Summary
Se describe cómo visualizar macrófagos C. neoformans (Cn) interacciones en tiempo real, con especial énfasis en el proceso de exocitosis no lítico usando microscopía de luz digital. Usando esta técnica de forma individual los macrófagos infectados se puede estudiar para determinar varios aspectos de este fenómeno.
Abstract
Muchos aspectos de la infección de macrófagos por Cryptococcus neoformans han sido ampliamente estudiados y bien definido. Sin embargo, una interacción particular que no se entiende claramente es la exocitosis no lítico. En este proceso, las células de levadura se liberan en el espacio extracelular mediante un mecanismo mal entendido que deja tanto el macrófago y Cn viable. Aquí se describe cómo seguir un gran número de macrófagos infectados individualmente para un período de infección 24 h por microscopía de tiempo transcurrido. Macrófagos infectados se encuentran en una cámara de calentamiento con una atmósfera de CO 2 unido a un microscopio que ofrece las mismas condiciones que una incubadora de cultivo celular. Microscopía digital de vivo puede proporcionar información acerca de las interacciones dinámicas entre un huésped y patógeno que no está disponible a partir de imágenes estáticas. Ser capaz de visualizar cada célula infectada puede proporcionar pistas sobre cómo los macrófagos manejan las infecciones por hongos, y viceversa. Esta técnica isa poderosa herramienta en el estudio de las dinámicas que están detrás de un fenómeno complejo.
Introduction
Las fases de una infección por hongos entre las células criptocócica y macrófagos están bien documentados 1-3. Después de células de levadura son ingeridos por macrófagos, una variedad de interacciones pueden ocurrir: el macrófago puede lisar liberando su carga fúngica en el espacio extracelular, o podría controlar la infección por el mantenimiento de las células de levadura dentro de los confines de su membrana celular 4. Sin embargo, hace varios años un nuevo resultado fue descrita independientemente por dos grupos: exocitosis no lítico, un proceso en el que un macrófago borrado algunas o todas de las células criptocócica en el ambiente circundante o una célula vecina y ambos huésped y patógeno se mantienen viables 5 -8. Varios estudios han tratado de comprender los mecanismos moleculares detrás de esta interacción, pero todavía no tienen una comprensión completa de lo que impulsa a este fenómeno.
La capacidad para capturar imágenes en tiempo real y luego analizar posteriormente múltiples Infected macrófagos permite responder a muchas preguntas sobre las propiedades físicas que rodean la exocitosis no lítico en cuanto a tiempo, la capacidad espacial, el cambio en la morfología e incluso el estrés de los macrófagos durante una infección por hongos. Al permitir que las células que se encuentran en un entorno que sea comparable a la de una incubadora, podemos vislumbrar la naturaleza dinámica de las interacciones de células de tipo macrófago por hongos. Los investigadores han utilizado esta técnica para estudiar diversos componentes de este proceso. El papel del fagosoma en este proceso se hizo evidente mediante la tinción de actina fluorescente y agentes de bloqueo 9, mientras que otro grupo utilizó este método para mostrar que la exocitosis no lítico fue bloqueada en las células que han tenido la nucleación WASH dominios de la proteína suprime 10. El efecto de la señalización de citoquinas también ha sido comprobada mediante microscopía en tiempo real 11. Este proceso no se limita a C. neoformans como también se ha observado con Candida albicans, another patógeno fúngico que tiene la capacidad de infectar a los macrófagos 12. Estos hallazgos son ejemplos de cómo este método puede proporcionar una gran cantidad de información a un área que sabemos tan poco.
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Protocol
Todo el trabajo de los animales se realizó de conformidad con los reglamentos y directrices del Instituto de Estudios en animales en el Albert Einstein College of Medicine.
1. Crecimiento Condiciones de C. neoformans H99 (serotipo A)
- Crecer individuo C. neoformans (CN) colonias sobre placas de agar Sabouraud.
- Un día antes del experimento, seleccione una colonia e inocular 10 ml de caldo de Sabouraud.
- Permitir que la cultura de crecer durante la noche a 37 ° C con agitación a una velocidad de 250 rpm.
2 Aislamiento y preparación de Primaria hueso macrófagos de C57 / Bl6 Ratones
- La eutanasia a los ratones mediante la colocación de los animales en una cámara de CO 2 hasta que no la respiración por más tiempo. Como segunda medida, cervical dislocar el cuello antes de comenzar la disección. Esterilizar todo el cuerpo con un 70% de alcohol etílico.
- Retire ambos fémures y los huesos de tibia y colocar en DMEM estéril.
- Retire el exceso de tejido y músculo de usolicate limpia hasta que los huesos están completamente limpias.
- Coloque los huesos intactos sólo en una placa de Petri que contiene 70% de alcohol etílico y se incuba durante 3 min para matar los microorganismos asociados. Quitar los huesos y el lugar en el plato de Petri con DMEM estéril.
- Corte cuidadosamente los extremos de los huesos. Mantenga el hueso largo de un tubo cónico de 50 ml vacías colocado en hielo y enjuague cuidadosamente 10 ml de DMEM frío utilizando una aguja de 25 G a través de cada hueso.
NOTA: Cada ratón producirá 4 huesos (2 fémures, tibias 2). Por lo tanto un ratón debe producir aproximadamente 40 ml de suspensión celular. - Centrifugar la suspensión celular a temperatura ambiente durante 10 min a 650 x g.
- Durante esta centrifugación, preparar y esterilizar por filtración macrófagos de médula ósea alimentación de los medios de comunicación que consiste en DMEM suplementado con 20% L929, 10% de suero de ternera fetal, 10% NCTC-109, 1% de Pen-Strep, 1% HEPES, 1% de L-glutamina , 1% de aminoácidos no esenciales, 0,1% de 2-mercaptoetanol.
- Resuspender el sedimento resultante con 10 ml de la alimentación de los medios de comunicación. Pase suspens celularesiones a través de un colador de 70 micras de células para alterar grupos de células y eliminar los residuos de gran tamaño.
- Placa 1 ml de la suspensión celular en 10 ml de medio de alimentación en placas de Petri que se especifican para el uso de cultivo de tejidos (para un total de 10 placas).
- Permitir que las células se adhieran a 37 ° C con 10% de CO 2. Añadir 5 ml de medio de alimentación fresca en el día 3 En el día 7, reemplazar por completo los medios de alimentación y los macrófagos están listos para ser utilizados.
- El día antes del experimento, separar los macrófagos de la placa mediante la eliminación de los medios de alimentación y añadir 5 ml de una célula suave extracción de reactivos a la placa.
- Incubar durante 5-10 minutos a 37 ° C y retirar los macrófagos con pipeteo suave.
- Precipitar las células por centrifugación a 650 xg durante 10 min.
- Resuspender pellet en 1 ml de la alimentación de los medios de comunicación. Uso de una dilución 1:20, calcular la concentración de los macrófagos pipeteando 10 l de suspensión de células en un hemocitómetro.
- El uso de 14 mm con fondo de cristal cajas de Petri, plato unconcentración de 1 x 10 5 macrófagos directamente sobre el pozo interior que tiene una capacidad máxima de 200 l, así que tome precauciones para no exceder este volumen, como se muestra en la Figura 4.
- Permitir que las células se adhieren a la placa de Petri de vidrio mediante la colocación de los platos en un 37 ° C incubadora durante 1 hr.
- Añadir 1-2 ml de la alimentación de medio suplementado con LPS a 1 mg / ml y IFNg en 500 u / ml y permiten a las células se incuban durante la noche.
3. Co-incubación de primaria murino macrófagos y C. neoformans
- En el día del experimento, eliminar 1 ml de células de cultivo de levadura y pellet inoculados durante la noche por centrifugación durante 5 min a 420 x g.
- Lavar las células 3 veces con PBS estéril para eliminar los medios de comunicación y productos criptocócicas extracelulares como el glucuronoxylomanan polisacárido (GXM) a la velocidad y el tiempo mencionado anteriormente.
- Resuspender sedimento celular en 1 ml de PBS estéril y crea una dilución 1: 100. Pipeta de 10 l de tél dilución en un hemocitómetro y contar las células. Añadir células de levadura a una MOI de 1: 5. Por ejemplo, si hay 1 x 10 5 macrófagos / bien, hacer una suspensión de células de 5 x 10 6 / ml de Cn y añadir 100 ml de esta solución por un importe total de 5 x 10 5 Cn.
- Añadir el volumen calculado de suspensión de células criptocócica a 1 ml de medio de alimentación con el anticuerpo mAb 18B7 a una concentración de 10 mg / ml. Incubar suspensión de células a temperatura ambiente durante 5 min.
- Retire el medio de alimentación de fondo de cristal placa de Petri y se lavan con PBS 1x estéril. Añadir 100 l de opsonizado Cn directamente al bien.
- Permitir que las células se incuban durante 2 horas a 37 ° C con 10% de CO 2.
- Después de co-incubación, comprobar al microscopio que los macrófagos han interiorizado Cn. Para ser considerado interiorizado, células criptocócicas claramente deben ser vistos dentro de los confines de los macrófagos.
- Lave 3x plato de Petri con PBS estéril para eliminar cualquier y toda extracellular Cn.
- Añadir 1-2 ml de la alimentación de los medios de comunicación sin la adición de mAb 18B7, y establecer microscopio.
4. Visualizing no lítico exocitosis en Utilizando microscopía de luz digital en tiempo real
NOTA: Para realizar estos experimentos, un microscopio que viene con una cámara de incubación adjunto que incluye CO 2 y la entrega se requiere una unidad de calentamiento.
- Antes del experimento, pre-calentar la cámara de incubación durante al menos 30 min a 37 ° C. Asegúrese de que la unidad de CO 2 lee 5% al inicio del experimento.
- Lugar con fondo de cristal placa de Petri en la plataforma del microscopio, cubrir con CO 2 tapa y cierre todas las puertas para asegurar que no escapa el calor.
- Usando el objetivo de 10X con el microscopio de contraste de fase en, se centran en un claro campo de macrófagos infectados. Basado en el experimento, determinar el objetivo utilizado por el número de macrófagos que ser estudiados.
- Configure el software de microscopio para take una imagen cada 4 minutos durante un período de 24 horas.
- Después de 24 horas, el experimento habrá llegado a su conclusión y se habrá recogido un total de 361 imágenes. Exportación de estas imágenes como .jpegs a una compresión del 5%. El uso de la imagen J software, ver las imágenes como una pila Visual a los 5 fotogramas por segundo. Si la película tiene que ser vista para su publicación o una presentación, guardarla como tampoco un avi o mov archivo dependiendo del formato funciona mejor para el espectador.
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Representative Results
Las imágenes que esta técnica produce pueden ser analizados en una variedad de maneras de recoger información en torno a lo que sucede después de las células han fagocitado C. neoformans. Como se ve en la Figura 1, hay aproximadamente 100 macrófagos que están infectados o no infectados. Cada uno de estos macrófagos da al espectador la oportunidad de estudiar las interacciones huésped-patógeno en un nivel muy microscópico. Como muestran las figuras 2 y 3 muestran, hay diferentes resultados que pueden ocurrir entre un celular de macrófagos y la levadura, e incluso entre los macrófagos y macrófagos. Los macrófagos pueden ser marcados como sometidos a exocitosis no lítico, la transferencia de célula-célula, o cualquier otro proceso celular que puede ocurrir. El ritmo de estos incidentes durante la infección también se puede determinar en base a los parámetros que se establecen cuando se está grabando la película.
Figura 1:. Campo de macrófagos infectados Esta figura muestra un campo completo de los macrófagos infectados de forma individual al comienzo de un período de infección 24 h. Cabe señalar que el campo está libre de Cn extracelular y, más importante, cómo está claro es que se infectaron macrófagos (como se indica por una gran punta de flecha) y que no contienen células fúngicas (como se indica por una flecha pequeña). La barra de escala representa el 50 micras.
Movie 1 : La visualización de macrófagos C. neoformans 24 Período de Infección hr. El marco inicial de la película muestra muchos macrófagos en todo el campo con algunos que no están infectadas y algunos que han fagocitado cantidades variables de células criptocócica. A medida que la película avanza, las células are toda móviles y se puede ver en movimiento sobre el campo. Somos capaces de seguir cada uno de estos macrófagos para ver qué tipo de proceso celular que se someten.
Figura 2:. Primaria murino macrófagos Someterse no lítico exocitosis Un macrófago infectado (Panel A, indicada por una punta de flecha blanca) se ve sometido a las etapas iniciales de la exocitosis no lítico. El fagosoma comienza a agrandar (panel BC) y la carga fúngica empieza a cambiar. Varias células Cn se liberan en el espacio extracelular como se puede ver en los paneles DE. Un segundo macrófagos infectados en el Panel F, indicada por una punta de flecha blanca, también experimenta un evento exocitosis no lítico (Panel GH). Al final del proceso, tanto los macrófagos se dejan vacíos (Panel I) como se muestra por las flechas blancas. La barra de escala representa el 25 micras.
Película 2 :. Visualización primaria murino macrófagos Someterse no lítico exocitosis En esta película, está claro que las células criptocócica se encuentran dentro de los confines de un macrófago infectado. El macrófago se agita y una célula de levadura puede ser visto en ciernes dentro del fagosoma. Criptocócica células son entonces borrados rápidamente en el medio ambiente circundante. Un segundo macrófagos infectados se somete a la exocitosis no lítico y más células de levadura se liberan en el espacio extracelular. Las células huésped permanecen viables después de la exocitosis criptocócica según lo indicado por su capacidad para continuar en movimiento.
Figura 3:. Primaria murino macrófagos someten a la transferencia de la célula-célula Otro process que puede ser capturado utilizando este protocolo es la transferencia de la célula-célula que se produce cuando las células criptocócica son transferidos de un macrófago a un macrófago vecino. Dos macrófagos infectados están en estrecha proximidad entre sí se indica por puntas de flecha blancas (Panel A) y se mueven aún más cerca de iniciar la transferencia de célula-célula (Panel B). Un puente célula-célula indicada por las flechas rojas se forma entre los dos macrófagos tal que las células criptocócica no están expuestos al medio ambiente circundante durante la transferencia (Panel C, E). Después de la transferencia, las células se separan (Panel D, F). La barra de escala representa el 25 micras.
Película 3 :. Visualización de transferencia de la célula-célula Entre los macrófagos infectados En ocasiones, los macrófagos van a interactuar de una manera tal que facilita la transferencia de células criptocócica entre células huésped. Las células de levadura no están expuestospara el medio ambiente extracelular y las células huésped permanecer viable. En esta película, dos macrófagos infectados crean puentes célula-célula en dos ocasiones a las células criptocócicas conexión desde un macrófago a otro.
Figura 4: esquema que muestra la preparación de las células.
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Discussion
Aquí hemos descrito un método por el cual las interacciones fúngicas macrófagos pueden ser registradas y analizadas en tiempo real durante un período de 24 h. Nuestro laboratorio ha utilizado este protocolo para estudiar muchos de los aspectos temporales de la exocitosis no lítico y seguirá utilizando microscopía en tiempo real para determinar los componentes morfológicos que rodean este proceso.
Para esta técnica para producir resultados ideales, especial atención se debe dar a ciertos pasos en el protocolo. La densidad celular que se plateó la noche anterior es importante porque demasiadas células pueden crear una película que no es utilizable como se ve obstaculizada la visión del movimiento y las interacciones de las células individuales, mientras que muy pocas células pueden producir datos que no es significativo. El objetivo es lograr un campo uniformemente espaciadas de macrófagos tales que los macrófagos individuales pueden seguirse para la duración del período de infección. En ese mismo orden de ideas, lavando la Cn extracelular es un paso crítico como exintracelular Cn dividirá en el tiempo, que podría oscurecer el campo y dar lugar a una pérdida de visibilidad de los macrófagos. Dependiendo de la longitud de la película, el marco puede desplazar fuera de foco que hace que las imágenes no utilizables para estudiar y, por lo tanto, la grabación necesita ser comprobada en varios puntos durante la infección.
Como se ha señalado, existen varias formas de esta técnica puede ser modificado para adaptarse a los parámetros de otros experimentos. Muchos diferentes tintes fluorescentes y marcadores se pueden utilizar para resaltar la dinámica de la membrana y phagosomal pero uno debe tener cuidado con la foto de blanqueo y el efecto que esto puede tener sobre el estado físico de las células. Una variedad de tipos de células también puede ser utilizado como J774.1-como los macrófagos, monocitos o amebas en conjunto con otras cepas de hongos para estudiar las diferencias que puedan ocurrir. Le recomendamos que utilice un objetivo de 10X porque nuestros experimentos requieren la recolección de datos de una gran cantidad de células, sin embargo se podría utilizar una mayorobjetivo de estudiar sólo una pocas células. El momento que se toma cada imagen también se puede ajustar. Tomando una imagen cada 4 minutos durante 24 horas produce una película que corre más o menos 1 minuto de duración, cuando todas las tramas se han comprimido. El aumento de cualquiera de aspecto (la duración de la infección o el tiempo entre fotogramas) aumenta la cantidad de archivos que necesitan ser almacenados que pueden ser un problema para algunos laboratorios.
Exocitosis no lítico es un proceso muy dinámico que se produce rápidamente y en varios intervalos de tiempo durante la infección. Por lo tanto, tratando de capturar macrófagos sometidos a esta interacción usando otros métodos tales como microscopía de transmisión electrónica de barrido y puede ser extremadamente rara. Debido a la naturaleza de la forma en que se fijaron y procesaron las muestras, no se puede estar seguro de que lo que se está viendo es definitivamente exocitosis no líticas frente a otros procesos celulares como la lisis o apoptosis. También, un sello distintivo de la exocitosis no lítico es que anfitrión y el patógeno se mantienen a través de ble después que es algo que no se puede deducir a partir de imágenes fijas, ya que estos métodos sólo pueden producir instantáneas de un proceso en un momento dado.
Si bien este protocolo puede proporcionar innumerables imágenes de procesos celulares, hay algunas limitaciones en el uso de esta técnica para estudiar las interacciones patógeno de acogida. La baja objetivo utilizamos para estudiar una gran cantidad de macrófagos en un tiempo no permite una imagen de resolución lo suficientemente alta como para visualizar la interacción entre el fagosoma y la membrana celular, lo que no es un aspecto bien entendido de exocitosis no lítico. Una vez que se han registrado todas las imágenes, el análisis post siguientes muchos de los macrófagos puede ser muy tedioso y consume mucho tiempo. Los macrófagos, incluso aquellos adherido al vidrio, puede ser muy móviles y se moverá dentro y fuera de la trama muy rápidamente. Esto puede hacer más difícil seguir los macrófagos individuales de principio a fin, especialmente aquellos que están cerca de la periferia del marco.
jove_content "> A pesar de estas limitaciones, este es el protocolo se puede utilizar en una variedad de formas de estudiar los diferentes aspectos de la interacción huésped-patógeno.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tenemos que compiten intereses financieros u otros conflictos de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada en parte por los premios NIH 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
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