Immunology and Infection

網膜色素上皮細胞に貪食アッセイのためにブタまたはウシの感光体外側セグメントの大規模精製

Published: December 12, 2014 doi: 10.3791/52100

Célia Parinot^1,2,3, Quentin Rieu^1,2,3, Jonathan Chatagnon^1,2,3, Silvia C. Finnemann⁴, Emeline F. Nandrot^1,2,3

¹INSERM, U968, ²Sorbonne Universités, UPMC Paris 06, UMR_S 968, Institut de la Vision, ³CNRS, UMR_7210, ⁴Department of Biological Sciences, Center for Cancer, Genetic Diseases and Gene Regulation, Fordham University

Abstract

網膜色素上皮（RPE）細胞は、光受容体の外側セグメント（POS）の過ごし熟成末端断片の食作用の重要な機能の一つの分析は、 インビトロで行うことができる。光伝達機構を含む膜状のディスクのスタックを持つ光受容体の外側セグメントは、連続して網膜にリニューアルされている。使用済みPOSは、RPE細胞によって毎日排除される。齧歯類、ブタ/ウシおよびヒトRPE細胞は、同様に、様々な種からのPOSを認識する。小さな変動を用いた実験の大規模シリーズを実行しやすくするために、POSの大きい株式は、ブタの眼から単離し、そしてアリコートで凍結保存することができる。このプロトコルは、暗所に保存するとき、オレンジ色を表示する光色素の特性を利用しています。暗赤色灯の下では、半分にカットしオープンしたアイカップからバッファに網膜収集されます。網膜細胞懸濁液を均質化し、濾過し、そして連続的なスクロース勾配上にロードされる。 CENの後trifugationは、POSを特徴オレンジ色のグラデーションの上部に分離したバンドに位置している。 POSは、次いで、収集紡糸、洗浄緩衝液で連続的に再懸濁し、計数し、等分している。このようにして得られたPOSは、POSチャレンジ後の種々の時点で食作用アッセイおよびタンパク質活性化、局在、または相互作用の分析のために使用することができる。代替的に、POSは、フルオロフォア、電子。 グラムで標識することができる。、FITC結合POSまたは飲み込みの後続の蛍光定量に等分する前に。他の可能な用途は、酸化的ストレスまたはRPE細胞の老化の影響を研究するためにストレス条件と組み合わせて改変POSまたはPOSチャレンジの使用を含む。

Introduction

網膜では、ビジョンは、脳内の視覚野までの神経細胞との間で伝送することができる信号に変換される前に、オプシンと呼ばれる感光性分子の異性化によって誘発される。これらの分子は、光受容細胞の外節部（PRの）を構成するパンケーキに似た膜状ディスクのスタック内に埋め込まれている。光酸化ストレス、したがって、かなりのレベルまで一定の曝露を受けること、PRは、連続的に潜在的な酸化的損傷を制限するために、それらの外側のセグメントを更新する。光受容体外側セグメントは、隣接する網膜色素上皮（RPE）細胞の頂端微絨毛に密着している。 RPE細胞は、血液網膜関門の外側部分を構成し、このようなメラニン色素、光反応性オプシン成分レチナールの再異性化、栄養素を提供するとgを介して光線を急冷などの光受容体の健康と機能¹に重要である多数のタスクを確実にPR代謝物処分に参加し、要因をrowth。

また、RPE細胞は、POSを過ごしたとそのコンポーネント、哺乳類の網膜^2,3に概日リズムによって調節されている毎日の占領をリサイクルなくす。小屋のPOSのクリアランスは、PRの生存のために絶対に必要である。それが完全に廃止されると、POSの破片が蓄積し、PRSは急速な失明の^4,5の原因と縮退。リズミカルなプロファイルが失われ、一定の活動に置き換えている場合は、PRおよびRPE欠陥が⁶歳に蓄積する。したがって、その機能不全にリンク表現型を理解するために、インビトロでの RPEの食作用の分子の調節を特徴づけるために非常に重要である。興味深いことに、RPE細胞における分子機構は、アポトーシス細胞をクリアするためにマクロファージによって使用されるものと非常に似ており、両方とも、食破片^7-9の露出したホスファチジルセリンの認識に依存している。それでも、RPE細胞およびマクロファージがphを調節マクロファージが遭遇時のアポトーシス細胞の即時撤廃を選ぶようagocytosisは異なって、RPE細胞は、リズミカルに外節との永続的な接触にもかかわらず、一日一度だけPOSを巻き込むながら。これは、まだ完全に理解されていない特定の調節メカニズムを示唆している。

RPEの食機械に関与する分子の多くは、孤立したPOSおよび細胞培養食作用アッセイの使用のおかげで同定または検証されています。 RPE頂端細胞表面に位置alphavbeta5インテグリン受容体は、そのリガンドMFG-E8と連携して、その後MERTKチロシンキナーゼ受容体^13-15を介して内在化されるPOS ^10-12に特異的に結合する。 CD36スカベンジャー受容体は、POS摂取に関与し、その速度^16,17に影響^を与えること^が示されており、POS面¹⁸における酸化リン脂質のセンサーとして機能するかもしれない。内在化は、F-アクチン細胞骨格-尻の動員を必要とするそのようなアネキシン2 ^19、ミオシンII ²⁰とミオシンVIIA ^21,22としてociatedタンパク質。 インビトロでのネイティブまたは酸化POSも乏しい消化酸化さPOS ^23-28の蓄積に連結されたインビボでの RPE細胞の老化の表現型を理解するために利用される。幹細胞由来のRPE細胞の生成は、それらが動物または患者^29,30,27に移植する前に、細胞の機能性を証明するために使用される単離されたPOS用の新しいアプリケーションを開始した。

まず1987年³¹モルデイらによって記載され、ウシPOSの単離のためのプロトコルは、（11- シスレチナールを運ぶ）無漂白レチナール光色素の特徴オレンジ色の外観の観察と連続ショ糖勾配上の網膜ホモジネートの超遠心分離ステップを兼ね備えています。過去10年間に、狂牛病の危険性を最小限にするために取ら予防のためには、ブタの眼の使用がincreasiとなっているngly目立つ。ここで説明するプロトコルは、ブタまたは等分して、長期間保存することができるウシ目からPOSを大量に取得する方法を示します。これは、POS調製及びアッセイ^32,33,21,22当たり多数の動物を使用する必要が齧歯類目からPOSを用意する必要がなくなる。また、蛍光分子を使用して保存前のPOSラベル付けについての詳細は食作用アッセイ^32,10の後、標識POSに比べていくつかのアプリケーションのために簡略化し、比較可能な方法でPOSを定量化し、可視化するために、与えられている。したがって、これらの大型株を実験の多くの異なる種類で再現性と使いやすさを可能にする。

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Protocol

このPOS分離実験は時間がかかり、POSは保存前標識されている場合は、完了するために12時間まで必要な場合があります。プロトコルは、1987年³¹でRSモルデイらによって発表された論文から適応し、1997年¹⁰でSC Finnemannらによって修正されている。

動物は、眼科と視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科（ARVO）計算書の研究のための協会による取り扱った。プロトコルは大学ピエールとマリー·キュリー·パリ06とフォーダム大学施設内動物管理使用委員会から見直し、チャールズ·ダーウィン倫理委員会によって承認された。

1.一般セットアップ

できるだけ早く屠殺した後、新鮮な80新鮮な豚や牛の目を入手して、暗闇の中で冷蔵保管してください。会社が同じように進行するようにプロバイダに指示を与える。このプロトコルは、80の目のために最適化されています。へもっと目を進め、より大きな株式を取得する（ 例えば、160目から）、ソリューション量を倍増し、超遠心分離の2ラウンドを行う。プールのサンプルは、後の収集ステップ（ ステップ2.2.2を参照）。
赤いセーフライトランプ、吸収パッドはベンチに設定し、（ 材料表 ）を拭き取る。廃棄物収集（未使用の眼の部品、ガラス質の...）のために15cmの皿とバイオハザードバッグを準備します。タイトフィットlabcoat、手袋、スリーブプロテクタとゴーグルを着用してください。
注意事項：
1. すべてのソリューションは、すべてのステップの間に冷たいそれらを保つ事前冷やす。できるだけ多くの氷上で冷却目とグラデーションにしてください。
2. 視覚色素と光色素の活性型のオレンジ-ピンク色の損失の光退色を避けるために、超遠心分離後の回収工程まで、可能な限り多くの暗闇の中で目や由来の組織にしてください 。

2.プロトコルアクション

ソリューションや勾配を準備します。
1. 37℃の水浴を用いて完全にタウリンストックを解凍する。
2. ストック溶液（ 表1、ストック溶液）からのすべてのソリューションを準備し、各ソリューションのための磁気攪拌機を使用して他の成分で十分にショ糖を混ぜて。
  1. 20％ショ糖の最終濃度に均質溶液15mlを調製し、20 mMのは、2のMgCl _2、10mMのグルコースおよび5mMのタウリンを酢酸pH7.2のトリス。
  2. （70％スクロースストックを使用して）、25％スクロース、20mMのトリス酢酸pH7.2で、10mMのグルコースおよび5mMのタウリン、最終濃度25％スクロース溶液を調製する。
  3. （ショ糖粉末を使用して）60％のショ糖の最終濃度は60％スクロース溶液を調製し、20mMの酢酸塩pH7.2で、10mMのグルコースおよび5mMのタウリントリス。
  4. 20 mMのトリス酢酸pHは7.2と5 mMのタウリンの最終濃度まで洗浄1溶液を調製する。
  5. ウォッシュ2溶液を準備10％スクロース、20mMのトリス酢酸pH7.2の5 mMのタウリンの最終濃度にした。
  6. 10％スクロース、20mMのリン酸ナトリウムpH7.2の5 mMのタウリンの最終濃度まで洗浄3溶液を調製する。
3. マグネチックスターラー上勾配メーカーを着実にし、60％溶液が挿入される出口に最も近いチャンバー内の攪拌棒を挿入します。適切な鋳造速度を達成するために、チューブの出口に配置されたカットオフP200のピペットチップを使用してください。
4. 予備冷却超遠心チューブに各溶液から12ミリリットルを用いて25％の1（80目のためすなわち、合計6管）60％ショ糖溶液を希釈し、攪拌することにより微妙に線形グラデーションをキャストします。よく徐希釈60％スクロース溶液を撹拌した。速すぎてスムーズにしない溶液を注ぐ、勾配流速を安定。
  注：連続、線形勾配を得るために、右全体勾配のための溶液の表面にピペットチップ開口部を維持formatioN。
5. 勾配が安定化のために約1時間、氷の上に座ってみましょう。ロードされるまで冷やし勾配を保管してください。勾配の破壊を防ぐために、チューブを振らないでください。
組織収集：
1. 暗赤色灯の下での組織を収集します。片手に目を取り、離れて目を保持しながら、カミソリの刃のエッジと正面を突く（飛散を避けるために、 図1）。 2半分（角膜プラス強膜に少なくとも5ミリメートル）に前方眼球をカットするカミソリの刃を使用してください。レンズを取り外し、それは、このように網膜を露出する1指の先端の上に保持できるように裏返しにアイカップを反転。
2. 角度でカミソリの刃を使用して、優しく簡単に取り外しとタペート表面から、ピンクがかった層として現れると視神経乳頭（ 図1）で切断、網膜をこすり。 2×50ミリリットル管氷上で均質化溶液15mlを含む各内のすべての網膜を収集します。
3. 網膜ホモgenization：
  1. 異なる細胞層を破壊PR細胞、断片POSの残りからPOSを破壊し、網膜の懸濁液を均質化するために、2分間手で激しく懸濁液を振る。
  2. 大きな組織片を除去し、清潔な50mlチューブ（ 図1）において、フロースルーを収集するために清潔なガーゼの二重層を通して3回濾過する。収量を最大化するために、非常に厚いという網膜の懸濁液は、静かにそれぞれの濾過後に残った断片化された組織を解放するためにガーゼに押します。
光受容体外側セグメント断片（POS）の分離：
1. 60％ショ糖勾配（ 図1） -各生鮮冷蔵連続25の24ミリリットルを含む超遠心チューブ、チューブあたり7mlの30×6オーバーミリリットルを-優しく6の周囲に、原油網膜の準備を築く。ローターを使用するために、必要に応じて、対向するチューブのバランスをとる。 4℃で50分間の106000×gで超遠心機。吸引（ 図2A）により勾配の上部3分の1で、オレンジ·ピンクバンド上記溶液の大部分を削除します。ビーカーにカットオフP1000の先端でオレンジ - ピンクバンドを収集します。漂白剤（生物学的な廃棄物）を使用して中和した後、残りを捨てる。
2. 氷冷洗浄1溶液の5ボリューム - 〜4で希釈します。必要な数の30ミリリットルチューブに区切ります。 4℃で10分間3000×gで遠心し。注意深く上清を捨てる。
3. 上記で詳述したように10ミリリットル中に再懸濁ペレットを10分間3000×gで2溶液とスピンを洗ってください。 15ミリリットルに再懸濁ペレットは3を洗浄し、10分間3000×gで再びスピン。ウォッシュ2に遠心分離前に必要な管の数を減らし、3ソリューションを洗浄するためにいくつかのペレットからの懸濁液を組み合わせる。
標識なし等分POS：
1. 20mlのDMEM - 10に再懸濁POS。 490μlのDMEM中で事前希釈10μL（1:50）とに長いだけでなく、旋回POSをカウント細胞計数室（ 図2B）。 mL当たりPOS粒子中の収量と濃度を算出する。
  注： - 80ブタの目から8×10 ⁹ POS収率は例えば 、豚/牛や目の大きさの年齢および株にほとんどが異なり、良い準備が5の範囲である。
2. 最終DMEM量を決定（典型的には10〜20ミリリットル）および2.5％スクロースの最終濃度を得るためにスクロースを加える。
3. /ウェル40μlの96ウェル実験用の2ミリリットルの再懸濁ボリュームの所望の大きさの分量を準備し、 例えば、チューブ当たり5×10 ⁷ POS。 RTで2300×gで5分間の1アリコートをスピンし、ペレットサイズを評価する。 POSは二回凍結融解されるべきではない別のアプリケーションボリュームのための様々な分量のサイズを準備します。
4. さらに使用するまで-80℃でのPOSアリコートをフリーズします。
  注：一定量を何ヶ月も安定している。私たちの手では、未標識または標識POSは少なくとも1年間保存することができる。
POS標識および分注 ：
注：我々は、典型的には、食作用アッセイの定量化のためにPOSを標識するためにFITCを使用するが、他の染料は、必要に応じて用いてもよい。
1. 1.4ミリリットルの0.1MのNa ₂ CO ₃のpH 11.5（ 表2、ストック溶液）で2.6ミリリットルの0.1MのNaHCO ₃ pHが8.4を混合することにより、0.1MのNa炭酸緩衝液pH 9.5で2.5 mg / mlの濃度で再懸濁し、1 10mgのFITCバイアル。非再懸濁FITC固形物をペレット化し、最大速度で5分間光とスピンから保護しながら室温で1時間回転させます。
2. ウォッシュ3溶液（またはDMEM）10ml中のPOSペレットを再懸濁し、80目にFITC溶液の2ミリリットルを追加します。 -80℃で凍結残り物FITC保管してください。 RTで少なくとも1.5時間、回転させます。アルミ箔を用いて光から保護する。
3. セクション2.3.4で説明したようにほとんど無料でFITCが上澄みFで見られなくなるまで、その後一度か二度DMEM中で、二回洗浄3溶液を用いて標識POSを洗うraction。 DMEMに再懸濁POSおよび計数及び分注（ セクション2.4）のために、非標識POSのための手順。
実験でPOSを使用する：
1. 解凍RTでPOS、それらが蛍光標識である場合、できるだけ多くの暗所に保管してください。 RTで2300×gで5分間スピン。上清を吸引除去する。
2. 実験によって決定されるように、すぐにアッセイ溶液の適切な容量の懸濁します。 POSチャレンジの異なる時間の場合には、ストアは、数時間の時間点の間暗所でRTにてPOSを再懸濁した。

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Representative Results

線形スクロース勾配超遠心分離の組み合わせは、密度による網膜懸濁液の異なる成分の分離を可能にする。ヘビー大きな網膜破片とRPE細胞は、勾配（ 図2A）の底にまたはその近くに沈む。網膜からライターPOSおよび軽量化、個々の細胞または細胞破片を遠心分離期間の終了により勾配の上半分に到達するために別々のバンドとして移動する。遠心分離工程後まで目、暗所でサンプルを保持することによって、POSを含むバンドは直ちに明るいオレンジ色によって認識することができる。このバンドの幅と強度が勾配品質とチューブ高さ（89ミリメートルの高さが好ましい）に依存します。適切に単離されたときの顕微鏡スライド（ 図2B）で観察された場合、通常、POSは直線状または曲がった、細長く表示されます。顕微鏡上の焦点面に応じて、彼らは暗いまたは光沢のあるのいずれかを表示することができます。そうでない場合resus適切に保留、彼らは塊のままになります。彼らは（下の段落を参照）破損している場合、彼らは少し「ほこり」の背景などはるかに小さい部分を、表示されます。

発生する可能性のある問題は、三つの問題に主に関連している。最初の可能性の問題は、歩留まりの低下にPOSのPRには付着したままにつながる網膜ホモジネートのシェーキング手順が十分に活発でないことである。ロードや過度のチューブは、コレクションの前にいずれかの段階で振とうする前に第2の可能な問題は、不十分な安定時間に貧弱な勾配鋳造または勾配品質の損失にリンクされている。この場合、バンドは、適切に区別することができず、POSは、対応するチューブに回収することができない。 POS膜が崩壊することができ、歩留まりの評価のためにそれらを視覚化する際にわずかなPOS破片を顕微鏡に表示：ソリューションの任意のpHが間違っている場合、最終的に、第三の潜在的な問題が生じる。

精製されたPOSすることができますRPE細胞の食作用機能の研究に関連した多数の異なる用途に使用すること。 RPE細胞は、通常、細胞株または動物モデル^{32,6,12,18-21}から初代培養に使用される。より最近では、IPSCまたはESC様再プログラミングされた幹細胞由来のRPE細胞は^{、29,30,27,34が}使用されてきた。単離されたPOS直接変異RPE細胞の食作用能力を試験するために役立つ、 動作を確認インテグリン及びMFG-E8ノックアウトマウス由来の細胞は、同じ時間でより少ないPOSを貪食するのに対して、 例えば、POSは容易に、野生型マウスからの初代RPE細胞によって貪食される^6,12。 POS食作用の定量は蛍光強度^10,24,15,35または細胞をトリプシン処理^36,27の後、フローサイトメーターを読み取ることができる装置を使用して、顕微鏡画像^6（ 図3A）に手動でFITC標識したPOSを計数することによってのいずれかで行うことができる。より最近では、POS摂取および分解がoに評価されているオプシン^37,38,27をプローブn個のイムノブロット。

生体内では 、POSの取り込みプロセスはナリ^6を同期化された認識/結合が先行として順次発生する。取り込みの異なる相は、適切な実験手順^39を使用して、インビトロで区別することができる。パルスチェイス実験は、温度スイッチを使用して行うことができる。POS結合内在化は^32,40,7を続行し、37℃の温度を必要としながら、20℃で起こる。この区別も同様にPOSを認識し、アポトーシス細胞を除去する分子機構は、RPEの機械⁷と非常に類似しているものでできマクロファージに存在する。 FITC-POSを貪食した後、結合および内在化が細胞^10を固定する前に、トリパンブルーとのプレインキュベーション中に表面に結合したPOSのFITC蛍光を消光することによって別々の試料で定量化することができる。パンブルーで処理した細胞では、唯一のインターンらPOS可視化され、結合されたPOS総POS蛍光カウントから内部POSを減算することによって定量することができる。食作用は、POS攻撃後集めた溶解物を使用して得られたイムノブロット上で評価されると、溶解前にEDTAで同等の治療は、合計のPOS貪食比較^37,38に対して内部用の細胞表面に結合されたPOSの着脱が可能になります。

驚異的な進歩は、貪食機械の同定、精製POSを利用した実験のおかげで行われている。タンパク質の動員は、免疫蛍光共局在アッセイ^{13-15,19-21,37,41（} 図3B）によって評価することができる。タンパク質の動員または活性化は、免疫沈降した後またはリン酸化^{7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41（} 図3C）をチェックすることによって、免疫ブロットで検証することができます。全体的な遺伝子発現の変化に関するよりオープンエンドの研究のPOS挑戦の異なる時間を持っているの後にLSO ^42を実行されて。

単離されたPOSまたRPE細胞によるPOS除去を研究するために使用することができる。実際に、正常な老化の間、および/ またはPOSが適切に消化されていない場合、POS分解産物は、リポフスチン沈着徐々に蓄積し、酸化機構^24,27に起因する病態をもたらすことができる。したがって、光と関連する酸化的損傷の影響を理解することは、RPE細胞^18,26のPOSチャレンジを必要とする場合があります。最後に、通常の²⁷または酸化^25,28 POSが長期間にわたって生体内で発達病理学のメカニズムを理解するために、培養物中のRPE細胞の累積効果を誘導するために使用することができると共に送りを繰り返す。

ブタの目から図1.網膜分離。順番に眼の解剖の異なるステップを示す図面左上を開始し、連続ショ糖勾配上の超遠心分離工程の前に網膜を収集し、均質化する。 60ミリメートル幅の広いブレードは、このように網膜を露出する、指先に裏返し、それを伸ばすことができるようにするために、一方の側に目を順次切断し、他のために使用される。次に、網膜をブレードタペータムから廃棄することによって収集される。プールされた網膜は、その後均質化緩衝液で十分に振盪、ガーゼの二重の層を通って3回濾過し、繊細にリニア25の上に注いだ - 60％ショ糖勾配。

ブタの眼から図2 POS浄化 25上で観察種々の層の（A）写真-網膜ホモジネートを超遠心分離した後、60％ショ糖勾配。オレンジ色のバンドを収集することができるようにPOSに対応している。白の上のバンドが対応非POS関連材料、ならびに近くまたはチューブの底部に移行する大きな破片に。歩留まり評価のための計数セルに明視野顕微鏡で観察されるように単離されたPOSの（B）写真。 POSは（あり、a '、cとd）及び旋回（あり、a'細長いに存在するのa、b、b 'を、d）を形成する。いくつかの細長いPOSはコイル状の四肢（c）を表示することができます。焦点面を変更する場合は、ダークに光沢のあるからPOS出現シフト（そしてa '、b及びb'を比較されたい）。パネルEは、適切に再懸濁し、塊に常駐していないPOSを示している。パネルFが損傷し、使用可能ではありませんされたPOSを示し、唯一の小さな断片が検出可能である。 10ミクロンのスケール。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

イチジクURE 3.精製POSを用いてRPEの食作用の分析（A）共焦点顕微鏡写真及びFITC標識ことをPOS（緑）を示す時間とセル当たりファゴソームの数の定量化を、対応する少ない動作を確認インテグリンから単離されたRPE初代細胞によって貪食されている示されるように、野生型（wt又は^{β5+ / +）}と比較して、対照マウスノックアウト（β5 ^{- / - ）。}核（赤色）が密着結合マーカーZO-1を用いてDAPIおよび細胞間結合（青）を用いて標識した。スケールは、10μmバー。。1539-1545：©Nandrot ら、2004年、もともと実験医学 200（12） のジャーナルに掲載さからの再生。 （B）β5-GFP融合タンパク質（緑色、上部左パネル）、表面αvβ5のインテグリン受容体（赤、右上パネル）およびPOS（青、底部との間の共局在（黄色、マゼンタ、右下のパネル）を示す共焦点顕微鏡写真左パネル）。スケールバーは10μm。。Nandrot ら、2012年からの再生、もともとセル 104（6） の生物学に掲載さ：326から341、©ポートランド初回限定。 （C）イムノブロット（WB）および対応する定量化（quantif。）処理（/）なしで比較または対照細胞（c）における培地のみ（メートル）でチャレンジしたときPOSチャレンジ（POS）のTyr397残基でFAKのリン酸化を増加させることを示すFAK（F）の不活性型を発現する細胞は、示されるように、反応しないいる。もともとEMBOジャーナル 22（16）に掲載さFinnemann、2003年から再生：4143から4154 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Name	Company	Catalog Number	Comments
Specific Material/Equipment
2 Chamber gradient maker			Gradient maker with 30 ml chambers
3 mm diameter silicone tubing			tubing for gradient casting
Small size magnetic stir bar			Stir bar fitting the gradient maker chamber
Red safelight lamp			Inactinic lamp for dissection in the dark
Ultra Clear 25 x 89 cm tubes	Beckman	344058	Ultracentrifugation tubes
PP Oak Ridge tubes	Nalgene	3119-0050	30 ml centrifugation tubes
Optima LE-80K	Beckman Coulter	365668	Ultracentrifuge
SW 32Ti swing rotor	Beckman Coulter	369694	Swing rotor for ultracentrifuge
Avanti J-26 XP	Beckman Coulter	393124	Centrifuge
JA-25.50 rotor	Beckman Coulter	363058	Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge
FITC Isomer I	Life Technologies	F-1906	Fluorescent dye
Other Material/Equipment
Counting chamber (such as Neubauer or Malassez)
Dark ice buckets with lids
Scales
Magnetic stirrer and upholding pole
Refrigated microcentrifuge
37 °C water bath
-80 °C freezer
Consumables
Labcoat			Health and safety
Gloves
Sleeve protectors
Goggles
Absorbent pads
Biohazard trash bags and bins
Weck-Prep blades		Dissection	60 mm/2.25 inch wide razor blades
15 cm plastic dish
Sterile gauze sheets
15 and 50 ml tubes			Common consumables
Microtubes
Aluminum foil