Abstract
Анализ одной из жизненно важных функций пигментного эпителия (РПЭ) клеток, фагоцитоз, проведенных в возрасте дистальных фрагментов наружных сегментов фоторецепторов (POS) могут быть выполнены в пробирке. Наружных сегментов фоторецепторов с магазином мембранных дисков, содержащих фототрансдукции машины постоянно обновляются в сетчатке. Отработанные POS устраняются ежедневно клетках ПЭС. Грызунов, свиней / крупного рогатого скота и клетки ПЭС человека признают POS из различных видов аналогичным образом. Для облегчения выполнения большую серию экспериментов с небольшой изменчивостью, большой запас POS может быть выделен из свиных глаз и хранили в аликвотах замораживали. Этот протокол использует преимущества характеристики фотопигментов, которые отображают оранжевый цвет при хранении в темноте. При слабом красном свете, сетчатки собираются в буфере из открытых наглазниками вырезанных пополам. Сетчатки суспензию клеток гомогенизируют, фильтровали и загружали в непрерывном градиенте сахарозы. После CENtrifugation, POS расположены в дискретной полосы в верхней части градиента, который имеет характерный оранжевый цвет. POS затем собирали, центрифугировали, ресуспендировали последовательно в промывных буферах, подсчитывали и аликвоты. POS, полученные таким образом, могут быть использованы для фагоцитоза анализов и анализа активации протеина, локализации или взаимодействия в различные моменты времени после POS вызов. Кроме того, POS могут быть помечены флуорофорами, адрес. Г., FITC, перед аликвоты для последующего флуоресценции количественного POS связывания или охвате. Другие возможные области применения включают использование модифицированных POS или POS вызов в сочетании с стрессовых условиях изучить влияние окислительного стресса или старения на клетках ПЭС.
Introduction
В сетчатке, зрение вызвано изомеризации фоточувствительных молекул, называемых опсины, прежде чем преобразован в сигнал, который может быть передан между нейронами до визуальных областей мозга. Эти молекулы встраиваются в штабеля мембранных дисков, напоминающих блины, которые составляют наружный сегмент части клетки фоторецепторов (PRS). Подвергаясь постоянным воздействием света, и поэтому значительного уровня окислительного стресса, ОР постоянно обновлять свои наружные сегменты, чтобы ограничить потенциальный ущерб окислительный. Наружных сегментов фоторецепторов находятся в тесном контакте с апикальной микроворсинки соседних пигментного эпителия (РПЭ) клеток. Клетки ПЭС составляют внешнюю часть крови сетчатки барьер и обеспечить многочисленные задачи, которые имеют решающее значение для здоровья и функции 1 фоторецепторов, такие как тушение световые лучи с помощью меланина пигментов, повторное изомеризации фотореакционноспособной опсин компонентов сетчатки глаза, обеспечивая питательными веществами и гrowth факторов, участвующих в распоряжении PR метаболита.
Кроме того, клетки ПЭС устраняют провел POS и перерабатывать их компоненты, ежедневный занятие, которое регулируется циркадного ритма в сетчатке млекопитающих 2,3. Оформление пролитой POS является абсолютно необходимым для выживания PR. Когда он полностью отменены, POS мусору скапливаться и ОР вырождаться приводит к быстрому 4,5 потере зрения. Если ритмическая профиль теряется и заменяется постоянной деятельности, PR и ПЭС при накоплении дефектов с возрастом 6. Таким образом, очень важно, чтобы охарактеризовать молекул рный регулирование НПП фагоцитоза в пробирке, чтобы понять, фенотипы, связанные с ее дисфункции. Интересно, что молекулярные машины в клетках ПЭС очень похож на тот, используемой для очистки макрофагов апоптотических клеток, и оба зависят от признания открытой фосфатидилсерина на фагоцитарную мусора 7-9. Тем не менее, ПЭС клетки и макрофаги регулируют рНagocytosis иначе, как макрофаги выбрать для немедленного устранения апоптоза клеток во время столкновения, а клетки ПЭС ритмично поглотить POS только один раз в день, несмотря на их постоянном контакте с наружным сегментам. Это говорит о том специфические механизмы регуляции, которые еще не полностью изучены.
Многие из молекул, вовлеченных в НПП фагоцитарной техники были идентифицированы или проверены благодаря использованию выделенной POS и клеточных культур фагоцитоза анализов. Рецепторов alphavbeta5 интегрину расположен в НПП поверхности верхней клетки, в координации с его лигандом MFG-E8, специфически связывается с POS 10-12, которые затем интернализованного через MerTK тирозинкиназы рецептора 13-15. Поглотитель рецептора CD36, как было показано участие в приеме POS и влиять на его скорость 16,17, и может служить в качестве датчика окисленных фосфолипидов на поверхности POS 18. Интернационализация нуждается в наем F-актина цитоскелета задницуociated белки, такие как аннексин 2 19, миозина II 20 и миозина VIIA 21,22. Родной или окисляется POS в пробирке также используются для понимания старения фенотипы клеток RPE в естественных условиях, связанных с накоплением плохо усваиваются окисленного POS 23-28. Поколение ПЭС клеток, полученных из стволовых клеток инициировал новое приложение для изолированной POS, которые используются, чтобы доказать, функциональность клеток, прежде чем они пересаживаются на животных или больных 29,30,27.
Впервые описан Molday и коллег в 1987 году 31, протокол для выделения крупного рогатого скота POS сочетает в себе ультрацентрифуги шаг сетчатки гомогенатах непрерывных градиентов сахарозы с соблюдением характерной оранжевой появления небеленой сетчатки фотопигментом (балансовой 11- цис сетчатки). В последние 10 лет в связи с мерами предосторожности, принятых в целях сведения к минимуму риска коровьего бешенства, использование свиных глазах стала increasingly заметным. Протокол, описанный здесь, показывает, как получить большое количество POS из свиной или бычий глаз, которые могут быть аликвоты и хранили в течение длительных периодов времени. Это устраняет необходимость подготовки POS от грызунов глазами, что требует использования большого количества животных в подготовке POS и анализа 32,33,21,22. Кроме того, сведения о POS маркировки перед хранением с использованием флуоресцентных молекул даны, чтобы количественно и визуализировать POS в упрощенном и сопоставимым образом для некоторых приложений по сравнению с маркировки POS после фагоцитоза анализа 32,10. Таким образом, эти большие запасы позволяют воспроизводимости и легкости в использовании во многих различных типах опытов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот эксперимент выделение POS занимает много времени и может потребовать до 12 часов, чтобы закончить, если POS помечены перед хранением. Протокол был адаптирован из статьи, опубликованной в RS Molday и коллег в 1987 году 31 и модифицированного SC Finnemann и коллег в 1997 году 10.
Животные были обработаны по данным Ассоциации по исследованиям в области зрения и офтальмологии (ARVO) Заявление на использовании животных в офтальмологических и Vision Research. Протоколы были рассмотрены и утверждены Чарльз комитета Дарвина этики из Университета Пьера и Марии Кюри-Париж 06 и Комитетом по Уходу за животными и использованию Fordham University мимо.
1. Общие Set Up
- Получить 80 свежие свиные или коровьи глаза, как свежие, как вскоре после убоя, насколько это возможно, и держать их охлаждают в темноте. Дать инструкции для поставщика, так компания продолжает таким же образом. Этот протокол оптимизирован для 80 глаз. Дляпродолжить больше глаз и получить больше запасов (например, от 160 глаз), в два раза количества раствора и выполнять 2 раунда ультрацентрифугированием; позже на этапе сбора образцов бассейн (см шаг 2.2.2).
- Настройка на скамейке красный Safelight лампа, впитывающие прокладки, салфетки (таблица материалы). Подготовка 15 см блюда и биологически опасных сумки для сбора отходов (не использовался глаз детали, стекловидное ...). Носите облегающее labcoat, перчатки, рукав протекторы и очки.
- Меры предосторожности:
- Pre-охлаждать все решения, то держать их холодно в течение всех этапов. Хранить глаза и градиенты охлаждали на льду, насколько это возможно.
- Держите глаза и производные ткани в темноте как можно больше, пока шаг коллекции после центрифугирования, чтобы избежать фотообесцвечивания зрительных пигментов и потери оранжево-розовый цвет активной формы фотопигментов.
2. Действия протокола
- Готовят растворы и градиенты:
- Оттепель таурин акции полностью с использованием водяной бани 37 ° C.
- Подготовка всех решений от маточных растворов (таблица 1, маточные растворы) и тщательно перемешать сахарозы с другими ингредиентами, используя магнитную мешалку для каждого решения.
- Подготовка 15 мл гомогенизации раствора до конечной концентрации 20% сахарозы, 20 мМ трис-ацетат pH 7,2, 2 мМ MgCl 2, 10 мМ глюкозы и 5 мМ таурина.
- Подготовка 25% раствор сахарозы в конечной концентрации 25% сахарозы (с помощью 70% сахарозы в наличии), 20 мМ трис ацетата рН 7,2, 10 мМ глюкозы и 5 мМ таурина.
- Подготовка 60% раствор сахарозы в конечной концентрации 60% сахарозы (с помощью сахарозы порошок), 20 мМ трис-ацетат pH 7,2, 10 мМ глюкозы и 5 мМ таурина.
- Подготовка Промыть 1 раствора до конечной концентрации 20 мМ трис ацетата рН 7,2 и 5 мМ таурина.
- Подготовка промывочного раствора 2до конечной концентрации 10% сахарозы, 20 мМ трис ацетата рН 7,2 и 5 мМ таурина.
- Подготовка промывочного раствора 3 до конечной концентрации 10% сахарозы, 20 мМ фосфата натрия, рН 7,2 и 5 мМ таурина.
- Устойчивый градиента производителя на магнитной мешалкой и вставьте мешалкой в камере ближайшего к выходу, где 60% раствор будет вставлен. Используйте отсечки P200 пипетки наконечник, расположенных на выходе из трубы, чтобы достичь надлежащей скорости литья.
- В ролях линейные градиенты деликатно путем разбавления и перемешивания 60% раствор сахарозы с 25%, используя более 12 мл из каждого раствора (т.е., всего 6 трубок на 80 глаз) в предварительно охлажденные Ультрацентрифуга труб. Перемешать, постепенно-разбавление 60% -ный раствор сахарозы также. Стабилизировать скорость градиентного потока, заливки раствора плавно и не слишком быстро.
Примечание: Для того чтобы получить непрерывную, линейный градиент, держать отверстие пипетки наконечник прямо на поверхности раствора в течение всего градиента формирования кп. - Пусть градиенты сидеть на льду в течение около 1 часа для стабилизации. Держите градиенты охлаждается до нагрузкой. Не трясите трубы, чтобы предотвратить разрушение градиента.
- Коллекция тканей:
- Сбор тканей при тусклом красном свете. Возьмите глаз в одной руке и ткнуть фронт с краю лезвия бритвы, держа глаза от (чтобы избежать разбрызгивания; рис 1). Используйте лезвие, чтобы сократить передней прямиком в 2 половины (роговицы, плюс, по крайней мере 5 мм в склеры). Удалить объектив и окуляр перевернуть наизнанку так, что он может быть проведен в течение оконечности, таким образом, одним пальцем подвергая сетчатку.
- Использование лезвие бритвы под углом, мягко очистить сетчатки, снятие легко и появляется в розовато-слоя, с поверхности тапетума и сократить на головке зрительного нерва (рис 1). Собрать все сетчатки в 2 х 50 мл пробирки каждый из которых содержит 15 мл гомогенизации раствора на льду.
- Retina гомоgenization:
- Взболтать суспензию энергично вручную в течение 2 мин, чтобы нарушить различные слои клеток, сломать POS от остальной части PR-клеток, фрагмент POS и гомогенизации суспензии сетчатки.
- Фильтр 3x через двойной слой чистой марлей для удаления крупных фрагментов ткани и собирать проточные в экологически чистые 50 мл пробирки (рисунок 1). Сетчатки суспензия довольно толстый, чтобы максимизировать выход, слегка нажмите на марлю, чтобы освободить оставшиеся разрозненные тканей после каждой фильтрации.
- Фоторецептора наружный сегмент фрагмент (POS) изоляция:
- Осторожно лежал сырой сетчатки преп, около 6 - 7 мл на пробирку, более 6 х 30 мл пробирки ультрацентрифуг каждый из которых содержит 24 мл свежей охлажденной непрерывной 25 - 60% градиент сахарозы (фиг.1). Баланс противоположные трубы по мере необходимости для ротора, которые будут использоваться. Ультрацентрифуга на 106 000 мкг в течение 50 мин при 4 ° С. Удалить большинство над оранжево-розовый раствор полосы в верхней трети градиента путем аспирации (фиг.2А). Соберите оранжево-розовая полоска с P1000 кончика отсечки в стакан. Откажитесь от отдыха после нейтрализации с помощью отбеливателя (биологических отходов).
- Разбавить ~ 4 - 5 объемов ледяной Wash 1 раствора. Отделить на столько 30 мл пробирки по мере необходимости. Центрифуга при 3000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Осторожно удалите супернатант.
- Ресуспендируйте гранулы в 10 мл промывочного раствора 2 и спина в 3000 мкг в течение 10 мин, как описано выше. Ресуспендируют гранулы в 15 мл Промыть 3 и спин снова в 3000 х г в течение 10 мин. Зерноуборочный суспензии из нескольких таблеток, чтобы уменьшить количество труб, необходимых перед центрифугированием в Ваш 2 и промыть 3 решения.
- POS на аликвоты без маркировки:
- Ресуспендируйте POS в 10 - 20 мл DMEM. Предварительно разведите 10 мкл в 490 мкл DMEM (1:50) и граф удлиненные, а также закрученного POS вПодсчет клеток камеру (2В). Рассчитать доходность и концентрацию в POS частиц на мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: выход колеблется, в зависимости главным образом от возраста и деформации свиней / коров и размера глаз, например, хорошая подготовка колеблется от 5 - 8 х 10 9 POS от 80 свиней глаза. - Принятие решения о конечном объеме DMEM (обычно 10 - 20 мл) и добавляют сахарозу с получением конечной концентрации 2,5% сахарозы.
- Подготовка аликвоты требуемого размера, например, 5 х 10 7 POS на пробирку для ресуспендирования объема 2 мл для эксперимента в 96-луночный в 40 мкл / лунку. Спин 1 аликвоту течение 5 мин при 2300 мкг при комнатной температуре и оценить размер гранул. Подготовка различных размеров аликвоту для различных объемов применения как POS НЕ должна дважды замораживали и оттаивали.
- Замораживание POS аликвот при -80 ° С до дальнейшего использования.
Примечание: аликвоты стабильны в течение многих месяцев. В наших руках, без маркировки или помечены POS может храниться не менее одного года.
- Ресуспендируйте POS в 10 - 20 мл DMEM. Предварительно разведите 10 мкл в 490 мкл DMEM (1:50) и граф удлиненные, а также закрученного POS вПодсчет клеток камеру (2В). Рассчитать доходность и концентрацию в POS частиц на мл.
- Маркировка POS и аликвоты:
Примечание: Обычно мы используем FITC маркировать POS для количественного фагоцитоза анализов, но и другие красители могут быть использованы также в зависимости от потребностей.- Ресуспендируют 1 10 мг FITC флакон на 2,5 мг / мл концентрации в 0,1 М Na-карбонатном буфере рН 9,5 путем смешивания 2,6 мл 0,1 М NaHCO 3 рН 8,4 с 1,4 мл 0,1 М Na 2 CO 3 pH 11,5 (табл 2 исходные растворы). Поворот в течение 1 ч при комнатной температуре при защите от света и спина в течение 5 мин при максимальной скорости для осаждения без ресуспендировали твердые FITC.
- Ресуспендируют POS осадок в 10 мл Wash 3 раствора (или DMEM) и добавить 2 мл раствора FITC на 80 глазах. Хранить остатки FITC замораживали при -80 ° С. Поворот по меньшей мере, 1,5 ч при комнатной температуре. Защищать от света с помощью алюминиевой фольги.
- Промыть надписью POS два раза, используя промывочный 3 раствора, как описано в разделе 2.3.4, то один или два раза в DMEM до почти нет свободного FITC не видно в надосадочной Fraction. Ресуспендируйте POS в DMEM и выполните для немеченым POS для подсчета и аликвоты (раздел 2.4).
- Использование POS в экспериментах:
- Оттепель POS при комнатной температуре, и держать их в темноте, насколько это возможно, если они флуоресцентно-меченых. Спин течение 5 мин при 2300 мкг при комнатной температуре. Аспирата супернатант.
- Сразу ресуспендируют в соответствующем объеме раствора для анализа, как продиктовано эксперимента. В случае разное время POS вызов, магазин ресуспендировали POS при комнатной температуре в темноте между временными точками в течение нескольких часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сочетание линейного градиента сахарозы и ультрацентрифугирования позволяет разделение различных компонентов сетчатки суспензии плотности. Тяжелые больше сетчатки мусора и клетки ПЭС опускаются на или вблизи нижней части градиента (фиг.2А). Зажигалка POS и более легкие отдельные клетки или клеточные обломки сетчатки мигрируют как отдельные полосы для достижения верхнюю половину градиента к концу периода центрифугирования. По держа глаза и образцов в темноте до тех пор, после стадии центрифугирования полосу, содержащую POS можно сразу узнать по ярко-оранжевого цвета. Ширина и интенсивность этой полосы зависит от градиента качества и высоты трубы (89 мм высота Предпочтительно). Как правило, когда изолированный образом POS должны отображаться удлиненные, прямые или изогнутые, когда наблюдается на предметное стекло микроскопа (Фигура 2В). В зависимости от фокальной плоскости на микроскопе, они могут появиться либо темный или блестящей. Если не resusзатрачиваемая должным образом, они будут оставаться в сгустки. Если они повреждены (см параграф ниже), они будут выглядеть как намного меньшие куски, немного похож на "пыльной" фоне.
Проблемы, которые могут возникнуть, в основном связаны с тремя вопросами. Первый возможный вопрос о том, что встряхивания этап сетчатки гомогенатах не энергичным достаточно, что приводит к POS остаются прикрепленными к ОР, таким образом, к снижению урожайности. Вторая возможная проблема, связанная с плохим литья градиента или градиент потери качества нехватки времени стабилизации до погрузки или чрезмерное трубка встряхивании при любом шаге перед собранием. В этом случае, полосы не могут быть должным образом выделены и POS не может быть собрана в соответствующем трубки. Наконец, третья потенциальная проблема возникает, если рН любого из решений является неправильным: POS мембраны может распасться, и только мелкий мусор POS на микроскопе появляется при визуализации их для оценки доходности.
Очищенная POS можетиспользоваться для нескольких различных приложений, связанных с изучением фагоцитарную функцию клетках ПЭС. Клетки ПЭС обычно используется в качестве клеточных линий или в первичной культуре от животных моделях 32,6,12,18-21. Совсем недавно, ПЭС клетки, полученные из перепрограммировать стволовые клетки, как IPSC или ESC были использованы 29,30,27,34. Изолированные POS служат для прямой проверки фагоцитарную способность мутантных клетках ПЭС; например, POS легко поглощен первичных РПЭ клеток из мышей дикого типа, в то время как клетки Beta5 интегрином и мышей с MFG-E8 фагоцитировать меньше POS в том же количестве времени 6,12. Количественное определение POS фагоцитоза может быть сделано либо путем подсчета FITC-меченного POS вручную на микроскопических снимков 6 (фиг.3А), с использованием оборудования, способного чтения интенсивность флуоресценции 10,24,15,35 или проточного цитометра после обработки трипсином клетки 36,27. Совсем недавно, впускной и деградация POS оценивали Oп иммуноблоты испытанные для опсинов 37,38,27.
В естественных условиях, процесс поглощения POS происходит последовательно, как признание / обязательных предшествует синхронизированных интернационализации 6. Различные фазы поглощения может отличить в пробирке с использованием соответствующих экспериментальных процедур 39. Пульс-чейз-эксперименты могут быть выполнены с использованием переключателя температуры: связывание POS происходит при 20 ° С при интернализации требует температуру 37 ° С, чтобы продолжить 32,40,7. Это различие существует и в макрофагах, которые могут распознавать POS, а также и в котором молекулярный механизм для устранения апоптотических клеток очень похож на оборудование ПЭС в 7. После FITC-POS фагоцитоза, переплет и интернализация может быть определена количественно в отдельных образцах гашением FITC-флуоресценции поверхности переплете POS во время предварительной инкубации с трипановым синим Перед установкой ячеек 10. В трипанового синего клетках, обработанных только стажераль POS будет визуализировать, и связаны POS может быть определена количественно путем вычитания внутреннего POS от общего счета флуоресценции POS. При фагоцитоза оценивается на иммуноблотах, полученных с использованием лизатов, собранные после POS вызов, эквивалентна лечение ЭДТА до лизиса позволит отделение POS связанного с клеточной поверхностью по сравнению с общей внутренней POS сравнению фагоцитоза 37,38.
Огромные успехи были достигнуты в выявлении фагоцитов машин благодаря экспериментов, использующих очищенную POS. Подбор белка может быть оценена с помощью иммунофлюоресценции совместной локализации анализов 13-15,19-21,37,41 (фиг.3В). Набор белков или активации могут быть проверены на иммуноблотах после иммунопреципитации или путем проверки фосфорилирования 7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41 (рис 3C). Больше открытых исследований об общих изменениях экспрессии генов после разное время POS вызову,LSO были выполнены 42.
Изолированные POS также может быть использован для изучения устранение POS в клетках ПЭС. Действительно, во время нормального старения и / или когда POS не перевариваются должным образом, деградация POS продукты накапливаются постепенно, по мере липофусциновых месторождений и может привести к патологиям в результате окисления механизмов 24,27. Поэтому, понимая, эффекты света и связанных с окислительного повреждения могут потребовать POS вызов клетках ПЭС 18,26. И, наконец, повторные подачи с нормальными 27 или окисленные 25,28 POS могут быть использованы, чтобы вызвать кумулятивный эффект в RPE клеток в культуре, чтобы понять патологические механизмы, которые развиваются в естественных условиях в течение длительных периодов времени.
Рисунок 1. Retina изоляция от свиного глаза. Чертеж, показывающий различные этапы глаза вскрытия для того,для сбора и гомогенизации сетчатки перед операцией ультрацентрифугирования о непрерывных градиентов сахарозы, начиная верхнем левом углу. 60 мм в ширину лезвие используется для резки на глаз последовательно на одной стороне, а затем с другой, с тем, чтобы иметь возможность растянуть его наизнанку на кончике пальца, таким образом, обнажая сетчатку. Далее, сетчатка собирают утилизации его из тапетума с лезвием. Объединенные сетчатки затем тщательно встряхивают в буфере для гомогенизации, фильтровали 3 раза через двойных слоев марли и осторожно выливают на верхнюю часть линейного 25 - 60% градиент сахарозы.
Рисунок 2. Очистка POS из свиной глаз () Фотография из различных слоев, наблюдаемых на 25 с -. 60% градиенте сахарозы, после ультрацентрифугирования сетчатки гомогенатах. Оранжевый полоса соответствует POS быть собраны. Белые верхние соответствует группане-POS соответствующих материалов, а также увеличения мусора миграции вблизи или на дне пробирки. (B) Изображение изолированных POS как это наблюдается на ярком поле микроскопа на подсчета клеток для оценки доходности. POS существуют в удлиненной (А, А ', С, D) и развернулся (А, А', B, B ', D) форм. Некоторые удлиненный POS может отображать гибкой оконечность (с). При изменении плоскости фокуса, внешний вид POS переходит от блестящей до темно (ср и А ', В и В'). Панель Е показывает POS, которые не были ресуспендировали правильно и проживание в сгустки. Панель F показывает POS, которые были повреждены и не могут быть использованы только маленькие кусочки обнаружить. Масштаб 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
ИнжирЮр 3. Анализ НПП фагоцитоза с использованием очищенного поз. (А) конфокальной микроскопии изображение и соответствующие количественное определение числа фагосом на клетку со временем, показывающие, что FITC-меченый POS (зеленый) были менее фагоцитированы ПЭС первичных клеток, выделенных из Beta5 интегрина нокаут (β5 - / -) по сравнению с диким типом (WT или β5 + / +) мышей контрольной группы, как указано. Ядра (красный) были помечены с использованием DAPI и соединений элементов (синий) с помощью плотного контакта маркер ZO-1. Масштабные линейки 10 мкм. . Печатается по © Nandrot и др, 2004, впервые опубликована в журнале экспериментальной медицины 200 (12): 1539-1545. (B) конфокальной микроскопии фотографий, показывающих совместной локализации (желто-пурпурный, нижняя правая панель) между белками β5-GFP синтеза (зеленый, верхняя левая панель), поверхность v 5 интегрина рецепторов (красный, верхняя правая панель) и POS (синий, донныхлевая панель). Масштабная линейка 10 мкм. . Печатается по Nandrot и др, 2012, впервые опубликована в биологии Cell 104 (6): 326-341, © Portland Press Limited. (C) Иммуноблоты (ВБ) и соответствующая количественная (quantif.), Показывающий, что POS вызов (POS) увеличивает фосфорилирование FAK на остаток Tyr397 по сравнению без лечения (/) или вызов только со средой (м) в контрольных клетках (с) в то время как клетки, экспрессирующие инактивированной форме FAK (F) не реагируют, как указано. Воспроизводится с Finnemann, 2003, первоначально опубликованной в EMBO Journal 22 (16):. 4143-4154 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2 Chamber gradient maker | Gradient maker with 30 ml chambers | ||
| 3 mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| Small size magnetic stir bar | Stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| Red safelight lamp | Inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm tubes | Beckman | 344058 | Ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | Ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | Swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | Fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| Counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| Dark ice buckets with lids | |||
| Scales | |||
| Magnetic stirrer and upholding pole | |||
| Refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| Labcoat | Health and safety | ||
| Gloves | |||
| Sleeve protectors | |||
| Goggles | |||
| Absorbent pads | |||
| Biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades | Dissection | 60 mm/2.25 inch wide razor blades | |
| 15 cm plastic dish | |||
| Sterile gauze sheets | |||
| 15 and 50 ml tubes | Common consumables | ||
| Microtubes | |||
| Aluminum foil | |||
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
- LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
- Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
- Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
- Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
- Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
- Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
- Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
- Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
- Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
- Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
- Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
- Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
- Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
- Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
- Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
- Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
- Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
- Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
- Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
- Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
- Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
- Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
- Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152 (2009).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
- Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
- Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
- Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
- Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
- Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
- Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
- Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
- Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
- Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).
