Summary
Vi beskriver hvordan du kan visualisere macrophage- C. neoformans (CN) interaksjoner i sanntid, med spesiell vekt på prosessen med ikke-lytisk eksocytose bruker digital lysmikroskopi. Ved hjelp av denne teknikken individuelt infiserte makrofager kan studeres for å fastslå ulike aspekter av dette fenomenet.
Abstract
Mange aspekter ved infeksjon av makrofager av Cryptococcus neoformans har blitt grundig studert og godt definert. Men en spesiell interaksjon som ikke er klart forstått er ikke-lytisk eksocytose. I denne prosessen, er gjærceller slippes ut i det ekstracellulære rom av en dårlig forstått mekanisme som forlater både makrofag og Cn levedyktige. Her beskriver vi hvordan å følge et stort antall individuelt infiserte makrofager etter en 24-timers periode ved infeksjon av tidsforskjøvede mikroskopi. Infiserte makrofager er plassert i et varmekammer med en atmosfære av CO 2 festet til et mikroskop som gir de samme betingelser som et cellekulturinkubator. Direktesendt digital mikroskopi kan gi informasjon om de dynamiske samspillet mellom vert og patogen som ikke er tilgjengelig fra statiske bilder. Å være i stand til å visualisere hver infisert celle kan gi ledetråder for hvordan makrofager behandle soppinfeksjoner, og vice versa. Denne teknikken jegSA kraftig verktøy i å studere dynamikken som er bak et komplekst fenomen.
Introduction
Stadier av en soppinfeksjon mellom cryptococcal celler og makrofager er godt dokumentert 1-3. Etter at gjærcellene er inntatt av makrofager, kan en rekke interaksjoner oppstår: the macrophage kan lyserer avgi sin sopp belastning inn i det ekstracellulære rom, eller det kan kontrollere infeksjonen ved å holde gjærcellene innenfor rammen av den cellulære membran 4. Imidlertid, for mange år siden en ny utfall ble beskrevet uavhengig av to grupper: ikke-lytisk exocytose, en prosess hvori en makrofag kalles noen eller alle av de cryptococcal cellene inn i det omkringliggende miljø, eller en nærliggende celle, og både vert og patogen forblir levedyktige 5 -8. Flere studier har forsøkt å forstå de molekylære mekanismene bak denne interaksjonen, men vi fortsatt ikke har en full forståelse på hva som driver dette fenomenet.
Muligheten til å ta bilder i sanntid og deretter senere analysere flere infisereed makrofager gjør det mulig å svare på mange spørsmål om de fysiske egenskapene omkringliggende ikke-lytisk eksocytose i forhold til timing, romlig kapasitet, endring i morfologi og selv stresset av makrofager under en soppinfeksjon. Ved å la cellene til å bli plassert i et miljø som er sammenlignbar med en inkubator, kan vi skimte den dynamiske natur makrofag-sopp celle interaksjoner. Forskere har brukt denne teknikken for å studere ulike komponentene i denne prosessen. Rollen til phagosome i denne prosessen ble gjort tydelig ved hjelp av fluorescerende farging og aktin blokkere 9, mens en annen gruppe brukte denne metoden for å vise at ikke-lytisk eksocytose ble blokkert i celler som har hatt vaskekjernedannelses protein domener slettet 10. Effekten av cytokin-signalering er også blitt fastslått ved hjelp av sanntids-11 mikroskopi. Denne prosessen er ikke begrenset til C. neoformans som det har også blitt observert med Candida albicans, another sopp patogen som har evnen til å infisere makrofager 12. Disse funnene er eksempler på hvordan denne metoden kan gi et vell av informasjon til et område vi vet så lite om.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr arbeidet ble gjort i samsvar med forskrifter og retningslinjer fra Institute for Animal studier ved Albert Einstein College of Medicine.
1. Vekstvilkår C. neoformans H99 (serotype A)
- Grow enkelte C. neoformans (CN) kolonier på SABOURAUD agar plater.
- En dag før eksperimentet, velger du en koloni og vaksinere 10 ml Sabouraud buljong.
- Tillat kulturen å vokse over natten ved 37 ° C risting ved en hastighet på 250 rpm.
2. Isolering og Utarbeidelse av primær Bone Makrofager fra C57 / BL6 Mus
- Avlive mus ved å plassere dyret i en CO 2 kammer til det ikke lenger å puste. Som et annet tiltak, cervically forrykke halsen før du begynner disseksjon. Sterilisere hele kroppen med 70% etylalkohol.
- Fjern begge lårben og tibia og plassere bein i sterile DMEM.
- Fjern overflødig vev og muskler ved hjelp av delicate kluter til bein er helt ren.
- Plasser bare intakte bein i en petriskål som inneholder 70% etylalkohol og inkuberes i 3 min å drepe tilhørende mikroorganismer. Fjern bein og sted i petriskål med sterile DMEM.
- Kuttet endene av bein nøye. Hold ben over et tomt 50 ml konisk rør som er lagt på is og forsiktig i flukt 10 ml kald DMEM ved hjelp av en 25 G nål gjennom hvert ben.
MERK: Hver mus vil gi fire bein (to lårben, 2 tibias). Derfor er en mus bør gi omtrent 40 ml av cellesuspensjonen. - Sentrifuger cellesuspensjonen ved romtemperatur i 10 min ved 650 x g.
- I løpet av denne sentrifugering, forberede og filtersteriliser benmargs makrofag Mate materiale som består av DMEM supplert med 20% L929, 10% føtalt kalveserum, 10% NCTC-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-Glutamin , 1% ikke-essensielle aminosyrer, 0,1% 2-mercaptoethanol.
- Resuspender resulterende pellet med 10 ml fôring medier. Passere cellearmerion gjennom en 70 mikrometer celle sil for å forstyrre celle klumper og fjerne store rusk.
- Plate 1 ml av cellesuspensjonen i 10 ml Mate materiale i Petri-skåler som er spesifisert for bruk vevskultur (for totalt 10 plater).
- Tillat celler til å følge ved 37 ° C med 10% CO 2. Tilsett 5 ml friskt foringsmateriale på dag 3. På dag 7, helt erstatte matemedier og makrofager er klar til å bli brukt.
- Dagen før eksperimentet, ta makrofager fra plate ved å fjerne fôring media og tilsett 5 ml av en slakk celle stripping reagens til plate.
- Inkuber i 5 til 10 min ved 37 ° C og fjerne makrofager med forsiktig pipettering.
- Pellet celler ved sentrifugering ved 650 xg i 10 min.
- Resuspender pellet i 1 ml av fôring medier. Ved hjelp av en 1:20 fortynning, beregne konsentrasjonen av makrofager ved å pipettere 10 ul cellesuspensjon til en haemocytometer.
- Ved hjelp av 14 mm glassbunn petriskåler, plate enkonsentrasjon på 1 x 10 5 makrofager direkte på den indre brønn som inneholder et maksimum på 200 mikroliter, slik at ta forsiktighet for ikke å overskride denne mengden, som vist i figur 4.
- Tillat cellene få feste seg til glasspetriskål ved å plassere de retter i en 37 ° C inkubator i 1 time.
- Legg 1-2 ml av mate mediet supplert med LPS ved 1 mg / ml og IFNg ved 500 u / ml og tillate cellene å inkubere over natten.
3. Co-inkubasjon av Primary Murine makrofager og C. neoformans
- På dagen for eksperimentet, fjerne 1 ml av over natten inokulerte kultur og pellet gjærceller ved sentrifugering i 5 min ved 420 x g.
- Vask cellene 3 ganger med steril PBS for å fjerne mediet og ekstracellulære cryptococcal produkter som polysakkarid glucuronoxylomannan (GXM) med den hastighet og tid som er nevnt ovenfor.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml steril PBS og foreta en 1: 100 fortynning. Pipetter 10 mL av than fortynning på en haemocytometer og telle celler. Legg gjærceller ved en MOI på 1: 5. For eksempel, hvis det er en 10 x 5 makrofager / brønn, få en cellesuspensjon av 5 x 10 6 / ml av Cn og tilsett 100 ul av denne løsningen i en total mengde av 5 x 10 5 Cn.
- Legg beregnede volumet av cryptococcal cellesuspensjon til 1 ml av matemedier med mAb 18B7 antistoff ved en konsentrasjon på 10 ug / ml. Inkuber cellesuspensjonen ved romtemperatur i 5 min.
- Fjern Mate materiale fra glassbunn petriskål og vask 1x med sterilt PBS. Tilsett 100 ul av opsonized Cn direkte til godt.
- Tillat celler inkuberes i 2 timer ved 37 ° C med 10% CO 2.
- Etter co-inkubasjon, sjekk av mikroskop som makrofager har internalisert Cn. For å bli vurdert internalisert, bør cryptococcal celler tydelig sees innenfor rammen av makrofager.
- Vask petriskål 3x med sterilt PBS for å fjerne enhver og alle extracellular Cn.
- Legg 1-2 ml fôring media uten tillegg av mAb 18B7, og sette opp mikroskop.
4. visualisering av ikke-lytisk eksocytose i sanntid Utnytte Digital Light Mikros
MERK: For å utføre disse eksperimentene, et mikroskop som kommer med et vedlagt rugende kammer som inneholder CO 2 levering og en varmeenhet er nødvendig.
- Før eksperimentet, pre-inkubering av varme kammer i minst 30 minutter til 37 ° C. Sørg for at CO 2 enhet leser 5% ved starten av forsøket.
- Plasser glassbunn petriskål på mikroskop plattform, dekk med CO 2 lokk, og lukke alle dører for å sikre at ingen varmetap.
- Bruke 10X objektiv med mikroskopet i fase kontrast, fokus på en klar felt av infiserte makrofager. Basert på forsøk, bestemme målet som brukes av hvor mange makrofager må undersøkes.
- Sett opp mikroskop programvare for å take et bilde hvert 4 min for en 24-timers periode.
- Etter 24 timer, blir Eksperimentet har nådd komplettering og totalt 361 bildene vil ha blitt samlet inn. Eksportere disse bildene som .jpegs på et 5% komprimering. Ved hjelp av Image J programvare, vise bilder som en visuell Stack på fem bilder per sekund. Hvis filmen må ses for publisering eller en presentasjon, lagre den som enten en AVI-eller MOV-filen avhengig av hvilket format som fungerer best for betrakteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bildene at denne teknikken produserer kan analyseres på en rekke måter for å samle inn informasjon som omgir hva som skjer etter at cellene har phagocytosed C. neoformans. Som sett i figur 1, er det omtrent 100 makrofager som enten er infisert eller ikke-infisert. Hver og en av disse makrofager gir seeren en mulighet til å studere verts-patogen interaksjoner på en meget mikroskopisk nivå. Som figur 2 og 3 viser, er det ulike utfall som kan oppstå mellom en makrofag og gjærcelle, og selv mellom makrofag-makrofag. Makrofager kan scoret som gjennomgår ikke-lytisk exocytose, celle-celleoverføring, eller en hvilken som helst annen cellulær prosess som kan forekomme. Tidspunktet for slike hendelser under infeksjonen kan også fastslås basert på parametere som er definert når videoopptaket pågår.
Figur 1:. Feltet av infiserte makrofager Denne figuren viser et helt felt av individuelt infiserte makrofager ved starten av en 24 timers periode infeksjon. Det bør bemerkes at banen er fri for ekstracellulær Cn og enda viktigere, hvor det er klart hvilke makrofager er infisert (som indikert ved en stor pilspiss), og som inneholder ingen soppceller (som indikert ved en liten pil). Scale bar representerer 50 mikrometer.
Movie 1 : Visualisering av Macrophage- C. neoformans 24 timer Infeksjon periode. Den første rammen i filmen viser mange makrofager i hele feltet med noen som er infisert, og noen som har phagocytized varierende mengder av cryptococcal celler. Som filmen utvikler seg, cellene are alle bevegelige og kan sees i bevegelse om feltet. Vi er i stand til å følge hvert av disse makrofager for å se hva slags cellulær prosess gjennomgår de.
Figur 2:. Primær Murint Macrophage Gjennomgår Non-lytisk eksocytose En infisert makrofag (panel A, angitt med en hvit pilspiss) er sett under begynnelsen stadier av ikke-lytisk eksocytose. Den phagosome begynner å forstørre (panel f.Kr.) og sopp belastningen begynner å skifte. Flere Cn cellene blir deretter sluppet inn i det ekstracellulære rom, som kan sees i paneler DE. En annen smittet makrofag i Panel F, angitt med en hvit pilspiss, gjennomgår også en ikke-lytisk eksocytose hendelse (Panel GH). Ved slutten av prosessen, blir både makrofager tomt (panel I), som vist med de hvite pilspisser. Scale bar utgjør 25 mikrometer.
Movie 2 :. Visualizing Primær Murine Macrophage Gjennomgår Non-lytisk eksocytose I denne filmen, er det klart at de cryptococcal cellene er innenfor rammen av en infisert makrofag. Den makrofag blir agitert, og en gjærcelle kan sees spirende innenfor phagosome. Cryptococcal cellene blir deretter raskt expunged i det omkringliggende miljøet. En annen smittet makrofag gjennomgår ikke-lytisk eksocytose og flere gjærceller blir sluppet ut i ekstracellulære rom. Vertscellene forblir levedyktig etter cryptococcal exocytose som indikert ved deres evne til å fortsette å bevege seg.
Figur 3:. Primær Murint Macrophage Gjennomgår Cell-Cell Transfer annen process som kan fanges opp med denne protokollen er celle-celle overføring som oppstår når cryptococcal celler er overført fra en makrofag til en nabomakrofager. To-infiserte makrofager er i umiddelbar nærhet til hverandre angitt ved pilspisser hvite (panel A) og bevege enda nærmere initiere celle-celle-overføring (panel B). En celle-celle-bro indikert av de røde pilespisser er dannet mellom de to makrofager slik at cryptococcal cellene ikke er utsatt for omgivelsene under overføringen (panel C, E). Etter at overføringen er fullført, cellene bryte vekk (Panel D, F). Scale bar utgjør 25 mikrometer.
Movie 3 :. Visualisering Cell-Cell Transfer Mellom Infiserte Makrofager Noen ganger vil makrofager samhandle på en slik måte som forenkler overføring av cryptococcal celle mellom vertsceller. Gjærcellene blir ikke utsatttil det ekstracellulære miljø og vertscellene forblir levedyktig. I denne filmen, to infiserte makrofager skape celle-celle broer på to separate anledninger til shuttle cryptococcal celler fra en makrofag til en annen.
Figur 4: viser skjematisk fremstillingen av cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet en metode der sopp-makrofag interaksjoner kan registreres og analyseres i sanntid over en 24 timers periode. Laboratoriet har brukt denne protokollen til å studere mange av de timelige aspekter av ikke-lytisk eksocytose og vil fortsette å bruke sanntid mikroskopi for å fastslå morfologiske komponenter som omgir denne prosessen.
For denne teknikken til å gi ideelle resultater, bør det tas særlig hensyn til visse skritt i protokollen. Celletettheten som er belagt kvelden før er viktig fordi for mange celler kan lage en film som ikke er brukbart som visning av bevegelse og interaksjoner av individuelle celler blir hindret, mens for få celler kan gi data som ikke er signifikant. Målet er å oppnå en jevnt fordelt felt av makrofager slik at de enkelte makrofager kan følges for varigheten av infeksjonen perioden. I den samme ånd, vaske bort den ekstracellulære Cn er et kritisk punkt som extracellular Cn vil dele over tid som kan tilsløre feltet og føre til et tap av synligheten av makrofager. Avhengig av lengden på filmen, kan rammen skifte av fokus som gjør at bildene ubrukelige til å studere og derfor må innspillingen som skal sjekkes på ulike punkter under infeksjonen.
Som beskrevet, er det ulike måter denne teknikken kan modifiseres til å passe innenfor rammen av andre eksperimenter. Mange ulike fluorescerende fargestoffer og markører kan brukes til å markere membran og phagosomal dynamikk, men man bør være forsiktig med fotobleking og påvirke dette kan ha på helsa av cellene. En rekke celletyper kan også benyttes slik som J774.1 makrofag-lignende celler, monocytter eller amøber i forbindelse med andre soppstammer for å studere forskjellene som kan oppstå. Vi foreslår å bruke et mål på 10X fordi våre eksperimenter krever innsamling av data fra et stort antall celler, men man kan bruke en høyeremålsetting å studere bare noen få celler. Tidspunktet for at hvert bilde er tatt kan også justeres. Tar et bilde hver 4 min for 24 timer gir en film som går omtrent ett minutt i lengde når alle rammer har blitt komprimert. Økende enten aspekt (varigheten av infeksjonen eller tiden mellom rammer) øker mengden av filer som behøver å bli lagret som kan være et problem for noen laboratorier.
Ikke-lytisk exocytose er en utrolig dynamisk prosess som skjer raskt, og ved forskjellige tidsintervaller i løpet av infeksjonen. Derfor kan prøve å fange makrofager som gjennomgår en slik interaksjon ved hjelp av andre metoder som for eksempel overføring og scanning elektronmikroskopi være svært sjelden. På grunn av beskaffenheten av hvordan prøvene er faste og behandles, kan man ikke være sikker på at det blir sett er definitivt ikke-lytiske exocytose versus andre cellulære prosesser som lysis eller apoptose. Også, et kjennetegn på ikke-lytisk eksocytose er at vert og patogen forbli via BLE etterpå som er noe som ikke kan utledes fra faste bilde siden disse metodene kan bare produsere øyeblikksbilder av en prosess på et gitt tidspunkt.
Mens denne protokollen kan gi utallige bilder av cellulære prosesser, er det noen begrensninger i å bruke denne teknikken til å studere verts patogen interaksjoner. Den lave målet vi bruker for å studere en stor mengde av makrofager på en gang ikke tillater en høy nok oppløsning til å visualisere interaksjonen mellom phagosome og den cellulære membran, som ikke er godt forstått aspekt av ikke-lytisk exocytose. Når alle bilder er tatt, kan innlegget analyse av følgende mange makrofager være veldig kjedelig og tidkrevende. Makrofager, selv de som er festet til glass, kan være meget bevegelige og vil bevege seg inn og ut av en ramme meget raskt. Dette kan gjøre det vanskelig å følge enkelte makrofager fra start til slutt, spesielt de som er nær periferien av rammen.
jove_content "> Til tross for disse begrensningene, er denne protokollen kan brukes i en rekke måter å studere de mange ulike aspekter av verts-patogen interaksjoner.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at vi har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet delvis av NIH awards 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
- Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
- Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
- Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
- Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
- Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
- Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).
