Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

טיהור בקנה מידה גדולה של מגזרי בשר חזירים או שור קולטי אור חיצוני למבחני phagocytosis על תאי הרשתית פיגמנט אפיתל

Published: December 12, 2014 doi: 10.3791/52100
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 4, 1,2,3
1INSERM, U968, 2Sorbonne Universités, UPMC Paris 06, UMR_S 968, Institut de la Vision, 3CNRS, UMR_7210, 4Department of Biological Sciences, Center for Cancer, Genetic Diseases and Gene Regulation, Fordham University

Abstract

ניתוח של אחד מתפקידיה החיוניים של אפיתל של רשתית פיגמנט (RPE) תאים, phagocytosis של שברי דיסטלי גילאים בילו של מגזרים חיצוניים קולטי אור (POS) יכול להתבצע במבחנה. מגזרים חיצוניים קולטי אור עם ערימות של דיסקים קרומיים המכילים את מכונות phototransduction מתחדשות ללא הרף ברשתית. POS בילה בוטלו מדי יום על ידי תאי RPE. מכרסמים חזירי / שור ותאי RPE אנושיים, להכיר POS ממינים שונים באופן דומה. כדי להקל על ביצוע סדרה גדולה של ניסויים עם שונות קטנות, מלאי גדול של קופה יכולה להיות מבודד מעיניים חזיריות ומאוחסן קפוא בaliquots. פרוטוקול זה מנצל את המאפיין של photopigments המציג צבע כתום כאשר כל הזמן בחושך. תחת אור אדום עמום, רשתיות נאספים במאגר מeyecups פתח לחתוך בחצי. ההשעיה תא הרשתית הומוגני, מסונן והועמסה על שיפוע סוכרוז רציף. לאחר CENtrifugation, POS נמצא בלהקה בדידה בחלק העליון של השיפוע שיש לו צבע כתום אופייני. POS נאסף אז, הסתובב, resuspended ברצף במאגרים לשטוף, נספר וaliquoted. קופה השיגה בדרך זו יכולה לשמש למבחני phagocytosis וניתוח של הפעלת חלבון, לוקליזציה או אינטראקציה בזמנים שונים לאחר אתגר POS. לחלופין, POS יכול להיות מתויג עם fluorophores, דואר. G., FITC, לפני aliquoting לכימות שלאחר מכן הקרינה של POS מחייב או בליעה. יישומים אפשריים נוספים כוללים שימוש באתגר קופה או קופה שונה בשילוב עם תנאי לחץ כדי לחקור את ההשפעה של סטרס חמצוני או הזדקנות על תאי RPE.

Introduction

ברשתית, ראייה מופעלת על ידי isomerization של מולקולות רגישות לאור הנקראות opsins, לפני שהפך לאות שניתן להעביר בין הנוירונים עד לאזורים החזותיים במוח. מולקולות אלה מוטבעים בערימות של דיסקים קרומיים הדומים פנקייק, המהווה את החלקים החיצוניים קטע של תאי קולטי אור (PRS). נתון חשיפה מתמדת לאור ולכן רמות ניכרות של סטרס חמצונים, הפורטוריקנים ברציפות לחדש מגזרים החיצוניים שלהם כדי להגביל את נזק חמצוני פוטנציאלי. מגזרים חיצוניים קולטי אור נמצאים בקשר הדוק עם microvilli הפסגה של התאים השכנים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). תאי RPE מהווים חלק החיצוני של מחסום הדם-רשתית ולהבטיח שורה ארוכה של משימות שהם חיוניים לבריאות קולטנית אור ופונקצית 1, כגון מרווה קרני אור באמצעות פיגמנטים המלנין, מחדש isomerization של רשתית מרכיב opsin photoreactive, חומרים מזינים ומתן growth גורמים, משתתף ברשות המטבוליט יחסי הציבור.

בנוסף, תאי RPE לחסל בילו POS ולמחזר מרכיביהם, כיבוש יומי שמוסדר על ידי מקצב צירקדי ברשתית יונקים 2,3. האישור של קופה סככה הוא הכרחי להישרדות יחסי ציבור. כאשר הוא ביטל לחלוטין, לצבור פסולת קופה והפורטוריקנים להידרדר גורמים 4,5 אובדן ראייה מהיר. אם הפרופיל הקצבי הולך לאיבוד והוחלף על ידי פעילות מתמדת, פגמי יחסי הציבור והרשתית לצבור עם גיל 6. לכן, חשוב מאוד לאפיין את הרגולציה המולקולרית של phagocytosis הרשתית במבחנה כדי להבין פנוטיפים הקשורים לבעיות בתפקודה. מעניין, את המנגנון המולקולרי בתאי הרשתית הוא מאוד דומה לזה המשמש על ידי מקרופאגים כדי לנקות תאים אפופטוטיים ושניהם תלויים בהכרה של phosphatidylserine נחשף בפסולת phagocytic 7-9. ובכל זאת, תאי הרשתית ומקרופאגים להסדיר phagocytosis שונה, כמו מקרופאגים לבחור לחיסול מיידי של תאים אפופטוטיים בזמן מפגש בזמן שתאי RPE בקצב לבלוע POS רק פעם ביום למרות הקשר הקבוע שלהם עם מגזרים חיצוניים. הדבר מצביע על מנגנוני רגולציה ספציפיים שעדיין אינם מובנות במלואו.

רב של המולקולות מעורבות במכונות phagocytic הרשתית זוהו או תוקף הודות לשימוש בקופה מבודדת ומבחני phagocytosis תרבית תאים. קולט integrin alphavbeta5 ממוקם על פני תא פסגת הרשתית, בתיאום עם יגנד MFG-E8, נקשר באופן ספציפי ל10-12 POS, אשר לאחר מכן הם הפנימו באמצעות קולטן טירוזין קינאז MerTK 13-15. קולט נבלות CD36 הוכח להשתתף בצריכת קופה ולהשפיע על המהירות שלו 16,17, ועשוי לשמש כחיישן של פוספוליפידים חמצון על פני השטח POS 18. הפנמה צריכה הגיוס של שלד תא-התחת F- אקטיןחלבוני ociated כגון Annexin 2 19, שרירן II 20 ושרירן VIIA 21,22. POS Native או מתחמצן במבחנה גם מנוצלים להבין פנוטיפים הזדקנות של תאי RPE in vivo קשורים להצטברות של POS מתעכל בצורה גרועה חמצון 23-28. הדור של תאי RPE שמקורם בתאי גזע יזם בקשה חדשה לקופה מבודדת המשמשים להוכחה פונקציונלי של תאים לפני שהם מושתלים לבעלי חיים או חולים 29,30,27.

תואר לראשונה על ידי Molday ועמיתים בשינה 1987 31, הפרוטוקול לבידודה של קופה שור משלב צעד ultracentrifugation של homogenates רשתית במילויי סוכרוז רציפים עם תצפית של המראה הכתום האופייני לphotopigment רשתית מולבן (ביצוע 11- רשתית cis). בעבר 10 השנים, בשל אמצעי זהירות שננקטה על מנת לצמצם את הסיכון של מחלת פרה משוגעת, שימוש בעיניים חזיריות הפכו increasingly בולט. הפרוטוקול המתואר כאן מראה כיצד להשיג כמויות גדולות של POS מחזירי או עיני שור שניתן aliquoted ומאוחסנים לפרקי זמן ממושכים. זו מבטלת את הצורך להכין POS מעיני מכרסם, המחייב שימוש במספר רב של בעלי חיים להכנת POS וassay 32,33,21,22. בנוסף, פרטים על תיוג POS לפני האחסון באמצעות מולקולות ניאון ניתנים, לכמת ולחזות POS באופן פשוט ובר-השוואה ליישומים מסוימים בהשוואה לקופת תיוג לאחר assay phagocytosis 32,10. לכן, מניות הגדולות אלה מאפשרים לשחזור וקלות שימוש בסוגים רבים ושונים של ניסויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסוי בידוד POS זה זמן רב ועשוי לדרוש עד 12 שעות כדי להשלים אם POS מסומנים לפני האחסון. הפרוטוקול הותאם ממאמר שפורסם על ידי RS Molday ועמיתים בשנת 1987 31 ושונים על ידי SC Finnemann ועמיתים בשינה 1997 10.

בעלי חיים טופלו על פי האגודה לחקר חזון הצהרת העיניים (Arvo) לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון. פרוטוקולים היו נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה צ'ארלס דארווין מהפירית ומארי קירי אוניברסיטת פריז-06 והוועדה מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת פורדהם.

1. הכללי Set Up

  1. להשיג 80 עיני חזיר או פרה טריות טרי ברגע לאחר ששחט ככל האפשר, ולשמור אותם צונן בחושך. מספק הוראות לנותן ולכן החברה ממשיכה באותה הדרך. פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור 80 עיניים. ללהמשיך עם יותר עיניים ולקבל מניות גדולות יותר (לדוגמא,, מ -160 עיניים), להכפיל את כמויות הפתרון ולבצע 2 סיבובים של ultracentrifugation; דגימות בריכה לאחר מכן בשלב הגבייה (ראו שלב 2.2.2).
  2. הקימו על ספסל מנורת safelight האדומה, רפידות סופגים, מגבונים (שולחן חומרים). להכין מאכלי 15 סנטימטר ושקיות לאיסוף פסולת ביולוגיות מסוכנות (חלקי העין שאינה בשימוש, זגוגי ...). ללבוש חלוק מעבדה צמודה, כפפות, מגיני שרוול ומשקפי.
  3. אמצעי זהירות:
    1. טרום צמרמורת כל הפתרונות אז לשמור אותם קר בכל הצעדים. שמור את העיניים והדרגות מקוררים על קרח ככל האפשר.
    2. שמור את העיניים ורקמות נגזרות בחושך ככל האפשר עד שלב האיסוף לאחר ultracentrifugation להימנע photobleaching של פיגמנטים והפסד של הצבע הכתום-ורוד של הצורה הפעילה של photopigments חזותיים.

2. פעולות פרוטוקול

  1. הכן פתרונות והדרגות:
    1. מניית טאורין הפשרה באמצעות לחלוטין אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    2. הכן את כל הפתרונות מפתרונות מניות (טבלת 1, פתרונות מניות) ומערבבים היטב סוכרוז עם מרכיבים אחרים באמצעות stirrer מגנטי לכל פתרון.
      1. הכן 15 מיליליטר של פתרון הומוגניזציה לריכוז סופי של סוכרוז 20%, 20 מ"מ טריס pH7.2 אצטט, 2 מ"מ MgCl 2, 10 מ"מ וגלוקוז 5 טאורין מ"מ.
      2. הכן את פתרון סוכרוז 25% לריכוז סופי של סוכרוז 25% (באמצעות 70% מניות סוכרוז), pH 20 מ"מ אצטט טריס 7.2, 10 מ"מ וגלוקוז 5 טאורין מ"מ.
      3. הכן את פתרון סוכרוז 60% לריכוז סופי של סוכרוז 60% (באמצעות אבקת סוכרוז), 20 מ"מ טריס pH7.2 אצטט, גלוקוז 10 מ"מ ו 5 מ"מ טאורין.
      4. הכן את הפתרון לשטוף 1 לריכוז סופי של pH 20 מ"מ אצטט טריס 7.2 ו -5 טאורין מ"מ.
      5. הכן את הפתרון לשטוף 2לריכוז סופי של סוכרוז 10%, pH 20 מ"מ אצטט טריס 7.2 ו -5 טאורין מ"מ.
      6. הכן את הפתרון לשטוף 3 לריכוז סופי של סוכרוז 10%, pH פוספט נתרן 20 מ"מ טאורין 7.2 ו -5 מ"מ.
    3. לייצב את יצרנית השיפוע על stirrer מגנטי והכנס בר ומערבב בתא הקרוב ביותר ליציאה שבו פתרון 60% יוכנס. השתמש טיפ pipet P200 חתך שהוצב ביציאה של הצינור כדי להשיג מהירות ליהוק נכונה.
    4. עופרת הדרגתיים ליניארי בעדינות על ידי דילול וערבוב תמיסת סוכרוז 60% עם אחד 25% באמצעות 12 מ"ל מכל פתרון (כלומר, סך הכל 6 צינורות עבור 80 עיניים) בצינורות ultracentrifuge טרום צוננים. מערבבים את פתרון סוכרוז 60% בהדרגה-דילול גם. לייצב את מהירות זרימת שיפוע, לשפוך את הפתרון בצורה חלקה ולא מהר מדי.
      הערה: על מנת לקבל שיפוע רציף, ליניארי, לשמור על פתיחת טיפ pipet תקין על פני השטח של הפתרון לכל formatio השיפועn.
    5. בואו הדרגתיים לשבת על קרח סביב 1 hr לייצוב. שמור הדרגתיים מקורר עד טעון. אין לנער את הצינורות כדי למנוע שיבוש של השיפוע.
  2. אוסף רקמות:
    1. דגימות של רקמות תחת אור אדום עמום. קח העין ביד אחת ולתקוע קדמי עם קצה של סכין גילוח, ולהחזיק בעין משם (כדי למנוע התזות; איור 1). השתמש בסכין הגילוח כדי לחתוך את גלגל העין הקדמית ל -2 חצאים (קרנית בתוספת לפחות 5 מ"מ ללובן העין). הסר את העדשה ולהפוך את עיינית מבפנים החוצה, כך שהוא יכול להיות מוחזק על קצה אצבע אחת וכך חושפת את הרשתית.
    2. שימוש בסכין הגילוח בזווית, בעדינות לגרד הרשתית, ניתוק בקלות ומופיע כשכבת ורדרד, את פני השטח הטפטום ולחתוך בראש עצב הראייה (איור 1). לאסוף את כל הרשתיות ב 2 x 50 בכל המכיל 15 מיליליטר של תמיסת הומוגניזציה על קרח צינורות מיליליטר.
    3. הומו רשתיתgenization:
      1. לנער את ההשעיה בתוקף ביד במשך 2 דקות כדי לשבש את שכבות תאים השונות, לשבור קופה את שאר תא יחסי הציבור, קופה הבר וhomogenize ההשעיה הרשתית.
      2. מסנן 3x דרך שכבה כפולה של גזה נקייה כדי להסיר שברי רקמה גדולים ולאסוף את הזרימה דרך בצינורות 50 מיליליטר נקיים (איור 1). ההשעיה הרשתית להיות די עבה, על מנת למקסם את התשואה, לחץ בעדינות על הגזה לשחרר רקמות מקוטעות שנותרו לאחר כל סינון.
  3. בידוד קולטי אור חיצוני בר מגזר (POS):
    1. בעדינות להניח את הכנת הרשתית גולמי, סביב 6-7 מ"ל לכל צינור, מעל 6 x 30 צינורות ultracentrifuge מיליליטר כל 24 מיליליטר מכיל טרי מצונן רציף 25 - שיפוע 60% סוכרוז (איור 1). לאזן את הצינורות המתנגדים בהתאם לרוטור כדי לשמש. Ultracentrifuge ב106,000 XG במשך 50 דקות ב 4 ° C. להסיר את רוב הפתרון מעל הרצועה הכתומה-ורוד בשליש העליון של שיפוע על ידי שאיפה (איור 2 א). לאסוף את הלהקה הוורודה-הכתומה עם קצה P1000 חתך לתוך מבחנה. מחק את שאר הנטרול באמצעות אקונומיקה (פסולת ביולוגית).
    2. לדלל עם ~ 4 - 5 כרכים של לשטוף קר כקרח פתרון 1. להפריד לתוך צינורות מיליליטר 30 לפי צורך. צנטריפוגה ב3,000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. להשליך בזהירות את supernatant.
    3. כדורי Resuspend ב 10 מיליליטר לשטוף 2 פתרון וספין ב3,000 XG במשך 10 דקות כפי שפורט לעיל. כדורי Resuspend ב 15 מיליליטר לשטוף 3 ספין שוב ב 3000 XG במשך 10 דקות. לשלב השעיות מכמה כדורים כדי להפחית את מספר צינורות צורך לפני צנטריפוגה בWash 2 ולשטוף 3 פתרונות.
  4. POS aliquoting ללא תיוג:
    1. Resuspend POS ב10 - 20 מיליליטר DMEM. Predilute 10 μl ב490 DMEM μl (01:50) ולספור מוארך כמו גם POS הסתחרר בתא ספירת תאים (איור 2). חישוב תשואה וריכוז בחלקיקי POS לכל מ"ל.
      הערה: התשואה משתנה, לרוב בהתאם לגיל והמתח של חזירים / פרות והגודל של העיניים, למשל, הכנה טובה נעה בין 5 - 8 עיניים x 10 9 POS מ -80 חזיר.
    2. להחליט על גמר DMEM הנפח (בדרך כלל 10 - 20 מיליליטר) ולהוסיף סוכרוז להניב ריכוז סופי של סוכרוז 2.5%.
    3. הכן aliquots בגודל הרצוי, לדוגמא, 5 x 10 7 POS לכל צינור למ"ל 2 resuspension נפח לניסוי 96-גם בגיל 40 μl / טוב. ספין aliquot 1 במשך 5 דקות ב2,300 XG ב RT ולהעריך גודל גלולה. הכן גדלי aliquot שונים להיקפי יישום שונים כמו קופה לא צריכה להיות קפוא ומופשרת פעמיים.
    4. להקפיא aliquots POS ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
      הערה: Aliquots יציב במשך חודשים רבים. בידיים שלנו, POS ללא תווית או שכותרתו יכול להיות מאוחסן במשך שנה אחת לפחות.
  5. תיוג קופה וaliquoting:
    הערה: אנו משתמשים בדרך כלל FITC לתייג POS לכימות של מבחני phagocytosis, אבל צבעים אחרים עשויים לשמש גם בהתאם לצרכים.
    1. בקבוקון Resuspend 1 10 מ"ג FITC ב2.5 מ"ג / מיליליטר ריכוז בpH 0.1 חיץ קרבונט M Na 9.5 על ידי ערבוב של 2.6 מיליליטר 0.1 M NaHCO 3 pH 8.4 עם 1.4 מיליליטר 0.1 M Na 2 CO 3 pH 11.5 (טבלת 2, פתרונות מניות). סובב לשעה 1 בRT תוך הגנה מפני אור וספין במשך 5 דקות במהירות המרבית כדי גלולה מוצקי FITC שאינו resuspended.
    2. Resuspend גלולה POS ב 10 מיליליטר של לשטוף 3 פתרון (או DMEM) ולהוסיף 2 מיליליטר של תמיסת FITC עבור 80 עיניים. אחסן שאריות FITC הקפוא ב -80 ° C. סובב לפחות 1.5 שעות ב RT. להגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
    3. לשטוף POS שכותרתו פעמיים באמצעות לשטוף פתרון 3 כמפורט בסעיף 2.3.4, ולאחר מכן פעם או פעמיים בDMEM עד כמעט ולא FITC חופשי נתפס בf supernatantraction. Resuspend POS בDMEM והמשך כלקופה ללא תווית לספירה וaliquoting (סעיף 2.4).
  6. שימוש בקופה בניסויים:
    1. POS הפשרה בRT, ולשמור אותם בחושך ככל האפשר אם הם fluorescently שכותרתו. ספין במשך 5 דקות ב2,300 XG ב RT. לשאוב supernatant.
    2. resuspend מייד בנפח המתאים של פתרון assay כפי שהוכתב על ידי הניסוי. במקרה של זמנים שונים של אתגר POS, חנות resuspended POS ב RT בחושך בין נקודות זמן לכמה שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השילוב של השיפוע סוכרוז ליניארי וultracentrifugation מאפשר ההפרדה של המרכיבים השונים של ההשעיה הרשתית על ידי צפיפות. תאי פסולת ורשתית רשתית גדולים יותר כבדים לשקוע או קרוב לתחתית של השיפוע (איור 2 א). קופה קלה יותר וקלים יותר תאים בודדים או פסולת תא מהרשתית להעביר להקות נפרדות כלהגיע המחצית העליונה של השיפוע עד סוף תקופת צנטריפוגה. על ידי שמירה על העיניים והדגימות בחושך עד אחרי צעד צנטריפוגה, הלהקה המכילה POS יכולה להיות מוכרת באופן מיידי על ידי הצבע הכתום הבהיר שלה. הרוחב והעצמה של להקה, זה תלויה באיכות צבע וגובה צינור (89 מ"מ גובה עדיף). בדרך כלל, כאשר מבודדים כראוי POS צריך להופיע מוארך, ישר או כפוף כאשר הבחינו בשקופית מיקרוסקופ (איור 2). בהתאם למטוס ההתמקדות במיקרוסקופ, הם יכולים להופיע גם כהים או מבריקים. אם לא resuspended כראוי, הם יישארו בגושים. אם הם פגומים (ראו סעיף להלן), הם יופיעו כחתיכות קטנות בהרבה, קצת כמו רקע "מאובק".

בעיות שיכולים להתעורר הן בעיקר קשורות לשלושה נושאים. הבעיה האפשרית הראשונה היא שהצעד רועד של homogenates הרשתית הוא לא נמרץ מספיק, מה שמוביל לקופה נותרה צמוד להפורטוריקנים כך תשואה ירדה. הבעיה האפשרית השנייה קשורה לליהוק גרוע שיפוע או אובדן איכות שיפוע לעת ייצוב מספיק לפני טעינה או צינור מוגזם רועדת בכל צעד לפני האוסף. במקרה זה, הלהקות לא יכולות להיות מכובדות כראוי ולא ניתן לגבות POS בצינור המקביל. לבסוף, נושא הפוטנציאל השלישי מתעורר אם pH של כל אחד מהפתרונים הוא נכון: קרומי POS עלולים להתפורר ורק פסולת POS קטנה מופיעה במיקרוסקופ כאשר לדמיין אותם להערכת תשואה.

המטוהר POS יכוללשמש למספר יישומים שונים הקשורים ללימוד פונקצית phagocytic של תאי הרשתית. תאי RPE בדרך כלל משמשים כקווים סלולריים או בתרבות העיקרית ממודלים של בעלי החיים 32,6,12,18-21. לאחרונה, תאי RPE שמקורם בתאי גזע לתכנות מחדש כמו iPSC או ESC היו בשימוש 29,30,27,34. POS המבודד משמש כדי לבדוק ישירות את יכולת phagocytic של תאי RPE מוטציה; למשל, POS הם phagocytosed בקלות על ידי תאי RPE עיקריים מעכברי wild-type, ואילו תאים מintegrin beta5 והעכברים נוקאאוט MFG-E8 phagocytose פחות POS באותה הכמות של זמן 6,12. כימות של phagocytosis POS יכולה להיעשות גם על ידי ספירת קופה FITC שכותרתו באופן ידני על תמונות מיקרוסקופ 6 (איור 3 א), תוך שימוש בציוד מסוגל לקרוא עוצמת הקרינה 10,24,15,35 או cytometer זרימה לאחר התא trypsinization 36,27. לאחרונה, צריכת קופה והשפלה הוערכה oimmunoblots n חקר לopsins 37,38,27.

In vivo, תהליך הספיגה מתרחש ברצף POS כהכרה / מקדים מחייב מסונכרנים הפנמה 6. השלבים השונים של הספיגה יכולים גם להבחין במבחנה באמצעות הפרוצדורות מתאימות 39. ניתן לבצע ניסויי Pulse-מרדף באמצעות מתג טמפרטורה: POS מחייב מתרחש בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בזמן הפנמה צריכה טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להמשיך 32,40,7. הבחנה זו קיימת גם במקרופאגים, אשר יכול לזהות POS, כמו גם ובי מכונות מולקולריות לחסל תאים אפופטוטיים הוא מאוד דומה למכונות של הרשתית 7. לאחר phagocytosis FITC-POS, מחייבים והפנמה ניתן לכמת בדגימות נפרדות על ידי מרווה FITC הקרינה של קופה-מחויב פני השטח במהלך מראש דגירה עם trypan הכחול לפני תיקון התאים 10. בתאים שטופל trypan כחולים, מתמחה רקאל POS יהיה דמיין, וקופה מחויבת ניתן לכמת על ידי הפחתת POS הפנימי מסך ספירת הקרינה POS. כאשר phagocytosis נבחנים בimmunoblots שהושג באמצעות lysates שנאסף לאחר אתגר POS, טיפול מקביל עם EDTA לפני תמוגה יאפשר הניתוק של קופה מחויבת על פני התא לפנימי לעומת השוואת phagocytosis POS הכולל 37,38.

התקדמות עצומה שנעשתה בזיהוי הודות מכונות phagocytic לניסויי העסקת POS המטוהר. גיוס חלבון ניתן להעריך על ידי מבחני שיתוף לוקליזציה immunofluorescence 13-15,19-21,37,41 (איור 3). גיוס חלבון או הפעלה יכול להיות מאומת על immunoblots לאחר immunoprecipitation או על ידי הבדיקה לזירחון 7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41 (איור 3 ג). מחקרים יותר פתוחים על כולל שינויי ביטוי גנים לאחר שעות שונות של אתגר POS יש ליסימפוני בוצע 42.

גם קופה מבודדת יכולה לשמש כדי לחקור חיסול POS על ידי תאי RPE. ואכן, במהלך הזדקנות נורמלית ו / או כאשר קופה אינן מתעכל כראוי, מוצרים פגומים POS לצבור בהדרגה כפיקדונות lipofuscin ויכולים להוביל לפתולוגיות בשל מנגנוני חמצון 24,27. לפיכך, הבנת ההשפעות של אור ונזק חמצוני הקשורים עשויה לדרוש אתגר POS של תאי RPE 18,26. לבסוף, חזר האכלה עם 27 או מתחמצן 25,28 POS הרגיל יכול לשמש כדי לגרום להשפעות המצטברות בתאי הרשתית בתרבות כדי להבין את המנגנונים פתולוגיים המתפתחים בvivo על פני תקופות זמן ארוכות יותר.

איור 1
איור 1. בידוד רשתית מעיניים חזיריות. ציור המציג את השלבים השונים של ניתוח העיניים במטרהלאסוף וhomogenize הרשתית לפני צעד ultracentrifugation במילויי סוכרוז רציפים, החל שמאלי עליון. להב רחב 60 מ"מ משמש לחיתוך ברצף עין בצד אחד ולאחר מכן האחר, כדי שתוכל למתוח אותו מבפנים החוצה על קצה אצבע, וכך חושף את הרשתית. בשלב הבא, הרשתית נאספת על ידי מבטל אותו מהטפטום עם הלהב. רשתיות ונקוו אז מזועזעות ביסודיות במאגר הומוגניזציה, מסוננות 3 פעמים דרך שכבות כפולות של גזה ובעדינות שפכו על גבי 25 ליניארי - 60% שיפוע סוכרוז.

איור 2
איור 2. טיהור POS מעיניים חזיריות צילום (א) לשכבות השונות שנצפו על 25 -. 60% שיפוע סוכרוז לאחר ultracentrifugation של homogenates רשתית. הלהקה הכתומה מתאימה לקופה שתיגבה. מקבילה הרצועה העליונה הלבנהלחומרים שאינם קשור POS, כמו גם פסולת גדולה הנודדות קרוב או בחלק התחתון של הצינור. תמונה (B) של POS המבודד כפי שנצפה במיקרוסקופ שדה בהיר בתא ספירה להערכת תשואה. קופה קיימת ב(, מוארך ', ג, ד) והסתחררה (,', ב ', ב', ד) צורות. כמה POS המוארך יכול להציג גפיים מפותלים (ג). כאשר משנה את המטוס של מוקד, משמרות מראה POS ממבריקים לכהה (השוו ו', ב 'ו-ב'). דואר לוח ממחיש POS שלא היה resuspended כראוי ומתגוררים בגושים. לוח ו מציג קופה שנפגעה ואינן שמישים, רק חתיכות קטנות הן לגילוי. שינוי קנה מידה של 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איוריור ניתוח 3. של phagocytosis הרשתית באמצעות קופה מטוהרת. תמונת מיקרוסקופ Confocal () וכימות מקביל של מספר phagosomes לכל תא עם זמן מראה כי קופה FITC שכותרתו (ירוקה) כבר פחות phagocytosed על ידי תאים ראשוניים הרשתית מבודדת מintegrin beta5 נוקאאוט (β5 - / -) בהשוואה לwild-type עכברים (wt או β5 + / +) שליטה כפי שצוין. גרעינים (אדום) שכותרתו באמצעות DAPI וצמתים תא (כחול) באמצעות סמן הצומת ההדוק ZO-1. Scale מונע 10 מיקרומטר. . לשכפל מ© Nandrot et al, 2004, פורסם במקור בכתב עת Journal of Experimental Medicine 200 (12): 1,539-1,545. (ב) תמונות מיקרוסקופ Confocal מראים שיתוף לוקליזציה (צהובה-מגנטה, פנל ימני תחתון) בין חלבוני β5-GFP היתוך (ירוק, פנל שמאלי עליון), קולטני integrin αvβ5 פני השטח (אדום, פנל ימני עליון) וקופה (כחול, תחתוןפנל משמאל). סרגל 10 מיקרומטר. . לשכפל מNandrot et al, 2012, שפורסם במקור בביולוגיה של התא 104 (6): 326-341, © פורטלנד לחץ מוגבל. (C) immunoblots (WB) ומתאים כימות (quantif.) מראה כי אתגר POS (POS) מגביר זירחון של FAK על שאריות Tyr397 בהשוואה ללא טיפול (/) או תיגר עם מדיום לבד (מ ') בתאי שליטה (ג) בעוד תאים לבטא צורה מומת של FAK (F) לא מגיבים, כפי שצוין. לשכפל מFinnemann, 2003, פורסם במקור בEMBO Journal 22 (16):. 4,143-4,154 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Name Company Catalog Number Comments
Specific Material/Equipment
2 Chamber gradient maker Gradient maker with 30 ml chambers
3 mm diameter silicone tubing tubing for gradient casting
Small size magnetic stir bar Stir bar fitting the gradient maker chamber
Red safelight lamp Inactinic lamp for dissection in the dark
Ultra Clear 25 x 89 cm tubes Beckman 344058 Ultracentrifugation tubes
PP Oak Ridge tubes Nalgene 3119-0050 30 ml centrifugation tubes
Optima LE-80K Beckman Coulter 365668 Ultracentrifuge
SW 32Ti swing rotor Beckman Coulter 369694 Swing rotor for ultracentrifuge
Avanti J-26 XP Beckman Coulter 393124 Centrifuge
JA-25.50 rotor Beckman Coulter 363058 Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge
FITC Isomer I Life Technologies F-1906 Fluorescent dye
Other Material/Equipment
Counting chamber (such as Neubauer or Malassez)
Dark ice buckets with lids
Scales
Magnetic stirrer and upholding pole
Refrigated microcentrifuge
37 °C water bath
-80 °C freezer
Consumables
Labcoat Health and safety
Gloves
Sleeve protectors
Goggles
Absorbent pads
Biohazard trash bags and bins
Weck-Prep blades Dissection 60 mm/2.25 inch wide razor blades
15 cm plastic dish
Sterile gauze sheets
15 and 50 ml tubes Common consumables
Microtubes
Aluminum foil

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
  3. LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
  4. Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
  5. Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
  6. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. 200 (12), 1539-1545 (2004).
  7. Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
  8. Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
  9. Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
  10. Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
  11. Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
  12. Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
  13. Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
  14. Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
  15. Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
  16. Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
  17. Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
  18. Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
  19. Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  20. Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
  21. Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
  22. Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
  23. Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
  24. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  25. Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
  26. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  27. Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
  28. Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
  29. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152 (2009).
  30. Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
  31. Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
  32. Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
  33. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  34. Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
  35. Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
  36. Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
  37. Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
  38. Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
  39. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
  40. Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
  41. Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
  42. Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
  43. Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
  44. Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
  45. Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).

Tags

אימונולוגיה גיליון 94 רשתית קולטי אור קטע חיצוני שיפוע סוכרוז טיהור ultracentrifugation assay phagocytosis אפיתל הפיגמנט ברשתית
טיהור בקנה מידה גדולה של מגזרי בשר חזירים או שור קולטי אור חיצוני למבחני phagocytosis על תאי הרשתית פיגמנט אפיתל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parinot, C., Rieu, Q., Chatagnon,… More

Parinot, C., Rieu, Q., Chatagnon, J., Finnemann, S. C., Nandrot, E. F. Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (94), e52100, doi:10.3791/52100 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter