Summary
Burada, biz güçlü bir manyetik an ve güçlü yakın kızılötesi (NIR) absorbanslı manyeto-plasmonik nanopartiküllerin sentezi için bir protokol açıklar. Protokol moleküler özgü hedeflenmesini gerektiren çeşitli biyomedikal uygulamalar için Fc kısmının yoluyla nanopartiküllere antikor konjugasyonu içerir.
Abstract
Tek bir nanopartikül kombine manyetik özellikleri ve plasmonik kontrast yeni manyetomotif Görüntüleme yöntemleri iyileştirme, eşzamanlı yakalama ve (kapalı zaman eğrilerinin) dolaşan tümör hücrelerinin saptanması, ve bir foto termal tedavi ile birlikte çok modlu, moleküler görüntüleme de dahil olmak üzere biyomedikal uygulamalarda bir dizi avantaj sağlayan bir sinerji sağlar Kanser hücrelerinin. Bu uygulamalar yakın kızılötesi (NIR) bölgesinde optik absorbans ve güçlü bir manyetik moment ile manyeto-plasmonik nanopartiküllerin sentezi için protokollerin gelişmesinde önemli ilgi canlandırmıştır. Burada, bir yağ-içinde-su mikroemülsiyonu metoduna dayanır Bu tür melez nanopartiküllerin sentezi için yeni bir protokol mevcut. Bu tarifnamede tarif edilen protokol benzersiz özelliği de manyeto-plasmonik özelliklere sahip olan birincil blokları çeşitli boyutlarda manyeto plasmonik nanopartiküllerin sentezi. Bu yaklaşım, yüksek den olan nanopartiküller verireşit nanopartikül hacmi boyunca dağıtıldığı ve manyetik plasmonik işlevselliklerinin lu. Hibrid nanopartiküller kolayca hedefleme için uygun antijen bağlanması için sorumlu olan Fab kısmındaki çıkış Fc kısmı ile antikor bağlanması ile işlevselleştirilebilir.
Introduction
Farklı fizikokimyasal özelliklere sahip farklı malzemelerden oluşan hibrid nanopartiküller modlu moleküler görüntüleme, tedavi ve izlenmesinde, yeni tarama ve teşhis deneyleri de dahil olmak üzere 1-3 biyomedikal uygulamalarda yeni fırsatlar açabilir. Bir manyetik alana plazmon rezonans ve yanıt ile ilgili olarak çok güçlü bir ışık saçılması ve emme kesitler sağlar, çünkü tek bir nanopartikül içinde plasmonik ve manyetik özelliklerin kombinasyonu özellikle tercih edilir. Örneğin, manyeto-plasmonik nanopartiküller bir harici elektro 3-5 ile geçici bir sinyal modülasyon uygulanarak işaretli hücrelerin karanlık alan görüntüleme kontrastı arttırmak için kullanılmıştır. Manyeto-foto akustik görüntüleme, manyeto-plasmonik nanopartiküller kontrast ve sinyal-arka sıçan büyük gelişmeler sağlayacak - Daha yakın zamanlarda, benzer bir ilke bir yeni görüntüleme yönteminin geliştirilmesinde uygulanmıştırio 6,7. Ayrıca hibrid nanopartiküller eşzamanlı yakalama ve tam kan ve in vivo 8,9 dolaşan tümör hücrelerinin saptanması için kullanılabilir gösterilmiştir. Ayrıca, manyeto-plasmonik nanopartiküller kanser hücrelerinin 10 fototermal tedavi ile kombine moleküler spesifik optik ve MR görüntülemede kullanılabilir theranostic maddeleri umut vericidir.
Çeşitli yaklaşımlar manyeto-plasmonik nanopartiküllerin sentezi için araştırılmıştır. Dambıl gibi çift fonksiyonlu Au-Fe 3 O 4 nanopartiküller 11 oluşturmak için altın nanopartiküller örneğin, Yu ve ark. Kullanılan ayrışma ve Fe (CO) oksidasyon için 5. Wang ve ark. Termal bozunma yöntemi 12 kullanılarak altın kaplı demir oksit nanopartikul sentezlediler. Diğer bazı yaklaşımlar ag birikimi, ardından manyetik çekirdek nanopartiküller üzerine kaplama polimeri ya da amin fonksiyonel moleküller güvenmekmelez oluşturmak için polimer yüzeyi üzerine eski kabuk parçacıkları 7,13. Buna ek olarak, demir oksit nanopartiküller, elektrostatik etkileşimler ve bir kimyasal reaksiyonun 14,15 ile altın nanoçubuklar bağlanmıştır. Bu yaklaşımlar, manyeto-plasmonik oluşturulan nano verim de, biyomedikal uygulamalar için çok tercih edilir ve bu da, yakın kızılötesi (NIR) pencerede optik abzorbans ya da güçlü bir manyetik an olarak manyetik-plasmonik kombinasyonunun bir ölçüde özellikleri tehlikeye düşürür. Örneğin, halter Au-Fe 3 O 4 nanopartiküller nedeniyle, bu tayf aralığında yüksek doku bulanıklığa in vivo kendi faydalarını sınırlandıran 520 nm 'de bir plazmon rezonans noktası vardır. Ayrıca, mevcut protokoller tarafından üretilen manyetik-plasmonik nanopartiküller ACH olabilir daha önemli ölçüde daha az olduğunu, sadece bir veya az sayıda 11 (10'dan az) 14,15 süperparamanyetik kısımları (örneğin, demir oksit nanopartiküllerinin) ile sınırlıdıryoğun bir şekilde bir nano olarak hedeflenmektedir:. Örneğin, yoğun bir şekilde bir 60 nm çapında küresel nanopartikül bin 6 nm süperparamanyetik nanopartiküllerinin mertebesinde içerebilir. Dolayısıyla melez nanopartiküllerinin manyetik özellikleri geliştirmek için büyük bir yer vardır. Ayrıca, daha önce anlatılan bazı protokoller nispeten karmaşık ve sentez işlemleri sırasında tanecikler arasındaki 14,15 toplanmasını önlemek için dikkatli bir optimizasyon gerektirir.
Burada, güçlü bir manyetik anda mevcut ve teknikte önemli sınırlamaları çözen güçlü NIR absorbans manyeto-plasmonik nanopartiküllerin sentezi için bir protokol açıklar. Sentez içinde yağ-su mikroemülsiyon yöntemi 16 kökeni vardır. Böylece, daha küçük birincil parçacıklar arzu edilen bir boyutta nanopartiküllerinin montaj dayanmaktadır. Bu yaklaşım, altın, demir oksit, ve yarı iletken PRI gibi tek bir malzemeden oluşturulan nano üretmek için kullanılmıştırMary 16 ihtiva etmektedir. Biz son küresel nano içine birincil hibrid parçacıkları montaj, sonra, 6 nm çapında altın kabuk / demir oksit parçacıkları çekirdekli yaparak, tarafından, ilk manyeto-plasmonik nanopartiküllerin sentezi için genişletilmiş ve. Nanoklastırlar sadece bu süperparamanyetik özelliklerini korurken yüksek bir manyetik anda gerçekleştirilmesi gibi kurucu nanopartiküllerinin özelliklerini iyileştirmek izin verir, aynı zamanda bu nedenle örneğin güçlü yeri gibi, kurucu nanopartiküllerden mevcut yeni özellikler, ayrı ayrı oluşturma nano-tanecikleri arasındaki etkileşimlerin yararlanır içine birincil parçacıklar Montaj NIR penceresinde optik absorbans. Bu protokol, manyetik ve plasmonik işlevleri bir yüksek yoğunluklu hibrid nano-tanecikleri elde edilir. Birincil parçacıklar sentezlendiği sonra, yöntem, esas olarak, basit bir tek-kaplı bir reaksiyondur. Genel plazmon rezonans gücü ve manyetik momenti birincil parçacıklar ve, Ther bir dizi belirlenirefore, kolay bir uygulamaya bağlı olarak optimize edilebilir. Ayrıca, moleküler özgü hedeflenmesini gerektiren çeşitli biyomedikal uygulamalar için hibrid antikor nanopartiküller olarak bağlanması için bir prosedür geliştirilmiştir. Antikorlar hedefleme için uygun antijen bağlanması için sorumlu olan Fab kısmındaki çıkış Fc parçası yoluyla bağlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aletler ve Züccaciye Hazırlık
- Yani uygun koruyucu ekipman, laboratuvar önlüğü, atılabilir eldivenler ve göz koruması takın.
- Kondansatöre, yuvarlak dipli bir balon içinde iletişime ve bir termometre ile bir sıcaklık denetimli bir silikon yağı banyosu içinde bırakın. Yağ banyosunda (Şekil 1) altında, bir ısı kaynağı (örneğin, sıcak plaka) koyun. Sıcaklığı daha yüksek 260 ° C ölçme yeteneğine sahip bir termometre kullanarak.
İlköğretim Hibrid 2. sentezi Magneto-plasmonik Nanoparçacıklar
- Manyetik Çekirdek Nanopartiküller Yapımı
- Yuvarlak bir 353.2 mg (1 mmol), demir (III) asetilasetonat, 1 ml (2 mmol), oleik asit, 1 ml (2 mmol) oleilamin, 1.292 gr (5 mmol) 1,2-heksadekanediol ve 10 mi fenil eter ekleyin -Dip şişe.
- Kuvvetli geri akış altında 1 saat boyunca 250-260 ° C'ye kadar Manyetik bir karıştırma-çubuğu ve ısı ile karıştırın. Çözüm soğumasını Sonra, bekleyinKarışımın oda sıcaklığına. Sıcaklık fenil eter kaynamasını önlemek ve kondansatöre yuvarlak dipli bir reaksiyon kabına reaksiyon kanşımının bir ileri atılmasını önlemek için 260 ° C'nin altındaki sıcaklıklarda olduğundan emin olun.
DİKKAT: Reaksiyon karışımı son derece sıcak ve kimyasallar tahrişe neden olabilir. Davlumbaz altında faaliyet ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymelidir. Yağ banyosu için yeterli havalandırmayı sağlayın.
Not: Yağ banyosu manyetik nanopartiküllerin sentezi sırasında, 1 saat süre ile 250-260 ° C sıcaklıkta tutulur. Prensip olarak, bir Pyrex cam tabak, bu amaç için kullanılabilir. Ancak, Pyrex cam için maksimum sürekli sıcaklık satıcı bilgiye göre ºC ~ 260 olduğunu. Bu nedenle, metal kap, daha yüksek bir sıcaklığa dayanabilirler ve birden fazla çalışmalar sırasında uzun süre gibi reaksiyon için daha güvenli bir seçenek sağlar.
- Manyetik çekirdek nanopartiküller üzerine bir altın kabuk çökelmeden
- 411.5 mg (1.1 mmol) altın ace Ekleetilester, 0.25 mi (0.75 mmol) yağ asidi, 1,5 mi (3,0 mmol) oleilamin, yuvarlak dipli bir şişeye 775.3 mg (3 mmol) 1,2-heksadekanediol ve 15 ml fenil eter.
- Adım 2.1 'den manyetik nanopartiküller 5 ml süspansiyon ekleyin. 180 ° C'ye ısıtılır ve reaksiyon karışımı, 1 saat boyunca geri akış altında tutun. Oda sıcaklığına kadar soğuması için çözüm bekleyin.
- 15 dakika boyunca 3250 x g'de santrifüj işlemi ile hibrid birincil nano-tanecikleri çökeltmek için 50 ml etanol ekleyin.
- Banyo sonikatör kullanarak 25 ml heksan içinde süspanse çökelti. Birincil hibrid nano-tanecikleri çökeltmek için 25 ml etanol ile ekleyin. 15 dakika boyunca 3250 x g'de santrifüj ve heksan içinde çökelti tekrar süspansiyon. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
- Bir vakum desikatör O / N çökelen primer karma nano-tanecikleri kurutunuz. Parçacıklar tamamen kuru olduğundan emin olun.
3. Hibrid Magneto-plasmonik nanoklastırlar Sentezi ve Boyut Ayırma
- Bağlı kapaklı 20 ml'lik bir cam şişe içerisinde 3,1-10 ML aşama sodyum dodesil sülfat (2,8 mg / ml) sulu bir çözelti solüsyonu ekleyin. Bir sonraki aşamada önce, iki fazın karıştırılması bilmek damla primer karma nanopartiküller damla süspansiyonu ekleyin.
- 10 dakika boyunca 80 ° C'de bir su banyosunda ısıtarak ve ardından, 2 saat boyunca bir banyo sonikatörü içinde, iki fazlı bir çözelti, sonikasyon. Oda sıcaklığına kadar soğuması için çözüm bekleyin.
- Sonikasyon banyo çalışma seviye çizgisine kadar su doldurun. Sonikasyon banyosunda cam şişeyi ortalayın. Hemen iki faz arasında bir emülsiyon oluşturur. Sonikasyon başlamasından sonra elle, iki fazlı bir çözelti çalkalayın; Bu primer karma nano-tanecikleri içeren bir faz ve alt, sulu faz arasındaki karıştırma kolaylaştırır.
NOT: tha farkında olunsonikatöre t operasyonun 2 saat sonra ısınır.
- Sonikasyon banyo çalışma seviye çizgisine kadar su doldurun. Sonikasyon banyosunda cam şişeyi ortalayın. Hemen iki faz arasında bir emülsiyon oluşturur. Sonikasyon başlamasından sonra elle, iki fazlı bir çözelti çalkalayın; Bu primer karma nano-tanecikleri içeren bir faz ve alt, sulu faz arasındaki karıştırma kolaylaştırır.
- 30 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj melez nanocluster süspansiyonu. Çökelti ve süpernatan iki toplayın. 10 dakika sonikasyon altında 0.1 mM sodyum sitrat çökelti süspanse. Nanoklastırlaar beklenen boyutu çapı ~ 180 nm'dir.
- Yeni bir konik tüp adım 3,3 süpernatant aktarın.
- 30 dakika boyunca 400 x g'de adım 3.4 süspansiyon santrifüj. Çökelti ve süpernatan iki toplayın. 10 dakika sonikasyon altında 0.1 mM sodyum sitrat çökelti süspanse. Nanoklastırlaar beklenen boyutu çapı ~ 130 nm'dir.
- Yeni bir konik tüp adım 3.5 den süpernatant aktarın.
- 30 dakika boyunca 1.500 xg'de adım 3.6 den süspansiyon santrifüj. 10 dakika sonikasyon altında 0.1 mM sodyum sitratta çökelti ve tekrar süspansiyon toplayın. Nanoklastırlaar beklenen boyutu ~ çapı 90 nm'dir.
- Ekle 300 _6, bir UV Vis NIR absorbsiyon spektrumunu ölçme için bir 96-çukurlu mikro levha okuyucusu l nanocluster süspansiyonu. TEM görüntüleme için karbon kaplı bakır ızgara üzerine 10 ul nanocluster süspansiyon bırakın.
Nanoklastırlar karşı monoklonal antikorların 4. Konjügasyon
- 100 uL monoklonal antikor çözeltisi (PBS içinde 1 mg / ml), pH 7.2, örneğin, bir anti-epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) antikorlar ya da anti-epidermal büyüme faktörü reseptörü 1 (EGFR) antikorları hazırlayın.
- 3.9 ml 4 mM HEPES, pH 7.2 adım 4,1 antikor solüsyonu ekleyin. Santrifüj 8 ° C'de 20 dakika boyunca 3250 x g'de 10 K bir MWCO santrifüj filtre ile çözelti. 100 ul son hacim olması için, 4 mM HEPES, pH 7.2 içinde yeniden süspanse antikor.
Not: Bu adım HEPES ile antikor çözeltisi içinde orijinal ortamı değiştirmek için gerçekleştirilir. - Antikor çözeltisi 100 mM NAIO 4-100 ul, 10 ul ekle. Bir al ile reaksiyon şişesine Kapakoda sıcaklığında uminum folyo ve orbital bir karıştırıcı kullanılarak 30 dakika boyunca karıştırın.
- 1x PBS 500 ul ekleyerek reaksiyonu söndürün.
- Adım 4,4 antikor çözeltisine 46,5 mM bağlayıcı çözeltisi, 2 ul (dithiolaromatic PEG6-CONHNH 2) ilave et ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalanır.
- 8 ° C'de 20 dakika boyunca 3250 x g'de 10 K bir MWCO filtre kullanılarak santrifüj solüsyonu filtre. , ~ 1 mg / ml 'lik bir antikor konsantrasyonuna yol açar 100 ul'lik nihai bir hacme kadar 1x PBS içinde yeniden süspanse antikor.
- Oda sıcaklığında 120 dakika boyunca aşama 4.6 (1 mg / mi) 1.0 1 ııl ~ OD 100 ul değiştirilmiş antikorları nanocluster süspansiyon karıştırın.
- 10 3 M, 5 kDa tiol PEG 10 ul eklenir ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sallayın.
- 3 dakika boyunca 830 x g'de santrifüje çözeltisi. Süpernatantı atın ve PBS, pH 7.2 / 5 h kDa PEG w 100 ul% 2 tortu tekrar süspansiyon.
- Antikora konjuge nanoklastırlaar absorbans spektrumunun ölçmek ve karşılaştırmak to çıplak nanoklastırlaar spektrumu Absorbans. Birleştirmeden sonra nanometre kırmızı vardiya birkaç bekliyoruz.
- Nanotanecikler, ve kırmızı-NIR'de OD bir artış ile önemli bir değişiklik gösterdiği agrega halinde, 5 cm x 10 M. -3 tiol PEG konsantrasyonunu arttırmak Ayrıca, 30 dakika için tiol PEG ile inkübasyon süresi artar ve 200 x g santrifüj artışlarla hızını azaltır.
- Kanser hücresi etiketleme testi için, ya da, orta veya 1x PBS (1 mi ~ 10 6 hücre) kanser hücre süspansiyonu aşama 4,9 Antikorun konjuge nano-tanecikleri ekleyin ve 60 dakika için karıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunotargeted manyeto-plasmonik nanoklastırlaar sentezi için bir şema Şekil 2'de gösterilmiştir. İlk olarak, manyetik Fe 3 O 4 demir oksit nanopartiküller ısı ayrıştırma yöntemi yoluyla sentezlendiği. Daha sonra, ince yaklaşık 1 mil altın kabuk termal dekompozisyonu aracılığıyla demir oksit çekirdek partikülleri üzerine çökeltilir. Tohumlar bir yağ-içinde-su mikroemülsiyonu yaklaşımı kullanılarak manyeto-plasmonik nanoyığınlar oluşturmak için birincil yaklaşık 6 mil hibrid nanopartiküller vermektedir. Nanokümeleri moleküler hedeflenmesi için özel monoklonal antikorlar ile fonksiyonalize edilir.
Gibi sentezlenmiş demir oksit nanopartiküllerinin çekirdek büyüklüğü çap olarak ~ 5 nm'dir. Manyetik çekirdek üzerine biriktirilmesinden sonra altın kabuk, birincil demir oksit çekirdek / kabuk altın nanopartikülleri boyutunun arttırılması çapı ~ 6 nm. Altın kabuk ve çökeltilmesinden sonra, kırmızı-mor demir oksit nanopartikülleri için kahverengiden koloidal renk değişiklikleri,Son olarak, ~ 180 nm çapında küresel nanoklastırlar içine birincil partiküllerinin toplanmasından sonra mor-gri bir renk (Şekil 3). UV-VIS tayfının birincil demir oksit çekirdek / kabuk altın nanopartiküllerinin çıplak demir oksit parçacıkları mevcut değildir 530 nm'de (Şekil 4) farklı bir rezonans pik sahip olduğunu göstermektedir. Küme oluşumu üzerine, spektrumu belirgin değiştirir ve güçlü geniş NIR absorbansı (Şekil 4) gösterir.
Nanokümeleri özellikle ilgi biyomoleküllerin hedef için monoklonal antikorlar ile konjüge edilir. Birleşme protokolü nanocluster yüzeyine antikorların Fc bölgesini bağlayan bir -Heterofonksiyonel polietilen glikol (PEG) bir bağlayıcı kullanmaktadır. Bağlayıcının bir ucu oksitlenmiş glikosile edilmiş antikor parçası ile etkileşim içinde olan bir hidrazid parçasına sahiptir. Bağlayıcının diğer ucu nanoklastırlaar altın yüzey için kuvvetli bir çekime sahip bir di-tiol grubunu içermektedir. Demonstrat içinE moleküler hedeflenmesi, bir EGFR pozitif deri kanseri hücre hattı (A-431) ve HER2 pozitif meme kanseri hücre hattı (SK-BR-3) seçtik. Nanokümeleri, sırasıyla, A-431-veya SK-BR-3 kanser hücreleri ile karıştırılmıştır, anti-EGFR ya da bir anti-HER2 antikorları ile işlevselleştirilmiştir. Şekil 5, A-431 ve SK-BR-3, kanser hücreleri üzerinde, parlak turuncu bir renk altın kanser hücreleri üzerindeki alıcıları mukabil nanoklastırlar bağlanmasını spesifik moleküler gösterir. Bunun aksine, hedeflenmeyen PEG'lenmiş nanokümeleri kanser hücreleriyle etkileşim yoktu. Bu sonuçlar, işlevselleştirilmiş nanoklastırlaar moleküler özgüllük göstermektedir.
Şekil 1. birincil demir oksit çekirdek / kabuk altın nanopartiküllerinin sentezi için deney düzeneği. Yuvarlak dipli bir reaksiyon kabı, bir kondansatöre bağlanır. Reaksiyon Bir termometre ile sıcaklık izleme altında bir yağ banyosu içinde gerçekleştirilir.
Şekil 2. şematik immunotargeted manyeto-plasmonik nanoklastırlaar sentezinde önemli adımlar gösteren. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. TEM görüntüleri ve nanopartiküllerin kolloidal süspansiyonlar renk: (Sol) demir oksit çekirdek nanopartiküller; (Orta) altın kaplı demir oksit nanopartiküller; (Sağ) hibrid manyeto-plasmonik nanokümeler. TEM görüntüler için Ölçek çubuğu 50 nm. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52090/52090fig3highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. (A) UV-Vis-NIR demir oksit çekirdek nanopartiküllerin spektrumları (mavi), altın kaplı demir oksit nanopartiküller (yeşil) ve hibrit manyeto-plasmonik nanokümeler (kırmızı). (B) UV-Vis-NIR spektrumları çeşitli boyutları ile hibrid manyeto-plasmonik nanoklastırlaar: 90 nm (mavi), 130 nm (yeşil) ve 180 nm (kırmızı). Tüm spektrumlar spektral profilleri farklılıkları göstermek için maksimum emmesinin bire normalize vardır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. ank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. antikor konjuge manyeto-plasmonik nanoklastırlaar Moleküler özgünlüğü: (Sol) EGFR, EGFR-hedefli nanoklastırlar ile kuluçkaya A-431 cilt kanseri hücrelerini ifade; (Orta), HER2, HER2-hedefli nanoklastırlar ile kuluçkaya SK-BR-3 meme kanseri hücreleri eksprese etmek; Hedefsiz PEGile nanoklastırlar ile kuluçkaya (Sağ) A-431 hücreleri. Hücrelerin sarı-turuncu renkli işlevselleştirilmiş nanoklastırlar başarılı etiketleme belirtir; gri-mavi bir renk hücrelerden bir endojen saçılma karşılık gelir. Görüntüler 20X karanlık alan amaç ve Xe lambası uyarma ile dik bir mikroskop kullanılarak elde edildi. Ölçek çubuğu 10 mikron."_blank> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1. bu görüntü bir dış manyetik alan primer nanopartiküller ya da nanoklastırlar ya etiketli A-431-kanser hücrelerinin bir tepkisini karşılaştırır. EGFR (+) A431 hücrelerinin spesifik hedefleme için, anti-EGFR antikorları ile birleşmiş her iki parçacık türleri. İlk olarak, bir Eppendorf tüpü etiketlenmiş hücre süspansiyonu ile doldurulmuştur. Sonra, bir mıknatıs tüp ve hücrelerin hareket yanına yerleştirildi 10 mm uzakta mıknatıstan yaklaşık görüntülü edildi. Hücreler manyeto-plasmonik nanoklastırlar (çapı 100 nm) ile etiketli - Soldaki film birincil nanopartiküller (çapı 6 nm) ve sağda film ile etiketli hücreleri gösterir. Filmler 20X amacı ile aydınlık alan modunda ters bir mikroskop kullanılarak elde edildi. Ölçek çubuğu 100 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Manyeto-plasmonik nanoklastırlaar başarılı sentezde kritik adımlar çok tek tek dağılmış birincil altın kabuk / demir oksit nano-tanecikleri yapma ve çekirdek nanoklastırlar içine birincil partiküllerinin öz düzeneğini yönlendiren içerir. Birincil parçacıklar ve yüzey aktif maddeler arasında bir mol oranı nanoklastırlaar boyut dağılımına belirlenmesinde önemli bir rol oynar. Birincil nanopartiküllerinin muntazam olmayan boyut dağılımı manyeto-plasmonik nanoklastırlaar montajı sırasında büyük agrega oluşumu olabilir. Buna ek olarak, nanocluster formasyonunun mikro emülsiyon yöntemi amfifilik yüzey aktif dayanır: hidrofobik kuyruk grubu birlikte, birincil nano-tanecikleri tutmak ve hidrofilik baş grupları, bir sulu çözelti içinde stabilize nanoyığınlar. Yüzey aktif maddelerin konsantrasyonu, nanocluster takımını belirler: yüksek yoğunluğu daha nanoklastırlar veya bireysel birincil parçacıklar ve parçacıkların topaklanmasına neden olan bir düşük konsantrasyonu oluşmasına yol açacaktır.
Antikor birleştirmeden sonra ~ 10-15 nm nanokümeleri artar bir hidrodinamik yarıçapı. Çapında bu artış, wel korelasyonNanopartiküllerin yüzeyine Fc kısmı ile bağlı olan bir IgG antikorunun yaklaşık 12 nm boyutta ile ekstrakt edildi. Bu nedenle, hidrodinamik çapı değişimidir protokolünde uygulanan Fc kısmı boyunca antikor konjugasyonu yönlü kimyası ile tutarlıdır. Nanopartiküllerin Zeta potansiyeli birleştirmeden sonra -7,0 mV antikor, konjügasyondan önce -47,6 mV kayar. Üst yüzey yükünün değişimi nanoklastırlar antikor konjügasyon ek delil sağlar.
Bu tarifnamede tarif edilen protokol benzersiz özelliği de manyeto-plasmonik özelliklere sahip olan birincil blokları çeşitli boyutlarda manyeto plasmonik nanopartiküllerin sentezi. Bu yöntem, aynı zamanda, elde edilen nano plasmonik ve manyetik özelliklere gücünü kontrol etmek için basit bir yol sağlar. Buna karşılık, önceki protokollerin plasmonik ve manyetik nanomaterial ikinci bir montajBir madde, diğer bir çökelmesi için bir şablon olarak hizmet temizle; Bu yaklaşımda, bir malzeme hacmi ve elde edilen nano diğer yüzey alır. Literatürde manyeto-plasmonik nanopartiküller önemli ölçüde daha düşük yoğunluk ve bizim protokol 14,15 tarafından yapılan nanoklastırlar kıyasla süperparamanyetik parçacıkların genel miktarda var. Bizim yöntemde manyetik ve plasmonik kısımları düzgün hibrid manyeto-plasmonik nanopartiküllerin hacmi boyunca dağıtılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe R01 EB008101 ve R01 CA103830 tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PYREX 50 ml round bottom boiling flask with short neck & 24/40 [ST] joint | Corning | 4320A-50 | Thermal decomposition reaction |
| PYREX 41 x 300 mm 5-bulb Allihn condenser with 24/40 [ST] outer/inner joints | Corning | 2480-300 | Thermal decomposition reaction |
| Silicone oil | Fisher | S159-500 | Oil bath |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-351 | Heat the reacton with stirring function |
| Thermometer | ThermoWorks | 221-092 | Measure temperature |
| Iron(III) acetylacetonate | Fisher | AC11913-0250 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Oleic acid 99% | Fisher | A195-500 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Gold(III) acetate | Fisher | AA3974206 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Hexane | Fisher | H292-1 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Phenyl ether 99% | Fisher | AC13060-0025 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| 1,2-Hexadecanediol 90% | Sigma | 213748-50G | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Oleylamine 70% | Sigma | O7805-100G | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-100 | Cluster synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma | W302600 | Cluster synthesis |
| Monoclonal anti-EGF receptor antibody | Sigma | E2156 | Cell labeling specificity test |
| Monoclonal anti-HER2 antibody | Sigma | AMAB90627 | Cell labeling specificity test |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | Oxidate Fc region of antibodies |
| Dithiolaromatic PEG6-CONHNH2 | SensoPath Technologies | SPT-0014B | Heterofunctional linker for antibody conjugation to nanoclusters |
| Methoxy-PEG-thiol, 5 k | Creative PEGworks | PLS-604 | Passivate the remaining gold surface after antibody conjugation |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801008 | Protein purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffer |
| PBS, 1x solution | Fisher | BP2438-20 | Buffer |
| UV-Vis spectroscopy | BioTek | Synergy HT | Obtain spectrum |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Separation |
| Transmission Electron Microscope | FEI | TECNAI G2 F20 X-TWIN | Obtain morphology of nanostructures |
| Upright microscope | Leica | DM6000 | Obtain dark-field images |
| Sonicator | Branson | 1510 | Sonication |
| Carbon film 300 mesh grid | EMS | CF300-Cu | TEM imaging |
| 96-well plate | Corning | 09-761-145 | UV-Vis reading plate |
References
- Bigall, N. C., Parak, W. J., Dorfs, D. Fluorescent, magnetic and plasmonic—Hybrid multifunctional colloidal nano objects. Nano Today. 7, 282-296 (2012).
- Gautier, J., Allard-Vannier, E., Herve-Aubert, K., Souce, M., Chourpa, I. Design strategies of hybrid metallic nanoparticles for theragnostic applications. Nanotechnology. 24, 432002 (2013).
- Wei, Q., Wei, A. Optical imaging with dynamic contrast agents. Chemistry. 17, 1080-1091 (2011).
- Aaron, J. S., et al. Increased optical contrast in imaging of epidermal growth factor receptor using magnetically actuated hybrid gold/iron oxide nanoparticles. Optics express. 14, 12930-12943 (2006).
- Song, H. -M., Wei, Q., Ong, Q. K., Wei, A. Plasmon-resonant nanoparticles and nanostars with magnetic cores: synthesis and magnetomotive imaging. ACS nano. 4, 5163-5173 (2010).
- Qu, M., et al.
- Jin, Y., Jia, C., Huang, S. -W., Donnell O&39, M., Gao, X. Multifunctional nanoparticles as coupled contrast agents. Nature communications. 1, 41 (2010).
- Wu, C. -H., et al. Versatile Immunomagnetic Nanocarrier Platform for Capturing Cancer Cells. ACS. 7, 8816-8823 (2013).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature nanotechnology. 4, 855-860 (2009).
- Larson, T. A., Bankson, J., Aaron, J., Sokolov, K. Hybrid plasmonic magnetic nanoparticles as molecular specific agents for MRI/optical imaging and photothermal therapy of cancer cells. Nanotechnology. 18, 325101 (2007).
- Yu, H., et al.
- Wang, L., et al.
- Wang, H., Brandl, D. W., Le, F., Nordlander, P., Halas, N. J. Nanorice: a hybrid plasmonic nanostructure. Nano letters. 6, 827-832 (2006).
- Hu, X., et al. Trapping and Photoacoustic Detection of CTCs at the Single Cell per Milliliter Level with Magneto‐Optical Coupled Nanoparticles. Small. 9, 2046-2052 (2013).
- Truby, R. L., Emelianov, S. Y., Homan, K. A. Ligand-mediated self-assembly of hybrid plasmonic and superparamagnetic nanostructures. Langmuir. 29, 2465-2470 (2013).
- Bai, F., et al. A Versatile Bottom‐up Assembly Approach to Colloidal Spheres from Nanocrystals. Angewandte Chemie International Edition. 46, 6650-6653 (2007).
