Isolation, Kryopræservering og dyrkning af humane amnion epitelceller ved kliniske anvendelser
Summary
We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.
Abstract
Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.
Introduction
Celler afledt af perinatale kilder, såsom moderkagen, placentamembraner, navlestreng og fostervand har tiltrukket opmærksomhed fra forskere og klinikere som en potentiel kilde til celler til regenerativ medicin 1,2. Grunden til denne interesse er, at disse celletyper alle besidder en vis grad af plasticitet og immunmodulerende kapacitet 3, egenskaber, der er afgørende for deres potentielle terapeutiske anvendelser.
hAECs er en heterogen epithelial befolkning, kan udledes sigt eller pre-term amnion membranen 4, giver en rigelig potentiel kilde til regenerativ cellemateriale. De egenskaber, der gør hAECs tiltalende som en cellulær terapi omfatter deres multipotency, lav immunogenicitet, og anti-inflammatoriske egenskaber. hAECs har vist sig at være yderst multipotente både in vitro og in vivo, er i stand til at differentiere til mesodermale slægter (cardiomyocytes, myocytter, osteocytter, adipocytter), endodermale slægter (pancreas celler, leverceller, lunge-celler) og ektodermale slægter (hår, hud, nerveceller og astrocytter) 5-10.
Beroligende, på trods af deres multipotency hAECs ikke synes at enten danne tumorer eller fremme tumorudvikling in vivo. Desuden hAECs er også immune privilegerede, der udtrykker lave niveauer af klasse II humane leukocytantigener (HLAS) 8. Denne egenskab sandsynligvis ligger bag deres evne til at omgå immunafstødning efter allogen og xenogen transplantation, som påvist i undersøgelser under anvendelse af immunkompetente aber, kaniner, marsvin, rotter og svin 11-13. hAECs vise potent immunmodulerende og immunosuppressive egenskaber og kan derfor tilbyde betydelige praktiske fordele for potentielle kliniske anvendelser i autoimmun sygdom terapi. hAECs menes at udøve immunmodulerende funktioner på både medfødte og adaptive immunforsvar. Påe af de mekanismer, som er blevet foreslået, er gennem udskillelsen af immunmodulerende faktorer 14.
Aktuelle anvendelser af hAECs i prækliniske dyremodeller indbefatter behandling af slagtilfælde, dissemineret sklerose, leversygdom, diabetes og kroniske og akutte lungesygdomme. Forskere har vist interesse i at bruge hAECs til behandling efter slagtilfælde hjernebetændelse på grund af deres unikke egenskaber. Der er bevis for, at hAECs kan krydse blod-hjerne barrieren, hvor de kan indpode, overleve i op til 60 dage, differentiere i neuroner, mindske inflammation og fremme regenerering af beskadiget væv fra centralnervesystemet i dyremodeller af neurologiske sygdomme 15.
hAECs tilbyder muligheden for at målrette og vende flere patologiske veje, der bidrager til udvikling og progression af multipel sklerose. For eksempel resultater fra dyreforsøg prækliniske tyder på, at hAECs er stærkt immunosuppressiv ogpotentielt kan inducere perifer immuntolerance og omvendt igangværende inflammatoriske responser. hAECs har også vist sig at have evnen til at differentiere i neurale celler in vivo og øge endogen neuroregeneration gennem sekretion af en bred vifte af neurotrofiske faktorer 16.
Menneskelige og gnaver amnion epitelceller har allerede vist deres terapeutiske virkning til behandling af leversygdom i dyremodeller. I en tetrachlormethan skade induktion model for leversygdom, HAEC transplantation føre til indpodning af levedygtige hAECs i leveren, ledsaget med reduceret hepatocyt apoptose og nedsat hepatisk inflammation og fibrose 17.
hAECs kan stimuleres til udtrykt pancreas faktorer, herunder insulin og glucose transportører. Flere undersøgelser har undersøgt potentialet for hAECs at genoprette blodsukkerniveauet i diabetiske mus 18. I mus, der modtoghAECs faldt begge dyrets kropsvægt og blodsukkerniveauer til normale niveauer efter injektion af celler. Disse undersøgelser er et vægtigt argument for brugen af hAECs til behandling af diabetes mellitus.
hAECs har en dokumenteret rolle i forebyggelse og reparation af eksperimentel akut og kronisk lungeskade i både voksne og neonatale modeller 19. Disse undersøgelser fastslog, at hAECs differentiere in vitro i funktionel lungeepitelceller udtrykker flere lunge-associerede proteiner, herunder cystisk fibrose transmembrane konduktionsregulatorkanaler (CFTR), ion-kanal, der er muteret i patienter med cystisk fibrose 20. Og når hAECs leveres til den skadede voksne og neonatal lunge, de udøver deres reparative virkninger via modulation af værtens immunceller, reducerer pulmonal leukocyt rekruttering, herunder neutrofiler, makrofager og lymfocytter 21-23.
På grund af deres overflod,sikkerhedsniveau, og gennemprøvede kliniske anvendelser for flere sygdomme, kliniske forsøg med hAECs er uundgåelig. Med målet om hurtigere at omsætte HAEC terapier til kliniske-forsøg, har vi udviklet metoder til at isolere, kryopræservere og kultur hAECs på en måde, der er egnet til kliniske forsøg, ved hjælp af animalsk produkt-fri reagenser i overensstemmelse med gældende god fremstillingspraksis (cGMP) retningslinjer .
Vi bygger denne protokol en tidligere offentliggjort protokol, vi brugte med succes at isolere hAECs hjælp animalske reagenser 6. Vi ændrede den oprindelige protokol til at erstatte animalske produkter med animalsk produkt-fri reagenser, og efterfølgende optimering blev udført for at optimere celle udbytte, levedygtighed og renhed. Vores mål var at udvikle en protokol, som ville opfylde lovmæssige standarder for celle fremstilling for humane kliniske forsøg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere kritiske parametre, der kan få væsentlig indflydelse på succesen af denne metode. Opbevaring af placenta eller amnion op til 3 timer før isolering af hAECs kan være ønskeligt for logistiske eller planlægning formål, men det anbefales, at vævet er behandlet så hurtigt som muligt. Hvis væv skal opbevares, anbefales det, at opbevaring udføres efter dissektion og vask af amnion membran. Amnion kan opbevares i sterile HBSS indeholdende antibiotika ved 4 ° C, dog cellelevedygtighed kan falde me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors – Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Protective Apparel | |||
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean(animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 – 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50mL graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10mL graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5mL graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50mL falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15mL falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15-cm petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70-μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22-μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200ul Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G., Appasani, K. . Stem Cells and Regenerative Medicine. 1, 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. . Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , 119-137 (2013).
