Abstract
Analyse van een van de vitale functies van retinale pigmentepitheel (RPE) cellen, de fagocytose van verbruikte leeftijd distale fragmenten van fotoreceptor buitenste segmenten (POS) kan worden uitgevoerd in vitro. Fotoreceptor buitenste segmenten met stapels van membraneuze discs met de fototransductie machines worden continu vernieuwd in het netvlies. Doorgebracht POS worden dagelijks geëlimineerd door RPE cellen. Knaagdier, varken / rund en humane RPE cellen herkennen POS uit verschillende soorten op dezelfde wijze. Voor het uitvoeren grote reeks experimenten met weinig variabiliteit vergemakkelijken kan een grote voorraad POS worden geïsoleerd uit varkens ogen en opgeslagen in aliquots ingevroren. Dit protocol maakt gebruik van de eigenschap van photopigments die een oranje kleur weergegeven bij bewaring in het donker. Onder gedimd rood licht, zijn retinae opgevangen in een buffer uit geopende oogschelpen gesneden in helften. De retinale cel suspensie wordt gehomogeniseerd, gefiltreerd en geladen op een continue sucrose gradiënt. Na centrifugation, POS wordt in een afzonderlijke band in het bovenste deel van de gradiënt die een karakteristieke oranje kleur heeft. POS worden vervolgens verzameld, gesponnen, geresuspendeerd opeenvolgend in wasbuffers, geteld en in porties verdeeld. POS verkregen die wijze kan worden gebruikt voor fagocytose assays en analyse van eiwitten activatie lokalisatie of interactie op verschillende tijdstippen na POS challenge. Als alternatief kan POS gelabeld worden met fluoroforen, e. G., FITC, voordat aliquoting voor volgende fluorescentie kwantificering van POS binden of afblazen. Andere mogelijke toepassingen omvatten het gebruik van gemodificeerde POS of POS uitdaging gecombineerd met stressomstandigheden het effect van oxidatieve stress of veroudering op RPE cellen te bestuderen.
Introduction
In de retina, wordt zicht veroorzaakt door isomerisatie van fotogevoelige moleculen genaamd opsins, alvorens te worden omgezet in een signaal dat tussen neuronen kunnen worden doorgegeven aan de visuele gebieden van de hersenen. Deze moleculen zijn ingebed in stapels van membraneuze schijven lijkt op pannenkoeken dat de buitenste segment delen van lichtgevoelige cellen (PV's) vormen. Worden onderworpen aan een constante blootstelling aan licht en dus een aanzienlijke mate van oxidatieve stress, continu PR's hun buitenste segmenten te vernieuwen om mogelijke oxidatieve schade te beperken. Fotoreceptor buitenste segmenten staan in nauw contact met de apicale microvilli van het naburige retinale pigment epitheel (RPE) cellen. RPE-cellen vormen het buitenste gedeelte van de bloed-retina barrière en zorgen talrijke taken die cruciaal zijn voor fotoreceptoren gezondheid en functie 1 zijn, zoals afschrikken lichtstralen via melanine, opnieuw isomerisatie van de fotoreactieve opsin component retinal verstrekken van voedingsstoffen en gGROEI factoren, deelnemen aan PR metaboliet beschikking.
Bovendien elimineren RPE cellen besteed POS en hun componenten, een dagelijkse bezigheid die wordt gereguleerd door het circadiane ritme in zoogdierretina 2,3 recyclen. De klaring van loods POS is absoluut noodzakelijk voor PR overleven. Wanneer deze volledig is ingetrokken, POS vuil ophopen en PR's ontaarden dat een snel verlies van het gezichtsvermogen 4,5. Als de ritmische profiel verloren en vervangen door een constante activiteit, PR en RPE gebreken accumuleren 6 leeftijd. Daarom is het erg belangrijk om de moleculaire regulatie van RPE fagocytose karakteriseren in vitro om fenotypen verbonden met de dysfunctie begrijpen. Interessant is dat de moleculaire machinerie van RPE cellen vergelijkbaar met die gebruikt door macrofagen apoptotische cellen wissen en beide zijn afhankelijk erkenning van blootgestelde fosfatidylserine op fagocyterende vuil 7-9. Toch RPE cellen en macrofagen reguleren phagocytosis anders macrofagen kiezen voor onmiddellijke verwijdering van apoptotische cellen bij ontmoeting moment tijdens RPE cellen ritmisch overspoelen POS eenmaal daags ondanks hun permanent contact met de buitensegmenten. Dit suggereert specifieke mechanismen regelgeving die nog niet volledig begrepen.
Veel moleculen betrokken bij het RPE fagocytaire machine geïdentificeerd of gevalideerd door het gebruik van geïsoleerde POS en celcultuur fagocytose assays. De alphavbeta5 integrine receptor bij het RPE apicale celoppervlak, in samenwerking met zijn ligand MFG-E8, bindt specifiek aan POS 10-12, die vervolgens worden geïnternaliseerd via MerTK tyrosine kinase receptor 13-15. De CD36 scavenger receptor werd aangetoond dat POS inname en beïnvloeden de snelheid 16,17 en kan dienen als een sensor van geoxideerde fosfolipiden op het POS vlak 18. Internalisatie moet de werving van F-actine cytoskelet-associated eiwitten zoals annexine 2 19, myosine II 20 en myosine VIIA 21,22. Inheemse of geoxideerd POS in vitro worden ook gebruikt om veroudering fenotypes van RPE cellen in vivo gekoppeld aan accumulatie van slecht verteerd geoxideerde POS 23-28 begrijpen. Het genereren van RPE cellen afkomstig van stamcellen is een nieuwe toepassing voor geïsoleerde POS die worden gebruikt om de functies van cellen bewijzen voordat ze worden getransplanteerd dieren of patiënten 29,30,27 geïnitieerd.
Eerst beschreven door Molday en collega's in 1987 31, het protocol voor isolatie van runderen POS combineert een ultracentrifuge stap van retinale homogenaten op continue sucrosegradiënten met observatie van de karakteristieke oranje uiterlijk van ongebleekt retinale photopigment (uitvoeren 11- cis retinal). In de afgelopen 10 jaar, als gevolg van voorzorgsmaatregelen genomen om het risico van de gekkekoeienziekte te minimaliseren, het gebruik van varkens ogen is geworden increasingly prominent. De hier beschreven protocol duidelijk dat grote hoeveelheden POS van varkens of runderen ogen die kunnen worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen voor langere tijd te verkrijgen. Dit elimineert de noodzaak om POS bereiden van knaagdieren ogen, die vereist het gebruik van een groot aantal dieren per POS voorbereiding en test 32,33,21,22. Daarnaast worden gegevens over POS labeling vóór opslag met fluorescerende moleculen gegeven, te kwantificeren en visualiseren POS in een vereenvoudigde en vergelijkbare wijze voor sommige toepassingen tegenover etikettering POS na fagocytose assay 32,10. Daarom zijn deze grote voorraden zorgen voor reproduceerbaarheid en gebruiksgemak in vele verschillende experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze POS isolatie experiment is tijdrovend en kunnen tot 12 uur in beslag wanneer POS gelabeld vóór opslag. Het protocol is aangepast van een paper gepubliceerd door RS Molday en collega's in 1987 31 en gewijzigd door SC Finnemann en collega's in 1997 10.
De dieren werden behandeld volgens de Association for Research in Vision en Oogheelkunde (ARVO) verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research. Protocollen werden beoordeeld en door de Charles Darwin ethische commissie van de Universiteit Pierre en Marie Curie-Paris 06 en de Fordham University Institutional Animal Care en gebruik goedgekeurd.
1. Algemeen Set Up
- Verkrijgen 80 vers varken of koe ogen zo vers als snel na het slachten mogelijk en houd ze gekoeld in het donker. Instructies geven aan de provider zodat het bedrijf verloopt op dezelfde manier. Dit protocol is geoptimaliseerd voor 80 ogen. Naardoorgaan met meer ogen en krijgen grotere voorraden (bv, van 160 ogen), het dubbele van de oplossing hoeveelheden en uitvoeren 2 rondes van ultracentrifuge; pool monsters later aan de collectie stap (zie stap 2.2.2).
- Opgezet op de bank de rode safelight lamp, absorberende kussentjes, doekjes (Materials tabel). Bereid 15 cm schalen en biohazard zakken voor afvalinzameling (ongebruikte oog onderdelen, glasvocht ...). Draag nauwsluitende labjas, handschoenen, mouwbeschermers en een veiligheidsbril.
- Voorzorgsmaatregelen:
- Pre-chill alle oplossingen dan houden ze koud tijdens alle stappen. Houd ogen en gradiënten op ijs gekoeld zoveel mogelijk.
- Houd ogen en afgeleide weefsels in het donker zoveel mogelijk tot de verzamelstap na ultracentrifugatie vermijden fotobleken visuele pigmenten en verlies van de oranje-roze kleur van de actieve vorm van de photopigments.
2. Protocol Acties
- Bereid oplossingen en hellingen:
- Dooi taurine voorraad volledig met behulp van een 37 ° C waterbad.
- Bereid alle oplossingen uit voorraad oplossingen (tabel 1, Stock oplossingen) en meng de sucrose met andere ingrediënten om met een magneetroerder voor elke oplossing.
- Maak 15 ml van de homogenisering oplossing tot een eindconcentratie van 20% sucrose, 20 mM Tris acetaat pH 7,2, 2 mM MgCl2, 10 mM glucose en 5 mM taurine.
- Bereid de 25% sucrose oplossing tot een eindconcentratie van 25% sucrose (met 70% sucrose stock), 20 mM tris pH 7,2, 10 mM glucose en 5 mM taurine.
- Bereid de 60% sucrose oplossing tot een eindconcentratie van 60% sucrose (saccharose met poeder), 20 mM Tris acetaat pH 7,2, 10 mM glucose en 5 mM taurine.
- Bereid de Wash 1 oplossing tot een eindconcentratie van 20 mM tris pH 7,2 en 5 mM taurine.
- Bereid de Wash 2 oplossingtot een eindconcentratie van 10% sucrose, 20 mM tris pH 7,2 en 5 mM taurine.
- Bereid de 3 Wash oplossing tot een eindconcentratie van 10% sucrose, 20 mM natriumfosfaat pH 7,2 en 5 mM taurine.
- Steady de gradiënt maker op een magneetroerder en plaats een roerstaafje in de kamer het dichtst bij de uitgang waar de 60% oplossing zal worden ingevoegd. Gebruik een cut-off P200 pipet tip geplaatst bij de uitgang van de slang aan op een goede casting snelheid te bereiken.
- Cast lineaire verlopen subtiel door het verdunnen en roeren van de 60% sucrose-oplossing met de 25% een met behulp van 12 ml van elke oplossing (dat wil zeggen, in totaal 6 buizen voor 80 ogen) in de pre-gekoelde ultracentrifugebuizen. Roer het geleidelijk-verdunning van 60% sucrose-oplossing ook. Steady de snelheid van gradiëntstroom, gieten van de oplossing soepel en niet te snel.
OPMERKING: Om een continue, lineair verloop te krijgen, houdt u de pipet tip opening direct aan het oppervlak van de oplossing voor de gehele gradiënt vormingenn. - Laat de gradiënten zitten op het ijs voor ongeveer 1 uur om te stabiliseren. Houd de hellingen gekoeld totdat geladen. Laat de buizen niet schudden om verstoring van de gradiënt te voorkomen.
- Tissue collectie:
- Verzamel weefsels onder gedimd rood licht. Neem een oogje in de ene hand en porren de voorzijde met rand van scheermesje terwijl de aandacht weg (om spatten te voorkomen; figuur 1). Gebruik het scheermes aan het voorste oogbol in 2 helften (cornea plus ten minste 5 mm in de sclera) afgesneden. Verwijder de lens en draai de oogschelp binnen naar buiten, zodat het kan worden gehouden over het puntje van een vinger waardoor het blootstellen van de retina.
- De scheermesje schuin voorzichtig schrapen het netvlies losmaken eenvoudig en verschijnen als een rozeachtige laag van de tapetum oppervlak en afgesneden de oogzenuw (figuur 1). Verzamel netvlies in 2 x 50 ml buisjes die elk 15 ml homogenisering oplossing op ijs.
- Retina homogenization:
- Schud de suspensie krachtig met de hand gedurende 2 min teneinde de verschillende cellagen verstoren, afbreken POS van de rest van de PR cel fragment POS en homogeniseer de retina suspensie.
- Filtreer 3x door een dubbele laag van schone gaas grote weefselfragmenten en vang de doorstroming in schone buizen van 50 ml (figuur 1). De retinale schorsing wordt vrij dik, om de opbrengst te maximaliseren, drukt u voorzichtig op het gaas om de resterende gefragmenteerde weefsels na elke filtratie los.
- Fotoreceptor buitenste segment fragment (POS) isolatie:
- Leg de ruwe netvlies prep, ongeveer 6-7 ml per buis, gedurende 6 x 30 ml ultracentrifugebuizen elk 24 ml vers gekoeld continue 25-60% sucrose gradiënt (figuur 1). Balans de tegengestelde buizen, die voor het rotor te gebruiken. Ultracentrifuge bij 106.000 xg gedurende 50 min bij 4 ° C. Verwijder het grootste deel van de oplossing boven de oranje-roze band in het bovenste derde van de gradiënt door aspiratie (Figuur 2A). Het verzamelen van de oranje-roze band met een cut-off P1000 tip in een bekerglas. Gooi de rust na het neutraliseren met behulp van bleekwater (biologisch afval).
- Verdun met ~ 4-5 volumina ijskoude Wash 1 oplossing. Verdeel in maar 30 ml buisjes als nodig. Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi de supernatant voorzichtig.
- Resuspendeer pellets in 10 ml 2-oplossing wassen en centrifugeren bij 3000 xg gedurende 10 min zoals hierboven beschreven. Resuspendeer pellets in 15 ml Was 3 en draaien opnieuw bij 3000 xg gedurende 10 min. Combineer suspensies van enkele pellets het aantal buizen nodig voordat centrifugeren Wash 2 verminderen en wassen 3 oplossingen.
- POS aliquoting zonder etikettering:
- Hersuspendeer POS in 10-20 ml DMEM. Predilute 10 ul in 490 ul DMEM (01:50) en tel maar ook langwerpig als wervelde POS in eencel telkamer (figuur 2B). Bereken opbrengst en concentratie in POS-deeltjes per ml.
OPMERKING: De opbrengst varieert, hoofdzakelijk afhankelijk van de leeftijd en het type van varkens / koeien en grootte van de ogen, bijvoorbeeld, een goede voorbereiding varieert 5-8 x 10 9 POS van 80 varkens ogen. - Bepaal het uiteindelijke volume DMEM (meestal 10-20 ml) en voeg sucrose tot een uiteindelijke concentratie van 2,5% sucrose verkregen.
- Aliquots van de gewenste grootte, bijvoorbeeld 5 x 10 7 POS per buis voor een 2 ml resuspensie volume van een 96-well experiment bij 40 pl / putje. Spin 1 portie gedurende 5 min bij 2300 xg bij RT en evalueren pellet grootte. Bereid verschillende portie maten voor verschillende toepassingsgebieden volumes als POS NIET moeten worden bevroren en twee keer ontdooid.
- Freeze POS aliquots bij -80 ° C tot verder gebruik.
OPMERKING: Hoeveelheden zijn stabiel gedurende vele maanden. In onze handen, kunnen ongelabelde of geëtiketteerd POS wordt ten minste één jaar.
- Hersuspendeer POS in 10-20 ml DMEM. Predilute 10 ul in 490 ul DMEM (01:50) en tel maar ook langwerpig als wervelde POS in eencel telkamer (figuur 2B). Bereken opbrengst en concentratie in POS-deeltjes per ml.
- POS etikettering en aliquoteren:
OPMERKING: We gebruiken meestal FITC POS label voor het kwantificeren van fagocytose assays, maar andere kleurstoffen kunnen eveneens worden gebruikt afhankelijk van de behoeften.- Resuspendeer 1 10 mg FITC flacon 2,5 mg / ml concentratie in 0,1 M Na-carbonaatbuffer pH 9,5 door mengen 2,6 ml 0,1 M NaHCO3 pH 8,4 met 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11.5 (Tabel 2, Voorraadoplossingen). Draai gedurende 1 uur bij KT en beschermt tegen licht en centrifugeren gedurende 5 minuten bij maximale snelheid niet-FITC vaste pellet geresuspendeerd.
- Resuspendeer de POS pellet in 10 ml Wash 3 oplossing (of DMEM) en 2 ml van FITC oplossing 80 ogen. Bewaar overgebleven FITC bevroren bij -80 ° C. Draai minstens 1,5 uur bij kamertemperatuur. Beschermen tegen licht met behulp van aluminiumfolie.
- Was gelabeld POS tweemaal wassen met 3-oplossing zoals beschreven in paragraaf 2.3.4, dan een of twee keer in DMEM tot bijna geen vrije FITC gezien in de supernatant Fraction. Hersuspendeer POS in DMEM en ga als voor ongelabelde POS voor het tellen en aliquoteren (paragraaf 2.4).
- Met behulp van POS in experimenten:
- Dooi POS bij RT, en bewaar ze in het donker zoveel mogelijk indien zij fluorescent label. Spin gedurende 5 min bij 2300 xg bij kamertemperatuur. Zuig de supernatant.
- Onmiddellijk opnieuw in suspensie in de juiste hoeveelheid testoplossing zoals gedicteerd door het experiment. In geval van verschillende tijden van POS uitdaging, winkel geresuspendeerd POS bij RT in het donker tussen tijd-punten voor enkele uren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De combinatie van de lineaire sucrose gradiënt ultracentrifugatie en maakt de scheiding van de verschillende componenten van het retinale suspensie door dichtheid. Zware grotere retinale puin en RPE cellen zinken naar of nabij de bodem van de gradiënt (figuur 2A). Lichter POS en lichter afzonderlijke cellen of celresten van het netvlies migreren als afzonderlijke banden op de bovenste helft van de gradiënt tegen het einde van de periode centrifugatie. Door het houden van de ogen en de monsters in het donker tot na het centrifugeren stap, kan de band met POS onmiddellijk te herkennen aan de fel oranje kleur. De breedte en de intensiteit van deze band is afhankelijk van verloopkwaliteit en buis hoogte (89 mm hoogte heeft de voorkeur). Typisch, wanneer goed geïsoleerd POS moeten verschijnen langgerekte, rechte of gebogen bij waarneming op een microscoopglaasje (figuur 2B). Afhankelijk van de focus vliegtuig op de microscoop, kunnen ze verschijnen ofwel donker of glanzend. Zo niet RESUScorrect geschorst, blijven ze in bosjes. Als ze beschadigd zijn (zie paragraaf hieronder), zullen ze verschijnen als veel kleinere stukken, een beetje als een 'stoffig' achtergrond.
Problemen die kunnen ontstaan zijn meestal gerelateerd aan drie punten. De eerste mogelijke probleem is dat het schudden stap van het netvlies homogenaten niet krachtig genoeg, waardoor POS gehecht is aan PR dus verminderde opbrengst. De tweede mogelijke probleem is gekoppeld aan een slechte verloop gieten of gradiënt kwaliteitsverlies onvoldoende stabilisatie van tijd voordat het laden of overmatig buis schudden bij elke stap voordat de collectie. In dit geval kunnen de banden niet goed onderscheiden en POS niet verzameld in de desbetreffende buis. Het derde mogelijk probleem optreedt als de pH van de oplossing is verkeerd: POS membranen kunnen desintegreren en slechts kleine POS vuil op het microscoop bij visualiseren hen opbrengst assessment.
Gezuiverd POS kanworden gebruikt voor een aantal verschillende toepassingen in verband met het bestuderen van de fagocytaire functie van RPE-cellen. RPE cellen worden meestal gebruikt als cellijnen of primaire kweek van diermodellen 32,6,12,18-21. Recenter zijn RPE cellen afkomstig van reprogrammed stamcellen zoals iPSC of ESC gebruikt 29,30,27,34. Geïsoleerde POS dienen om direct de fagocytische vermogen van mutant RPE cellen te testen, bijvoorbeeld, zijn POS gemakkelijk gefagocyteerd door primaire RPE cellen van wild-type muizen, terwijl cellen uit beta5 integrine en MFG-E8 knockout muizen fagocyteren minder POS in dezelfde hoeveelheid tijd 6,12. Kwantificering van POS fagocytose kan worden gedaan door FITC-gelabelde POS rekenen handmatig op microscoop foto 6 (figuur 3A), met apparatuur kan lezen fluorescentie-intensiteit 10,24,15,35 of een flowcytometer na cel trypsine 36,27. Meer recent heeft POS inname en degradatie onderzocht on immunoblots gesondeerd voor opsins 37,38,27.
In vivo, de POS opname proces vindt sequentieel als erkenning / bindende voorafgaat gesynchroniseerd internalisatie 6. De verschillende fasen van opname kan ook gekenmerkt in vitro onder gebruikmaking van geschikte experimentele procedures 39. Pulse-chase experimenten kunnen worden uitgevoerd met temperatuurschakelaar: POS binding treedt bij 20 ° C terwijl internalisatie heeft een temperatuur van 37 ° C te gaan 32,40,7. Dit onderscheid bestaat ook in macrofagen, waarbij POS kan herkennen en en waarbij de moleculaire machinerie apoptotische cellen elimineren is zeer vergelijkbaar met de RPE de machinerie 7. Na FITC-POS fagocytose, binding en internalisatie kan in afzonderlijke monsters worden gekwantificeerd door afschrikken van het FITC-fluorescentie van het oppervlak gebonden POS tijdens de pre-incubatie met trypaanblauw vóór de vaststelling van de cellen 10. In trypan blue-behandelde cellen alleen internal POS zal worden gevisualiseerd, en gebonden POS kan worden gekwantificeerd door het aftrekken van interne POS van de totale POS fluorescentie telt. Wanneer fagocytose wordt beoordeeld op immunoblots verkregen met lysaten na POS challenge verzameld, zal een gelijke behandeling met EDTA voor lysis het losmaken van POS gebonden aan het celoppervlak interne versus totaal POS fagocytose vergelijking 37,38 toestaan.
Enorme vooruitgang is geboekt in de identificatie van de fagocyterende machines dankzij experimenten in dienst gezuiverd POS. Eiwit recruitment kan worden beoordeeld door immunofluorescentie co-localisatie assays 13-15,19-21,37,41 (figuur 3B). Eiwit aanwerving of activering kan worden gevalideerd op immunoblots na immunoprecipitatie of door te controleren op fosforylering 7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41 (Figuur 3C). Meer open-ended studies over het algemeen veranderingen genexpressie na verschillende tijden van POS uitdaging hebben eenLSO uitgevoerd 42.
Geïsoleerde POS kan ook worden gebruikt om POS verwijdering bestuderen door RPE-cellen. Inderdaad, bij normale veroudering en / of wanneer POS niet goed verteerd, POS afbraakproducten accumuleren geleidelijk lipofuscine afzettingen en kunnen leiden tot pathologieën vanwege oxidatiemechanismen 24,27. Vandaar dat het begrijpen van de effecten van licht en gerelateerde oxidatieve schade kan POS uitdaging van RPE cellen 18,26 vereisen. Tenslotte herhaalde voeden met normale 27 of geoxideerde 25,28 POS kan worden gebruikt om de cumulatieve effecten van RPE cellen in kweek te induceren om pathologische mechanismen die zich ontwikkelen in vivo over langere perioden te begrijpen.
Figuur 1. Retina isolatie van varkens ogen. Tekening die de verschillende stappen van het oog dissectie omte verzamelen en te homogeniseren het netvlies voor de ultracentrifuge stap op continue sucrosegradiënten, te beginnen linksboven. Een 60 mm brede pen wordt gebruikt om de gaten achtereenvolgens aan de ene kant knippen en de andere om het te kunnen binnenstebuiten strekken een vingertop, aldus blootstellen van het netvlies. Vervolgens wordt de retina verzameld door schrappen uit het tapetum met het blad. Samengevoegde retina worden vervolgens grondig geschud in homogenisatiebuffer, gefiltreerd 3 maal door twee lagen gaas en subtiel gegoten bovenop de lineaire 25-60% sucrose gradiënt.
Figuur 2. POS zuivering uit varkens ogen (A) Foto van de verschillende lagen waargenomen op 25 -. 60% sucrose gradiënt na ultracentrifugatie van retina homogenaten. De oranje band komt overeen met POS worden verzameld. De witte bovenste band komt overeenniet-POS gerelateerde materialen, evenals grotere brokstukken migreren buurt van de bodem van de buis. (B) Foto van geïsoleerde POS zoals waargenomen op een helder veld microscoop op een telling cel voor opbrengst assessment. POS bestaan langwerpig (a, a ', c, d) en whirled (a, a', b, b ', d) vormen. Sommige langwerpige POS kan een opgerolde extremiteit (c) weer te geven. Bij het wijzigen van het vliegtuig van focus, POS verschijning verschuift van glanzend naar donker (vergelijk a en a ', b en b'). Paneel e illustreert POS die niet goed zijn gesuspendeerd en te verblijven in groepjes. Paneel F toont POS die beschadigd en zijn niet bruikbaar, slechts kleine stukjes detecteerbaar. Schaal 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Vijgure 3. Analyse van RPE fagocytose gebruik gezuiverd POS. (A) confocale microscoop plaatje en overeenkomstige kwantificering van het aantal phagosomes per cel met de tijd zien dat FITC-gelabelde POS (groen) zijn minder zijn gefagocyteerd door RPE primaire cellen geïsoleerd uit beta5 integrine knockout (β5 - / -) vergeleken met wildtype (wt of β5 + / +) controlemuizen zoals aangegeven. Kernen (rood) werden gelabeld met behulp van DAPI en mobiele verbindingen (blauw) met de tight junction marker ZO-1. Schaalbalken 10 urn. . Gereproduceerd van © Nandrot et al, 2004, oorspronkelijk gepubliceerd in The Journal of Experimental Medicine 200 (12): 1539-1545. (B) confocale microscoop foto's tonen van co-lokalisatie (geel-magenta, rechtsonder paneel) tussen β5-GFP fusie-eiwitten (groen, linksboven paneel), oppervlakte avß5 integrine receptoren (rood, bovenaan rechts paneel) en POS (blauw, bottomlinker paneel). Schaalbalk 10 micrometer. . Overgenomen uit Nandrot et al, 2012, oorspronkelijk gepubliceerd in Biology of the Cell 104 (6): 326-341, © Portland Press Limited. (C) Immunoblots (WB) en bijbehorende kwantificering (quantif.) En aangezien POS challenge (POS) verhoogt fosforylatie van FAK op Tyr397 residu opzichte zonder behandeling (/) of uitgedaagd met alleen medium (m) in controlecellen (c) terwijl cellen die een geïnactiveerde vorm van FAK (F) niet reageren, zoals aangegeven. Overgenomen uit Finnemann, 2003, oorspronkelijk gepubliceerd in EMBO Journal 22 (16):. 4143-4154 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2 Chamber gradient maker | Gradient maker with 30 ml chambers | ||
| 3 mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| Small size magnetic stir bar | Stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| Red safelight lamp | Inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm tubes | Beckman | 344058 | Ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | Ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | Swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | Fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| Counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| Dark ice buckets with lids | |||
| Scales | |||
| Magnetic stirrer and upholding pole | |||
| Refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| Labcoat | Health and safety | ||
| Gloves | |||
| Sleeve protectors | |||
| Goggles | |||
| Absorbent pads | |||
| Biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades | Dissection | 60 mm/2.25 inch wide razor blades | |
| 15 cm plastic dish | |||
| Sterile gauze sheets | |||
| 15 and 50 ml tubes | Common consumables | ||
| Microtubes | |||
| Aluminum foil | |||
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
- LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
- Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
- Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
- Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
- Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
- Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
- Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
- Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
- Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
- Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
- Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
- Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
- Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
- Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
- Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
- Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
- Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
- Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
- Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
- Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
- Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
- Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
- Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152 (2009).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
- Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
- Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
- Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
- Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
- Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
- Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
- Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
- Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
- Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).
