Summary
We beschrijven hoe om te visualiseren macrophage- C. neoformans (Cn) interacties in real time, met bijzondere nadruk op het proces van niet-lytische exocytose middels digitale lichtmicroscopie. Met deze techniek individueel geïnfecteerde macrofagen kunnen worden bestudeerd om verschillende aspecten van dit verschijnsel bepalen.
Abstract
Veel aspecten van de infectie van macrofagen door Cryptococcus neoformans zijn uitgebreid onderzocht en goed gedefinieerd. Echter, een specifieke interactie die niet duidelijk wordt begrepen non-lytische exocytose. In dit proces worden gistcellen in de extracellulaire ruimte vrijgemaakt door een slecht begrepen mechanisme dat zowel de macrofaag en Cn levensvatbare bladeren. Hier beschrijven we hoe een groot aantal individueel geïnfecteerde macrofagen volgen een 24 uur infectie periode van tijd verstreken microscopie. Geïnfecteerde macrofagen zijn ondergebracht in een droogstoof met een CO 2 atmosfeer bevestigd aan een microscoop die onder dezelfde voorwaarden als een celcultuur incubator biedt. Levende digitale microscopie kan informatie over de dynamische interacties tussen een gastheer en ziekteverwekker die niet beschikbaar is in statische beelden te leveren. Het kunnen elke geïnfecteerde cel visualiseren kan aanwijzingen geven hoe macrofagen behandelen schimmelinfecties, en vice versa. Deze techniek isa krachtig instrument in de dynamiek die achter een complex fenomeen te bestuderen.
Introduction
De fasen van een schimmelinfectie tussen cryptococcal cellen en macrofagen zijn goed gedocumenteerd 1-3. Na gistcellen worden opgenomen door macrofagen, kan een verscheidenheid aan interacties optreden: de macrofaag kan lyseren vrijgeven zijn fungale lading in de extracellulaire ruimte, of het kan de besmetting te bestrijden door hem de gistcellen binnen de grenzen van de cellulaire membraan 4. Echter, enkele jaren geleden een nieuwe resultaat is beschreven onafhankelijk door twee groepen: niet-lytische exocytose, een werkwijze waarbij een macrofaag uitgewist sommige of alle cryptokokkeninfecties cellen in het omringende milieu of een naburige cel en zowel de gastheer en pathogeen blijven levensvatbaar 5 -8. Verschillende studies hebben geprobeerd om de moleculaire mechanismen achter deze interactie te begrijpen, maar we nog steeds hebben niet een volledige greep op wat drijft dit fenomeen.
De mogelijkheid om beelden in real-time vastleggen en dan vervolgens meerdere infecteren analyserened macrofagen maakt het mogelijk om veel vragen over de fysische eigenschappen omringende niet-lytische exocytose met betrekking tot de timing, de ruimtelijke capaciteit, veranderingen in morfologie en zelfs stress van macrofagen tijdens een schimmelinfectie te beantwoorden. Doordat de cellen worden gehuisvest in een omgeving die vergelijkbaar is met die van een incubator, kunnen we de dynamische aard van macrofaag-schimmel cel interacties blik. Onderzoekers hebben deze techniek gebruikt om diverse onderdelen van dit proces te bestuderen. De rol van de phagosome hierbij is duidelijk gemaakt met fluorescerende kleuring en actine blokkers 9, terwijl een andere groep gebruikt deze methode aan te tonen dat de niet-lytische exocytose werd geblokkeerd in cellen die had WASH kiemvormende eiwitdomeinen geschrapt 10. Het effect van cytokine signalering is ook vastgesteld met behulp van real-time microscopie 11. Deze werkwijze is niet beperkt tot C. neoformans zoals ook werd waargenomen met Candida albicans, another schimmelpathogeen dat de mogelijkheid om macrofagen infecteren 12 heeft. Deze bevindingen zijn voorbeelden van hoe deze methode een schat aan informatie kan verstrekken aan een gebied dat we zo weinig weten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke werk werd gedaan in overeenstemming met de voorschriften en richtlijnen van het Institute for Animal Studies aan Albert Einstein College of Medicine.
1 Groei Voorwaarden van C. neoformans H99 (serotype A)
- Grow individuele C. neoformans (Cn) kolonies op Sabouraud agar platen.
- Een dag voorafgaand aan het experiment, selecteer een kolonie en te enten 10 ml Sabouraudvloeistof.
- Laat kweek overnacht groeien bij 37 ° C schudden met een snelheid van 250 rpm.
2 Isolatie en vervaardiging van primaire Bone macrofagen van C57 / Bl6 Muizen
- Euthanaseren muizen door het plaatsen van dieren in een CO 2 kamer totdat niet meer ademen. Als tweede maatregel, cervicaal ontwrichten de nek voor het begin van dissectie. Steriliseren hele lichaam met 70% ethanol.
- Verwijder beide dijbenen en scheenbeen en plaats botten in steriele DMEM.
- Verwijder overtollig weefsel en spieren met behulp van devoud doekjes totdat botten zijn volledig schoon.
- Plaats alleen intacte botten in een petrischaal met 70% ethylalcohol en incubeer gedurende 3 min voor geassocieerde micro-organismen te doden. Verwijder de botten en plaats in petrischaal met steriele DMEM.
- Gesneden uiteinden van de botten voorzichtig. Houd bot over een lege 50 ml conische buis op ijs geplaatst en zorgvuldig spoelen 10 ml koud DMEM met een 25 G naald door elk been.
OPMERKING: Elke muis zal 4 botten (2 dijbenen, scheenbenen 2) opleveren. Daarom moet men muis ongeveer 40 ml celsuspensie verkregen. - Centrifugeer celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 10 min bij 650 x g.
- Gedurende deze centrifugatie bereiden en filter gesteriliseerd beenmerg macrofagen toevoeren media bestaande uit DMEM gesupplementeerd met 20% L929, 10% foetaal kalfsserum, 10% NCTC-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-Glutamine , 1% niet-essentiële aminozuren, 0,1% 2-Mercaptoethanol.
- Hersuspendeer resulterende pellet met 10 ml van het voeden van de media. Pass cel suspension door een 70 micrometer cel zeef om celklonten verstoren en verwijder grof vuil.
- Plaat 1 ml celsuspensie in 10 ml van het voeden van de media in Petri-schalen die zijn opgegeven voor weefselkweek gebruik (voor een totaal van 10 platen).
- Laat cellen hechten bij 37 ° C met 10% CO2. Voeg 5 ml verse voeding media op dag 3 Op dag 7, volledig vervangen van de voeding media en macrofagen zijn klaar om te worden gebruikt.
- De dag voorafgaand aan het experiment, los macrofagen uit plaat door het verwijderen van het voeden van de media en voeg 5 ml van een zachte cel strippen reagens tot het bord.
- Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C en macrofagen schaffen voorzichtig pipetteren.
- Pellet cellen door centrifugatie bij 650 xg gedurende 10 minuten.
- Resuspendeer pellet in 1 ml van het voeden van de media. Met een 1:20 verdunning, bereken de concentratie van macrofagen door pipetteren 10 ui celsuspensie op een hemocytometer.
- Met behulp van 14 mm glazen bodem petrischaaltjes, plaat eenconcentratie van 1 x 10 5 macrofagen rechtstreeks op het binnenoppervlak vormt waarvan maximaal 200 gl houdt, zodat voorzichtigheid om deze hoeveelheid niet overschrijden zoals getoond in figuur 4.
- Laat de cellen hechten aan de glazen petrischaal door het plaatsen van de vaat in een 37 ° C incubator gedurende 1 uur.
- Voeg 1-2 ml voeden medium aangevuld met LPS op 1 mg / ml en IFNg bij 500 u / ml en laat cellen overnacht geïncubeerd.
3 co-incubatie van Primaire muizenmacrofagen en C. neoformans
- Op de dag van het experiment, verwijdert 1 ml overnacht kweek geïnoculeerd en pellet gistcellen door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 420 x g.
- Was de cellen 3 maal met steriel PBS tot media-en extracellulaire cryptococcal producten te verwijderen, zoals de polysaccharide glucuronoxylomannan (GXM) met de snelheid en de tijd hierboven vermeld.
- Resuspendeer celpellet in 1 ml steriel PBS en een 1: 100 verdunning. Pipetteer 10 ul tverdunning hij op een hemocytometer en tel cellen. Voeg gistcellen een MOI van 1: 5. Bijvoorbeeld, als er 1 x 10 5 macrofagen / putje, maak een celsuspensie van 5 x 10 6 / ml Cn en voeg 100 ul van deze oplossing voor een totaal van 5 x 10 5 Cn.
- Voeg berekende volume cryptococcus celsuspensie 1 ml voeden media met de mAb 18B7 antilichaam bij een concentratie van 10 ug / ml. Incubeer celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Verwijder invoeren vanuit glazen bodem petrischaal en was 1x met steriele PBS. Voeg 100 ul van opsonized Cn direct goed.
- Laat cellen geïncubeerd gedurende 2 uur bij 37 ° C met 10% CO2.
- Na co-incubatie, controleren door de microscoop dat macrofagen Cn hebben geïnternaliseerd. Om in aanmerking geïnternaliseerd moeten cryptococcal cellen duidelijk te zien binnen de grenzen van de macrofaag.
- Was de petrischaal 3x met steriel PBS om alle extracellula verwijderenr Cn.
- Voeg 1-2 ml van het voeden van de media, zonder de toevoeging van mAb 18B7, en het opzetten van de microscoop.
4 Visualiseren Non-lytische Exocytosis in Real-time gebruik te maken van Digital Light Microscopy
OPMERKING: Om deze experimenten uit te voeren, een microscoop die wordt geleverd met een bijgevoegd incubatie kamer die CO 2 levering en de verwarming is vereist omvat.
- Voorafgaand aan het experiment, pre-warm het incuberen kamer gedurende ten minste 30 min tot 37 ° C. Controleer of de CO 2 uitleest 5% bij aanvang van de proef.
- Plaats glazen bodem petrischaal op microscoop platform, dek af met CO 2 deksel, en sluit alle deuren om geen warmte ontsnapt verzekeren.
- Met behulp van de 10x doelstelling met de microscoop in fase contrast, focus op een duidelijk gebied van geïnfecteerde macrofagen. Op basis van het experiment, bepalen de doelstelling door het aantal macrofagen moeten worden bestudeerd.
- Opgezet microscoop software om take een afbeelding om de 4 min voor een 24-uurs periode.
- Na 24 uur wordt het experiment voltooiing hebben bereikt en een totaal van 361 beelden zullen zijn verzameld. Deze beelden exporteren als .jpegs op een 5% compressie. Met behulp Afbeelding J software, beelden bekijken als een Visual Stack op 5 beelden per sec. Als de film moet worden bekeken voor publicatie of een presentatie, sla het op als ofwel een AVI of MOV-bestand, afhankelijk van welk formaat het beste werkt voor de kijker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beelden die deze techniek levert kan op verschillende manieren informatie omringende wat er na cellen C. hebben gefagocyteerd verzamelen geanalyseerd neoformans. Zoals te zien in figuur 1, zijn er ongeveer 100 macrofagen die ofwel of geen infectie. Elk van deze macrofagen geeft de kijker de kans om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen op een zeer microscopisch niveau. Zoals figuren 2 en 3 tonen, zijn er verschillende uitkomsten die kan voorkomen tussen een macrofaag en gistcel, en zelfs tussen macrofaag macrofaag. Macrofagen kunnen worden gemaakt als die een niet-lytische exocytose, cel-cel overdracht of andere cellulaire proces dat kan optreden. De timing van deze gebeurtenissen tijdens de infectie kan ook worden vastgesteld op basis van de parameters die worden ingesteld wanneer de film opgenomen wordt.
Figuur 1:. Gebied van geïnfecteerde macrofagen Deze figuur toont een gehele gebied van individueel geïnfecteerde macrofagen aan het begin van een 24 uurs infectie periode. Opgemerkt zij dat het gebied vrij is van extracellulair Cn en nog belangrijker, hoe duidelijk is welke macrofagen geïnfecteerd (zoals aangegeven door een grote pijlpunt) met daarin geen schimmelcellen (aangegeven door een pijltje). Schaal balk geeft 50 micrometer.
Film 1 : Visualisatie van Macrophage- C. neoformans 24 uur Infectie Periode. De eerste frame van de film toont vele macrofagen in het hele veld met een aantal dat niet-geïnfecteerde zijn en wat die verschillende hoeveelheden cryptococcal cellen phagocytized. Naarmate de film vordert, de cellen are alle beweeglijke en zichtbaar bewegen het veld. Wij zijn in staat om elk van deze macrofagen te volgen om te zien wat voor soort cellulaire proces dat ze ondergaan.
Figuur 2:. Primaire Murine macrofaag die een niet-lytische Exocytosis Een besmette macrofagen (Panel A, aangegeven met een witte pijl) wordt waargenomen ondergaat de beginstadia van niet-lytische exocytose. De phagosome begint te vergroten (paneel BC) en de schimmel lading begint te schuiven. Verschillende Cn cellen worden vervolgens afgegeven in de extracellulaire ruimte zoals te zien in DE panelen. Een tweede geïnfecteerde macrofagen in Panel F, aangeduid door een witte pijlpunt, wordt eveneens een niet-lytische exocytose event (Panel GH). Aan het einde van de werkwijze worden beide macrofagen zijn ingevuld (Panel I) zoals door de witte pijlpunten. Schaal balk geeft 25 micrometer.
Film 2 :. visualiseren primaire muizen macrofaag die een niet-lytische Exocytosis In deze film, is het duidelijk dat de cryptococcal cellen binnen de grenzen van een besmette macrofagen. De macrofaag wordt opgewonden en een gistcel kan worden gezien in de ontluikende phagosome. Cryptococcal cellen worden vervolgens snel uitgewist in het omringende milieu. Een tweede geïnfecteerde macrofaag ondergaat non-lytische exocytose meer gistcellen vrijkomen in de extracellulaire ruimte. De gastheercellen levensvatbaar blijven na cryptococcal exocytose zoals aangegeven door hun vermogen om te blijven bewegen.
Figuur 3:. Primaire Muriene Macrophage ondergaan cel-cel-Transfer andere process die kunnen worden vastgelegd met dit protocol cel-celoverdracht die optreedt wanneer cryptococcal cellen worden van de ene naar een naburig macrofaag macrofaag. Twee geïnfecteerde macrofagen dicht bij elkaar aangeduid door witte pijlpunten (Panel A) en ga nog dichter bij cel-cel overdracht (Panel B) leiden. Een cel-cel brug aangegeven door de rode pijlen wordt gevormd tussen de twee macrofagen zodat de kryptokokken cellen tijdens de overdracht (Panel C, E) niet aan de omgeving worden blootgesteld. Nadat de overdracht is voltooid, de cellen weg te breken (Panel D, F). Schaal balk geeft 25 micrometer.
Film 3 . Visualiseren Cel-cel transfer van geïnfecteerde macrofagen Soms zal macrofagen interactie zodanig dat overdracht van cryptococcal cel tussen gastheercellen vergemakkelijkt. De gistcellen worden niet blootgesteldhet extracellulaire milieu en gastheercellen levensvatbaar blijven. In deze film, twee geïnfecteerde macrofagen creëren cel-cel bruggen bij twee afzonderlijke gelegenheden shuttle cryptococcal cellen van macrofagen ene naar de andere.
Figuur 4: schematische weergave van de bereiding van cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben wij een werkwijze waarmee schimmel-macrofaag interacties kunnen worden opgenomen en in real time geanalyseerd gedurende een periode van 24 uur beschreven. Ons laboratorium heeft dit protocol gebruikt om veel van de temporele aspecten van niet-lytische exocytose bestuderen en blijft real-time microscopie om de morfologische componenten die dit proces omringen bepalen.
Voor deze techniek om ideale resultaten op, moet speciale aandacht worden besteed aan bepaalde stappen in het protocol. De celdichtheid dat voordat uitgeplaat de nacht is belangrijk omdat te veel cellen een film die niet bruikbaar als de weergave van de beweging en interacties van individuele cellen wordt belemmerd kunnen maken, terwijl er te weinig cellen data te verwaarlozen kan opleveren. Het doel is om een gelijkmatig verdeelde gebied van macrofagen zodat individuele macrofagen kunnen worden gevolgd voor de duur van de infectie periode bereiken. In diezelfde geest, het wegwassen van de extracellulaire Cn is een cruciale stap als exextracellulaire Cn verdeelt tijd die kunnen verdoezelen veld en tot een verlies van zichtbaarheid van de macrofagen. Afhankelijk van de lengte van de film, kan het frame verschuiven onscherpe beelden die onbruikbaar te bestuderen maakt en derhalve de opname moet op verschillende punten worden gecontroleerd tijdens de infectie.
Zoals aangegeven, zijn er verschillende manieren deze techniek kan worden aangepast om te passen binnen de parameters van andere experimenten. Veel verschillende fluorescente kleurstoffen en markers kunnen worden gebruikt om het membraan en phagosomal dynamiek te benadrukken, maar men moet voorzichtig zijn van foto bleken te zijn en de invloed die dit kan hebben op de conditie van de cellen. Verschillende celtypes kunnen worden gebruikt, zoals J774.1 macrofaag-achtige cellen, monocyten of amoeben in combinatie met andere schimmelstammen de verschillen die kunnen optreden bestuderen. We raden via een objectieve 10X omdat onze experimenten vereisen gegevensverzameling van een grote hoeveelheid cellen echter kan men een hogere aanduidingdoelstelling om maar een paar cellen te bestuderen. De timing elk beeld wordt genomen, kunnen worden aangepast. Inname van een afbeelding om de 4 min voor 24 uur levert een film die ongeveer 1 minuut loopt in de lengte als alle frames zijn gecomprimeerd. Vergroting hetzij aspect (de duur van infectie of de tijd tussen frames) verhoogt de hoeveelheid bestanden die moeten worden opgeslagen dat een probleem voor sommige laboratoria zijn.
Niet-lytische exocytose is een ongelooflijk dynamisch proces dat snel en op verschillende tijdsintervallen optreedt tijdens infectie. Daarom proberen om macrofagen ondergaat deze interactie met andere methoden, zoals transmissie en scanning elektronenmicroscopie vangen kan zijn uiterst zeldzaam. Vanwege de aard van hoe monsters worden gefixeerd en verwerkt, kan men niet zeker dat die worden weergegeven definitief non-lytische exocytose versus andere cellulaire processen zoals lysis of apoptose. Ook een kenmerk van niet-lytische exocytose is dat gastheer en ziekteverwekker via blijven ble achteraf dat is iets dat niet kan worden afgeleid uit vaste beelden, omdat deze methoden alleen kunnen produceren snapshots van een proces op een gegeven moment.
Hoewel dit protocol talloze afbeeldingen cellulaire processen verschaffen, enkele beperkingen in deze techniek gastheer pathogeen interacties te bestuderen. De lage doel gebruiken we een groot aantal macrofagen tegelijkertijd niet mogelijk voor het een voldoende resolutie om de interactie tussen de phagosome en celmembraan, wat geen goed begrepen aspect van niet-lytische exocytose visualiseren. Als alle opnamen zijn opgeslagen, kan de post analyse van volgende vele macrofagen zijn zeer vervelend en tijdrovend. Macrofagen, zelfs die gehandeld op grond van glas, kan zeer beweeglijk zijn en zal zeer snel in en uit het kader te verplaatsen. Dit kan het moeilijk maken om individuele macrofagen van begin tot eind, met name degenen die in de buurt van de rand van het frame te volgen.
jove_content "> Ondanks deze beperkingen is dit protocol kunnen worden gebruikt in een verscheidenheid van manieren om de verschillende aspecten van gastheer-pathogeen interacties te bestuderen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat we geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd mede ondersteund door NIH awards 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
- Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
- Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
- Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
- Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
- Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
- Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).
