफ्ट करने के लिए शुरू होता है. पैनल डे में देखा जा सकता है के रूप में कई Cn कोशिकाओं तो बाह्य अंतरिक्ष में जारी किए हैं. एक सफेद नोक ने संकेत पैनल एफ में दूसरे संक्रमित बृहतभक्षककोशिका, यह भी एक गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस घटना (पैनल जीएच) आए. सफेद तीर द्वारा दिखाया के रूप में इस प्रक्रिया के अंत में, दोनों मैक्रोफेज खाली (पैनल मैं) छोड़ दिया जाता है. स्केल बार 25 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
मूवी 2 :. Visualizing प्राथमिक Murine मैक्रोफेज के दौर से गुजर गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस इस फिल्म में, यह क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं एक संक्रमित बृहतभक्षककोशिका के अंदर कर रहे हैं कि स्पष्ट है. मैक्रोफेज उत्तेजित हो जाता है और एक खमीर सेल फेगोसोम भीतर नवोदित देखा जा सकता है. क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं तो जल्दी से आसपास के वातावरण में expunged कर रहे हैं. एक दूसरा संक्रमित बृहतभक्षककोशिका गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस और अधिक खमीर कोशिकाओं बाह्य अंतरिक्ष में जारी किए हैं आए. आगे बढ़ जारी रखने के लिए अपनी क्षमता से संकेत के रूप में मेजबान कोशिकाओं क्रिप्टोकोकल एक्सोसाइटोसिस बाद व्यवहार्य रहते हैं.
चित्रा 3:. प्राथमिक Murine मैक्रोफेज के दौर से गुजर सेल सेल स्थानांतरण एक और procइस प्रोटोकॉल का उपयोग कर लिया जा सकता है कि ईएसएस क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं एक पड़ोसी बृहतभक्षककोशिका के लिए एक बृहतभक्षककोशिका से स्थानांतरित कर रहे हैं तब होता है जब जो सेल सेल हस्तांतरण है. दो संक्रमित मैक्रोफेज सफेद तीर (पैनल) ने संकेत दिया एक दूसरे के करीब निकटता में हैं और सेल सेल हस्तांतरण (पैनल बी) शुरू करने के लिए भी करीब ले. लाल तीर द्वारा संकेत एक सेल सेल पुल क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं हस्तांतरण (पैनल सी, ई) के दौरान आसपास के वातावरण के संपर्क में नहीं हैं कि इस तरह के दो मैक्रोफेज के बीच बनाई है. हस्तांतरण पूरा होने के बाद, कोशिकाओं (पैनल डी, एफ) दूर तोड़ने. स्केल बार 25 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
मूवी 3 :. संक्रमित मैक्रोफेज के बीच सेल सेल स्थानांतरण Visualizing अवसर पर मैक्रोफेज मेजबान कोशिकाओं के बीच क्रिप्टोकोकल सेल के हस्तांतरण की सुविधा है कि इस तरह से बातचीत करेंगे. खमीर कोशिकाओं उजागर नहीं कर रहे हैंबाह्य वातावरण और मेजबान कोशिकाओं को व्यवहार्य रहते हैं. इस फिल्म में, दो संक्रमित मैक्रोफेज एक बृहतभक्षककोशिका से दूसरे शटल क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं को दो अलग अलग अवसरों पर सेल सेल पुल बनाएँ.
चित्रा 4: कोशिकाओं के योजनाबद्ध दिखा तैयारी.
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Discussion
यहाँ हम फंगल-बृहतभक्षककोशिका बातचीत दर्ज की गई और एक 24 घंटे की अवधि में वास्तविक समय में विश्लेषण किया जा सकता है जिसके द्वारा एक विधि का वर्णन किया है. हमारी प्रयोगशाला गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस के लौकिक पहलुओं के कई अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया गया है और इस प्रक्रिया है कि चारों ओर रूपात्मक घटकों का पता लगाने के लिए वास्तविक समय माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए जारी रहेगा.
इस तकनीक को आदर्श परिणाम उपज के लिए, विशेष ध्यान प्रोटोकॉल में कुछ कदम को दी जानी चाहिए. बहुत अधिक सेल आंदोलन और व्यक्ति की कोशिकाओं की बातचीत के देखने रुकावट है के रूप में प्रयोग करने योग्य नहीं है कि एक फिल्म बना सकते हैं क्योंकि बहुत कुछ कोशिकाओं महत्वपूर्ण नहीं है कि डेटा उपज हो सकती है, जबकि इससे पहले रात चढ़ाया जाता है कि सेल घनत्व, महत्वपूर्ण है. लक्ष्य व्यक्तिगत मैक्रोफेज संक्रमण अवधि की अवधि के लिए पीछा किया जा सकता है कि इस तरह के मैक्रोफेज की एक समान स्थान क्षेत्र को प्राप्त है. कि उसी नस में, कोशिकी Cn दूर धोने के पूर्व के रूप में एक महत्वपूर्ण कदम हैtracellular Cn क्षेत्र अस्पष्ट और मैक्रोफेज की दृश्यता का नुकसान करने के लिए ले जा सकता है, जो समय के साथ बांट देंगे. फिल्म की लंबाई पर निर्भर करता है, फ्रेम का अध्ययन करना व्यर्थ चित्र बनाता है और इसलिए, रिकॉर्डिंग संक्रमण के दौरान विभिन्न बिंदुओं पर जाँच की जरूरत है, जो ध्यान से बाहर बदलाव कर सकते हैं.
उल्लिखित के रूप में, इस तकनीक के अन्य प्रयोगों के मापदंडों के भीतर फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता विभिन्न तरीके हैं. कई अलग फ्लोरोसेंट रंगों और मार्करों झिल्ली और phagosomal गतिशीलता को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन एक तस्वीर विरंजन का सतर्क होना चाहिए और यह कोशिकाओं की फिटनेस पर हो सकता है प्रभावित करते हैं. सेल प्रकार की एक किस्म भी हो सकती है कि मतभेदों को अध्ययन करने के लिए अन्य कवक उपभेदों के साथ संयोजन के रूप में J774.1 मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह, monocytes या amoebas रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे प्रयोगों कोशिकाओं की एक बड़ी मात्रा के आंकड़े एकत्र करने की आवश्यकता होती है क्योंकि हम फिर भी एक एक उच्च इस्तेमाल कर सकते हैं, 10X का एक उद्देश्य उपयोग करने का सुझावबस कुछ कोशिकाओं का अध्ययन करने के उद्देश्य. प्रत्येक छवि लिया जाता है कि समय भी समायोजित किया जा सकता. एक छवि ले रहा है 24 घंटा के लिए हर 4 मिनट सभी फ्रेम संकुचित कर दिया गया है जब लंबाई में लगभग 1 मिनट चलाता है कि एक फिल्म पैदावार. बढ़ाने से या तो पहलू (संक्रमण की अवधि या फ्रेम के बीच का समय) कुछ प्रयोगशालाओं के लिए एक मुद्दा हो सकता है, जो संग्रहीत करने की आवश्यकता है कि फाइलों की मात्रा बढ़ जाती है.
गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस संक्रमण के दौरान तेजी से और विभिन्न समय अंतराल पर होती है कि एक अविश्वसनीय रूप से गतिशील प्रक्रिया है. इसलिए, इस तरह के ट्रांसमिशन और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में अन्य तरीकों का उपयोग कर इस बातचीत के दौर से गुजर मैक्रोफेज पर कब्जा करने की कोशिश कर अत्यंत दुर्लभ हो सकता है. कारण नमूने तय की और कार्रवाई कर रहे हैं कि कैसे की प्रकृति के कारण, एक क्या देखा जा रहा है निश्चित तरह के सेल या apoptosis के रूप में अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं बनाम गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस है कि कुछ नहीं हो सकता. इसके अलावा, गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस की एक बानगी मेजबान और रोगज़नक़ के माध्यम से रहना है बाद में ble इन तरीकों केवल एक भी क्षण में एक प्रक्रिया के फोटो उत्पादन कर सकते हैं के बाद तय की छवियों से deduced नहीं किया जा सकता है कि जो कुछ है.
इस प्रोटोकॉल सेलुलर प्रक्रियाओं की अनगिनत छवियाँ प्रदान कर सकते हैं, वहीं मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करने में कुछ सीमाएं हैं. कम उद्देश्य हम फेगोसोम और गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस की एक अच्छी तरह से समझ पहलू नहीं है जो सेलुलर झिल्ली, के बीच बातचीत कल्पना करने के लिए एक उच्च पर्याप्त संकल्प छवि के लिए अनुमति नहीं है एक समय में मैक्रोफेज की एक बड़ी राशि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल करते हैं. सभी छवियों दर्ज किया गया है एक बार, निम्नलिखित कई मैक्रोफेज के पद विश्लेषण बहुत कठिन और समय लेने वाली हो सकती है. मैक्रोफेज, कांच का पालन भी उन बहुत गतिशील किया जा सकता है और बहुत जल्दी में हैं और फ्रेम से बाहर कदम होगा. यह यह कठिन शुरू से खत्म करने के लिए व्यक्तिगत मैक्रोफेज, फ्रेम की परिधि के पास हैं कि विशेष रूप से उन का पालन करने के लिए कर सकते हैं.
jove_content "> इन सीमाओं के बावजूद, इस प्रोटोकॉल मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के कई विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के तरीकों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों हम कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अन्य संघर्ष किया है कि घोषणा.
Acknowledgments
इस शोध एनआईएच पुरस्कार 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
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