Изоляция, криоконсервации и культура клеток человека Амнион Эпителиальные для клинического применения
Summary
We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.
Abstract
Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.
Introduction
Клетки, полученные из перинатальных источников, таких как плаценты, плацентарная мембран, пуповины и околоплодных вод привлекают внимание исследователей и клиницистов в качестве потенциального источника клеток для регенеративной медицины 1,2. Причина этого интереса является то, что эти типы клеток все обладают некоторой степени пластичности и иммуномодулирующим возможности 3, свойств, которые имеют основополагающее значение для их потенциальных терапевтических применений.
hAECs представляют собой гетерогенную эпителиальных населения, которые могут быть получены из термина или досрочного амниона мембраны 4, обеспечивая богатый потенциальный источник регенеративной клеточного материала. Свойства, которые делают hAECs привлекательными как клеточной терапии включают их мультипотентность, низкой иммуногенностью и противовоспалительными свойствами. hAECs Было обнаружено, что весьма мультипотентных как в пробирке и в естественных условиях, способны дифференцироваться в мезодермальных линий (cardiomyocytes, миоциты, остеоцитов, адипоциты), энтодермальные клоны (клеток поджелудочной железы, печени, клетки легких) и эктодермальные линий (волосы, кожа, нервных клеток и астроцитов) 5-10.
Обнадеживает, несмотря на их мультипотентность hAECs, кажется, не ни опухолей форме или способствовать развитию опухоли в естественных условиях. Кроме того, hAECs также иммунопривилегированных, выражая низкие уровни класса II антигенов лейкоцитов человека (HLAs) 8. Это свойство, вероятно лежит в основе их способности уклоняться от иммунного отторжения после аллогенной и ксеногенной трансплантации, как показано в исследованиях с использованием иммунных компетентных обезьян, кроликов, морских свинок, крыс и свиней 11-13. hAECs отображения мощным иммуномодулирующим и иммуносупрессивных свойств и, таким образом, имеют значительные практические преимущества для потенциальных клинических применений в аутоиммунного терапии заболевания. hAECs, как полагают, оказывают иммуномодулирующее функции на врожденных и адаптивных систем застрахован. Нае механизмов, предложенных, через секрецию иммуномодулирующих факторов 14.
Текущие приложения hAECs в моделях доклинических заболеваний животных включают лечение инсульта, рассеянного склероза, болезни печени, сахарный диабет и хронические и острые заболевания легких. Исследователи показали, заинтересованность в использовании hAECs для лечения воспаления мозга после инсульта из-за их уникальных свойств. Существует доказательство того, что hAECs может пересечь гематоэнцефалический барьер, где они могут привить, выживать в течение 60 дней, дифференцируются в нейроны, уменьшают воспаление и способствуют регенерации поврежденных центральной нервной системы ткани на животных моделях неврологических заболеваний 15.
hAECs предлагают возможность предназначаться и обратить вспять несколько патологических путей, которые способствуют развитию и прогрессированию рассеянного склероза. Например, результатом доклинических исследованиях на животных показывают, что hAECs сильно иммуносупрессивной ипотенциально может вызвать периферическую иммунную толерантность и обратного текущие воспалительные реакции. hAECs также было показано, что способность к дифференцировке в нервные клетки в естественных условиях и повышения эндогенного нейрорегенерации через секрецию огромный массив нейротрофических факторов 16.
Клетки эпителия человека и грызунов амниона уже продемонстрировали свою терапевтическую эффективность для лечения заболеваний печени на животных моделях. В четыреххлористого углерода индукции повреждения модели болезни печени, НАЕС трансплантации приводят к приживления жизнеспособных hAECs в печени, сопровождающихся пониженной апоптоза гепатоцитов и снижение печени воспаления и фиброза 17.
hAECs можно стимулировать с выраженными поджелудочной железы факторов, включая инсулина и глюкозы перевозчиков. Несколько исследований изучали потенциал для hAECs по восстановлению уровня глюкозы в крови в диабетических мышей 18. У мышей, получавшихhAECs, оба тела животного вес и уровень глюкозы в крови снизилось до нормальных уровней после инъекции клеток. Эти исследования дают веские основания для использования hAECs для лечения сахарного диабета.
hAECs есть доказанный роль в профилактике и ремонту экспериментальной острой и хронической травмы легких в взрослых и новорожденных моделей 19. Эти исследования показали, что hAECs дифференцировать в пробирке в функциональные легких эпителиальных клеток, экспрессирующих несколько легких ассоциированных белков, включая кистозный фиброз трансмембранной проводимости регулятора (CFTR), ионного канала, который мутировал у пациентов с кистозным фиброзом 20. Кроме того, при hAECs доставляются в поврежденной взрослых и новорожденных легких, они проявляют свое репаративные эффекты с помощью модуляции иммунного клеток, снижение легочной набора лейкоцитов, в том числе нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов 21-23.
Учитывая их численность,показатели безопасности и проверенных клинических приложений для нескольких заболеваний, клинические испытания с использованием hAECs неизбежна. С целью ускорения перевода НАЕС терапии в клиническую-исследований, мы разработали методы, чтобы изолировать, криоконсервируют и культуры hAECs в форме, приемлемой для клинических исследованиях с использованием продуктов без реагентов животных в соответствии с действующим надлежащей производственной практики (цГМФ) руководящих принципов ,
Мы основали этот протокол ранее опубликованная протокол, который мы использовали, чтобы успешно изолировать hAECs с использованием реагентов животного происхождения 6. Мы изменили первоначальный протокол, чтобы заменить продуктов животного происхождения с продуктом без реагентов животных и последующей оптимизации была проведена для оптимизации выхода клеток, жизнеспособности и чистоты. Наша цель в том, чтобы разработать протокол, который будет соответствовать нормативным стандартам для изготовления клеток для клинических испытаний на людях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько важных параметров, которые могут оказать значительное влияние на успех этой методологии. Хранение плаценты или амниона до 3 ч перед выделением hAECs может быть желательно для логистических или планирования целей, однако рекомендуется, чтобы ткань обрабатывают, как можно с…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors – Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Protective Apparel | |||
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean(animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 – 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50mL graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10mL graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5mL graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50mL falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15mL falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15-cm petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70-μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22-μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200ul Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G., Appasani, K. . Stem Cells and Regenerative Medicine. 1, 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. . Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , 119-137 (2013).
