Summary
Nós descrevemos como visualizar macrófago C. neoformans (Cn) interações em tempo real, com especial ênfase para o processo de exocitose não-lítica usando microscopia de luz digital. Usando esta técnica individualmente macrófagos infectados podem ser estudados para determinar os vários aspectos deste fenómeno.
Abstract
Muitos aspectos da infecção de macrófagos por Cryptococcus neoformans têm sido extensivamente estudada e bem definido. No entanto, uma interação especial, que não é claramente compreendido é exocitose não-lítico. Neste processo, as células de levedura são libertadas para o espaço extracelular através de um mecanismo mal entendido que deixa ambos os macrófagos e Cn viável. Aqui, nós descrevemos a seguir como um grande número de macrófagos infectados individualmente por um período de 24 horas de infecção por microscopia de tempo decorrido. Macrófagos infectados estão alojados numa câmara de aquecimento, com uma atmosfera de CO 2 ligado a um microscópio que fornece as mesmas condições que uma incubadora de cultura de células. Microscopia digital ao vivo pode fornecer informações sobre as interações dinâmicas entre um hospedeiro e patógeno que não está disponível a partir de imagens estáticas. Ser capaz de visualizar cada célula infectada pode fornecer pistas de como macrófagos lidar com infecções fúngicas, e vice-versa. Esta técnica isa ferramenta poderosa para estudar as dinâmicas que estão por trás de um fenômeno complexo.
Introduction
As fases de uma infecção fúngica entre células criptocócica e macrófagos são bem documentados 1-3. Após as células de levedura são ingeridos pelos macrófagos, uma grande variedade de interacções podem ocorrer: o macrófago pode lisar a libertar a sua carga de fungos para o espaço extracelular, ou pode controlar a infecção, mantendo as células de levedura dentro dos limites da sua membrana celular 4. No entanto, há vários anos, um novo resultado foi descrito de forma independente por dois grupos: exocitose não-lítico, um processo em que um macrófago expurgado algumas ou todas as células criptocócica para o ambiente circundante ou uma célula vizinha e tanto o hospedeiro e patógeno permanecer viáveis 5 -8. Vários estudos têm tentado compreender os mecanismos moleculares por trás dessa interação, mas que ainda não têm uma compreensão completa sobre o que impulsiona este fenômeno.
A capacidade de capturar imagens em tempo real e posteriormente analisar infectar múltiplased macrófagos permite responder a muitas perguntas sobre as propriedades físicas que cercam exocitose não-lítica em relação ao tempo, a capacidade espacial, mudança na morfologia e até mesmo estresse de macrófagos durante uma infecção fúngica. Ao permitir que as células a serem alojados num ambiente que seja comparável ao de uma incubadora, podemos entrever a natureza dinâmica das interacções celulares de macrófagos-fúngica. Os pesquisadores usaram esta técnica para estudar vários componentes deste processo. O papel do fagossoma neste processo foi feito utilizando a coloração fluorescente aparente e actina agentes de bloqueio 9, enquanto que um outro grupo utilizado este método para mostrar que a exocitose não-lítico foi bloqueada em células que têm tido a LAVAGEM nucleação domínios proteicos suprimido 10. O efeito de sinalização de citoquinas também foi verificado por microscopia em tempo real 11. Este processo não está limitado a C. neoformans como foi também observado com Candida albicans, diferentr patógeno, que tem a capacidade de infectar macrófagos 12. Estes achados são exemplos de como este método pode fornecer uma riqueza de informações para uma área que sabemos tão pouco.
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Protocol
Todo o trabalho animal foi feito de acordo com as normas e diretrizes do Instituto de Estudos de Animais no Albert Einstein College of Medicine.
1. Crescimento Condições de C. neoformans H99 (sorotipo A)
- Crescer indivíduo C. neoformans (Cn) colônias em placas de ágar Sabouraud.
- Um dia antes do experimento, selecione uma colônia e inocular 10 ml de caldo Sabouraud.
- Permitir que a cultura a crescer durante a noite a 37 ° C com agitação a uma velocidade de 250 rpm.
2 Isolamento e Preparação de primário macrófagos Osso de C57 / Bl6 Ratos
- Eutanásia ratos colocando animal numa câmara de CO 2 até não mais respiração. Como segunda medida, cervicalmente deslocar o pescoço antes de começar a dissecção. Esterilizar todo o corpo com álcool etílico a 70%.
- Remova os dois fêmures e tíbia e os ossos no lugar estéril DMEM.
- Retire o excesso de tecido e músculo usando delicate limpa até os ossos estão completamente limpos.
- Coloque os ossos intactos apenas em uma placa de Petri contendo álcool etílico a 70% e incubar por 3 min para matar microorganismos associados. Retirar os ossos e lugar em placa de Petri com DMEM estéril.
- Corte cuidadosamente extremidades dos ossos. Segurar osso sobre uma vazios tubo de 50 ml colocados em gelo e cuidadosamente descarga 10 ml de DMEM frio usando uma agulha G 25 através de cada osso.
NOTA: Cada rato irá produzir quatro ossos (2 fêmures, duas tíbias). Portanto, um rato deve produzir aproximadamente 40 ml de suspensão de células. - Centrifugar a suspensão de células à temperatura ambiente durante 10 min a 650 x g.
- Durante esta centrifugação, preparar e esterilizar filtro de macrófagos da medula óssea que consiste em meios de DMEM suplementado com 20% de L929, 10% de soro fetal de vitelo, 10% de NCTC-109, 1% de Pen-Strep, 1% de HEPES, 1% de L-Glutamina alimentação , 1% de aminoácidos não essenciais, 0,1% de 2-mercaptoetanol.
- Ressuspender resultando pellet com 10 ml de alimentação de mídia. Passe suspens celularesião positivo através de um filtro de 70 um da célula para interromper aglomerações de células e remover os detritos grandes.
- Placa 1 ml de suspensão de células para 10 ml de meio de alimentação em placas de Petri, que são especificadas para uso de cultura de tecidos (para um total de 10 placas).
- Permitir que as células aderir a 37 ° C com 10% de CO 2. Adicionar 5 ml de meio de alimentação fresca no dia 3 No dia 7, substituir completamente a mídia de alimentação e macrófagos está pronto para ser usado.
- O dia antes do experimento, retire macrófagos de placa removendo mídia alimentação e adicionar 5 ml de uma célula suave descascar reagente ao prato.
- Incuba-se durante 5-10 minutos a 37 ° C e remover macrófagos com pipetagem suave.
- Células de pelotas por centrifugação a 650 xg durante 10 min.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de alimentação de mídia. Usando uma diluição de 1:20, o cálculo da concentração de macrófagos por pipetagem de 10 ul de suspensão de células para um hemocitómetro.
- Usando 14 milímetros com fundo de vidro placas de Petri, placa Aconcentração de 1 x 10 5 macrófagos diretamente sobre o bem interior, que tem um máximo de 200 l, por isso tome cuidado para não exceder este volume como mostrado na Figura 4.
- Permitir que as células adiram ao prato de Petri de vidro, colocando os pratos em uma incubadora a 37 ° C durante 1 hora.
- Adicionar 1-2 ml de alimentação de meio suplementado com LPS a 1 mg / ml e IFNg em 500 u / ml, e permitir que as células a incubar durante a noite.
3 Co-incubação de macrófagos murino primário e C. neoformans
- No dia da experiência, remover um ml de células e de cultura de sedimento de levedura durante a noite inoculados por centrifugação durante 5 min a 420 x g.
- Lave as células três vezes com PBS estéril para remover a mídia e produtos criptocócicas extracelulares como o glucuronoxylomannan polissacarídeo (GXM) na velocidade e tempo mencionado acima.
- Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS estéril e fazer uma diluição a 1: 100. Pipeta de 10 mL de tele diluição para um hemocitómetro e contar as células. Adicionar células de levedura a uma MOI de 1: 5. Por exemplo, se houver um x 10 5 macrófagos / bem, faça uma suspensão de células de 5 x 10 6 / ml de Cn e adicione 100 ml desta solução para um montante total de 5 x 10 5 Cn.
- Adicionar o volume calculado de suspensão de células criptocócica a 1 ml de meios de alimentação com o anticorpo mAb 18B7 a uma concentração de 10 ug / ml. Incubar suspensão de células à temperatura ambiente durante 5 min.
- Remova a mídia de alimentação de vidro de fundo placa de Petri e lavar 1x com PBS estéril. Adicionar 100 ul de opsonizado Cn directamente a bem.
- Permitir que as células a incubar durante 2 horas a 37 ° C com 10% de CO 2.
- Depois de co-incubação, verifique com o microscópio que os macrófagos internalizaram Cn. Para ser considerado internalizada, as células criptocócicas deve ser visto claramente dentro dos limites do macrófago.
- Lavar 3x prato de Petri com PBS estéril para remover todo e qualquer extracellular Cn.
- Adicionar 1-2 ml de alimentação de mídia sem a adição de mAb 18B7 e configurar microscópio.
Exocitose 4 Visualizando Non-lítica em tempo real Digital Utilizando Microscopia de Luz
NOTA: Para realizar estes experimentos, um microscópio que vem com uma câmara de incubação anexo que inclui CO 2 entrega e uma unidade de aquecimento é necessário.
- Antes da experiência, pré-aquecer a câmara de incubação de, pelo menos, 30 minutos a 37 ° C. Certifique-se de que a unidade de CO 2 lê 5% no início da experiência.
- Lugar com fundo de vidro placa de Petri na plataforma de microscópio, cubra com CO 2 tampa e feche todas as portas para garantir que nenhum calor escapa.
- Usando a objetiva de 10X com o microscópio em contraste de fase, o foco em um campo claro de macrófagos infectados. Com base na experiência, determinar o objectivo usado por quantos macrófagos precisam de ser estudados.
- Configurar o seu software microscópio para take uma imagem a cada 4 minutos, por um período de 24 horas.
- Após 24 horas, o experimento terá atingido a conclusão e um total de 361 imagens terão sido recolhidas. Exportar estas imagens como .jpegs a uma compressão de 5%. Usando o software Image J, ver imagens como uma pilha Visual em 5 quadros por segundo. Se o filme tem que ser visto para publicação ou uma apresentação, salvá-lo como qualquer um avi ou mov arquivo dependendo do formato que funciona melhor para o telespectador.
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Representative Results
As imagens que esta técnica produz podem ser analisados em uma variedade de maneiras de coletar informações em torno do que acontece depois que as células tenham fagocitado C. neoformans. Como pode ser visto na Figura 1, há aproximadamente 100 macrófagos que estão infectados ou não infectados. Cada um desses macrófagos dá ao espectador a oportunidade de estudar interações patógeno-hospedeiro em um nível muito microscópico. Como as Figuras 2 e 3 mostram, existem diferentes resultados que podem ocorrer entre uma célula de levedura e de macrófagos, e mesmo entre macrófagos e macrófagos. Os macrófagos podem ser classificados como sofrendo exocitose não-lítico, de transferência de célula-célula, ou qualquer outro processo celular que pode ocorrer. O tempo de tais eventos durante a infecção também pode ser verificada com base nos parâmetros que são definidos quando o filme estiver sendo gravado.
Figura 1:. Campo de macrófagos infectados Esta figura mostra todo um campo de macrófagos infectados individualmente no início de um período de 24 horas de infecção. Deve notar-se que o campo está livre de Cn extracelular e, mais importante, como é claro que os macrófagos são infectados (como indicado por uma ponta de seta grande) e que não contêm células fúngicas (tal como indicado por uma seta pequena). A barra de escala representa 50 um.
Filme 1 : Visualização de macrófago C. neoformans 24 hr período de infecção. A estrutura inicial do filme mostra a presença de macrófagos em todo o campo, com alguns que não estão infectados e alguns que tenham fagocitado quantidades variadas de células criptocócica. À medida que o filme progride, as células ARe todos os móveis e pode ser visto que se deslocam sobre o campo. Nós somos capazes de acompanhar cada um desses macrófagos para ver que tipo de processo celular se submetem.
Figura 2:. Macrófago murino primário Submetidos não-lítica Exocitose Um macrófago infectado (Painel A, indicado por uma seta branca) é visto passando por estágios iniciais de exocitose não-lítico. O phagosome começa a ampliar (painel BC) e da carga fúngica começa a mudar. Várias células Cn são então libertadas para o espaço extracelular, como pode ser visto na DE painéis. Um segundo macrófagos infectados no painel F, indicado por uma seta branca, também sofrer um evento de exocitose não-lítico (Painel GH). No final do processo, ambos os macrófagos são deixados vazios (painel I), como mostrado pelas setas brancas. A barra de escala representa 25 um.
Filme 2 :. Visualizando primária Murino macrófagos Submetidos não-lítica Exocitose Neste filme, fica claro que as células criptocócicas estão dentro dos limites de um macrófago infectado. O macrófago torna-se agitado e uma célula de levedura pode ser visto brotamento no fagossoma. Criptocócicas células são então rapidamente expurgados no ambiente circundante. A segunda macrófago infectado sofre exocitose não-lítica e mais células de levedura são liberados no espaço extracelular. As células hospedeiras permanecem viáveis após exocitose criptocócica, como indicado pela sua capacidade para continuar a mover-se.
Figura 3:. Murino macrófagos Submetidos a transferência de células-célula primária Outra process que pode ser capturado utilizando este protocolo é a transferência de célula-célula, que ocorre quando as células criptocócica são transferidos de um macrófago de um macrófago vizinha. Dois macrófagos infectados estão em estreita proximidade uns dos outros indicados por pontas de seta brancas (Painel A) e mover-se ainda mais para iniciar a transferência de célula-célula (Painel B). Uma ponte de célula-célula indicado pelas setas vermelhas é formada entre as duas macrófagos de tal modo que as células criptocócica não são expostos ao ambiente circundante durante a transferência (painel C, E). Após a conclusão da transferência, as células romper (Painel D, F). A barra de escala representa 25 um.
Filme 3 :. Visualizando transferência de células-Cell Entre macrófagos infectados Na ocasião, os macrófagos interagem de tal maneira que facilite a transferência de células criptocócica entre células hospedeiras. As células de levedura não são expostospara o meio extracelular e as células hospedeiras permanecem viáveis. Neste filme, dois macrófagos infectados criar pontes célula-célula em duas ocasiões distintas às células criptocócicas transporte de um macrófago para outro.
Figura 4: Diagrama que mostra a preparação de células.
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Discussion
Aqui, descrevemos um método através do qual as interacções macrófagos-fúngicas podem ser registados e analisados em tempo real, ao longo de um período de 24 horas. Nosso laboratório tem usado esse protocolo para estudar muitos dos aspectos temporais da exocitose não-lítica e continuará a usar microscopia em tempo real para determinar os componentes morfológicos que cercam este processo.
Para esta técnica para produzir resultados ideais, deve ser dada especial atenção a determinadas etapas do protocolo. A densidade de células que é revestida na noite anterior é importante porque muitas células pode criar um filme que não é utilizável como a visualização da circulação e interacções de células individuais é impedida, enquanto que muito poucas células podem proporcionar dados que não é significativo. O objectivo é conseguir um campo uniformemente espaçados de macrófagos tais que os macrófagos individuais podem ser seguidas para a duração do período de infecção. Nesse mesmo sentido, lavando o Cn extracelular é um passo crítico como exintracelular Cn vai dividir ao longo do tempo que pode obscurecer o campo e levar a uma perda de visibilidade dos macrófagos. Dependendo da duração do filme, o quadro pode mudar fora de foco, que torna as imagens inutilizáveis para estudar e, portanto, o registro precisa ser verificado em vários pontos durante a infecção.
Como descrito, existem várias maneiras de esta técnica pode ser modificado para caber dentro dos parâmetros de outras experiências. Muitas tintas e marcadores fluorescentes diferentes podem ser usados para destacar e membrana phagosomal dinâmica, mas deve-se ter cuidado de branqueamento foto eo efeito que isso pode ter sobre a aptidão das células. Uma variedade de tipos de células podem também ser utilizados, tais como macrófagos J774.1 como células-, monócitos ou amebas em conjunto com outras estirpes de fungos para estudar a diferença que pode ocorrer. Sugerimos o uso de um objectivo de 10X porque nossos experimentos requerem a coleta de dados de uma grande quantidade de células, no entanto pode-se usar uma maiorobjetivo estudar apenas algumas células. O tempo que cada imagem é feita também pode ser ajustada. Tomando uma imagem a cada 4 minutos, durante 24 horas produz um filme que corre cerca de 1 minuto de duração, quando todos os quadros foram comprimidos. Aumentar ou aspecto (a duração da infecção ou o tempo entre quadros) aumenta a quantidade de arquivos que precisam ser armazenados que podem ser um problema para alguns laboratórios.
Exocitose não-lítico é um processo extremamente dinâmico que ocorre rapidamente e em vários intervalos de tempo durante a infecção. Por isso, tentar capturar os macrófagos submetidos a essa interação com outros métodos, como a microscopia eletrônica de varredura e transmissão pode ser extremamente raro. Devido à natureza de como as amostras são fixados e processados, não se pode ter certeza de que o que está sendo visto é definitivamente exocitose não-líticas versus outros processos celulares, tais como lise ou apoptose. Além disso, uma característica marcante da exocitose não-lítica é que hospedeiro e patógeno permanecer via ble depois que é algo que não pode ser deduzida a partir de imagens fixas uma vez que estes métodos apenas podem produzir instantâneos de um processo num dado momento.
Embora este protocolo pode fornecer inúmeras imagens de processos celulares, existem algumas limitações no uso desta técnica para estudar interações patógeno hospedeiro. O objectivo baixo que usamos para estudar uma grande quantidade de macrófagos ao mesmo tempo não permite que uma imagem de alta resolução suficiente para a visualização da interacção entre o fagossoma e a membrana celular, o que não é um aspecto bem conhecido de exocitose não lítico. Uma vez que todas as imagens foram gravadas, a análise post de seguir muitos macrófagos pode ser muito tedioso e demorado. Os macrófagos, mesmo aqueles que aderiu ao vidro, pode ser muito móveis e irá mover-se para dentro e para fora da moldura muito rapidamente. Isso pode torná-lo difícil de seguir macrófagos individuais do início ao fim, especialmente aqueles que estão perto da periferia do quadro.
jove_content "> Apesar destas limitações, este é o protocolo pode ser usado em uma variedade de maneiras de estudar os diferentes aspectos de interação patógeno-hospedeiro.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não temos concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo NIH prêmios 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
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