Vi beskriver hur du visualisera macrophage- C. neoformans (Cn) interaktioner i realtid, med särskild tonvikt på processen för icke-lytisk exocytos med digital ljusmikroskop. Genom att använda denna teknik för sig infekterade makrofager kan studeras för att utröna olika aspekter av detta fenomen.
Många aspekter av infektion av makrofager från Cryptococcus neoformans har studerats omfattande och väldefinierade. Men en viss interaktion som inte är klart icke-lytisk exocytos. I denna process är jästceller släpps ut i det extracellulära utrymmet genom en dåligt förstådd mekanism som lämnar både makrofag och Cn livskraftig. Här beskriver vi hur man följer ett stort antal individuellt infekterade makrofager för en 24 tim infektionsperioden med tids förföll mikroskopi. Infekterade makrofager är inrymda i en värmekammare med en CO 2 atmosfär fäst vid ett mikroskop som ger samma förhållanden som en cell-odlingsinkubator. Live digital mikroskopi kan ge information om det dynamiska samspelet mellan en värd och patogen som inte är tillgänglig från statiska bilder. Att kunna visualisera varje infekterad cell kan ge ledtrådar till hur makrofager hanterar svampinfektioner, och vice versa. Denna teknik isa kraftfullt verktyg för att studera den dynamik som ligger bakom ett komplext fenomen.
Stegen i en svampinfektion mellan kryptokock celler och makrofager är väldokumenterade 1-3. Efter jästceller intas av makrofager, kan en mängd olika interaktioner inträffa: makrofagen kan lysera släpper sin svamp belastning i det extracellulära utrymmet, eller det kan kontrollera infektionen genom att hålla jästcellerna inom gränserna för dess cellulära membran 4. Men flera år sedan ett nytt utfall beskrevs självständigt av två grupper: icke-lytisk exocytos, en process i vilken en makrofag strukits några eller alla av de kryptokockcellerna in i den omgivande miljön eller en angränsande cell och både värd och patogen förbli livskraftig 5 -8. Flera studier har försökt att förstå de molekylära mekanismerna bakom denna interaktion, men vi har fortfarande inte ett fullt grepp om vad som driver detta fenomen.
Förmågan att ta bilder i realtid och därefter analysera flera infekteraed makrofager gör att man kan svara på många frågor om de fysiska egenskaperna kring icke-lytisk exocytos när det gäller timing, spatial förmåga, förändring i morfologi och även stress av makrofager under en svampinfektion. Genom att låta de celler som skall inrymmas i en miljö som är jämförbar med den i en inkubator, kan vi skymta den dynamiska karaktären hos makrofag-svampcellinteraktioner. Forskare har använt denna teknik för att studera olika komponenterna i denna process. Roll phagosome i denna process gjordes synliga med hjälp av fluorescerande färgning och aktin blockerande medel 9, medan en annan grupp använde denna metod för att visa att icke-lytisk exocytos blockerades i celler som har haft WASH kärnproteindomäner utgår 10. Effekten av cytokin signalering har också påvisas med hjälp realtid mikroskopi 11. Denna process är inte begränsad till C. neoformans som det har också observerats med Candida albicans, another svamppatogen som har förmågan att infektera makrofager 12. Dessa fynd är exempel på hur denna metod kan ge en mängd information till ett område som vi vet så lite om.
Här har vi beskrivit en metod med vilken svamp-makrofag interaktioner kan spelas in och analyseras i realtid under en 24 timmarsperiod. Vårt laboratorium har använt detta protokoll för att studera många av de tidsmässiga aspekter av icke-lytisk exocytos och kommer att fortsätta att använda realtids mikroskopi att fastställa de morfologiska komponenter som omger denna process.
För denna teknik för att ge perfekt resultat, bör särskild uppmärksamhet ägnas åt vissa steg i protok…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds delvis av NIH utmärkelser 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
Fetal Calf Serum ( FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
LPS | Sigma | L3137 | |
Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |