Abstract
Analyse af en af de vitale funktioner retinal pigment epithelial (RPE) celler, fagocytose af brugte alderen distale fragmenter af fotoreceptor ydre segmenter (POS) kan udføres in vitro. Fotoreceptor ydre segmenter med stakke af hindeagtige diske, der indeholder fototransduktionen maskiner fornys kontinuerligt i nethinden. Brugt POS elimineres dagligt af RPE-celler. Gnaver, porcin / bovin og human RPE celler genkender POS fra forskellige arter på en lignende måde. For at lette udførelse store serier af eksperimenter med lille variation, kan et stort lager af POS isoleres fra svin øjne og opbevares frosset i portioner. Denne protokol drager fordel af den egenskab photopigments der viser en orange farve, når den opbevares i mørke. Under svagt rødt lys, er retinae opsamles i en buffer fra åbnede øjestykker skåret i halve. Retinal celle suspension homogeniseres, filtreret og fyldt på en kontinuerlig saccharosegradient. Efter centrifugation, POS er placeret i et særskilt bånd i den øverste del af gradienten, der har en karakteristisk orange farve. POS opsamles derefter, spundet, resuspenderet sekventielt i vaskebuffere, talt og opdelt i portioner. POS opnået på denne måde kan anvendes til fagocytose assays og analyse af protein-aktivering, lokalisering eller interaktion på forskellige tidspunkter efter POS udfordring. Alternativt kan POS mærkes med fluoroforer, e. G., FITC, før alikvotere til efterfølgende fluorescens kvantificering af POS binding eller engulfment. Andre mulige anvendelser indbefatter anvendelsen af modificerede POS eller POS udfordring kombineret med stress betingelser for at studere virkningen af oxidativt stress eller ældning på RPE-celler.
Introduction
I nethinden, er vision udløses ved isomerisering af lysfølsomme molekyler kaldet opsiner, før den omdannes til et signal, der kan overføres mellem neuroner op til de visuelle områder i hjernen. Disse molekyler er indlejret i stakke af membranøse diske ligner pandekager, der udgør de ydre segment dele af fotoreceptorceller (PRS). At være udsat for konstant udsættelse for lys og dermed betydelige niveauer af oxidativt stress, PRS løbende forny deres ydre segmenter for at begrænse potentiel oxidativ skade. Fotoreceptor ydre segmenter er i tæt kontakt med apikal mikrovilli af de omkringliggende retinal pigment epithelial (RPE) celler. RPE celler udgør den ydre del af blod-retina-barrieren og sikre mange opgaver, der er afgørende for fotoreceptorer sundhed og funktion 1, såsom standsning lysstråler via melanin pigmenter, re-isomerisering af den fotoreaktive opsin komponent retinal, der giver næringsstoffer og gVÆKST faktorer, der deltager i PR metabolit rådighed.
Desuden, fjerne RPE celler brugt POS og genbruge deres komponenter, en daglig besættelse, der er reguleret af døgnrytme i pattedyr retina 2,3. Clearance af stald POS er absolut nødvendigt for PR overlevelse. Når den er helt ophævet, POS dannes snavs og PRS degenerere medfører hurtig synstab 4,5. Hvis den rytmiske profil er tabt og erstattes af en konstant aktivitet, PR og RPE fejl akkumuleres med 6 alder. Derfor er det meget vigtigt at karakterisere den molekylære regulering af RPE fagocytose in vitro for at forstå fænotyper knyttet til dets dysfunktion. Interessant molekylære maskineri i RPE-celler er meget lig den, der anvendes af makrofager til at rydde apoptotiske celler og begge er afhængige af anerkendelse af eksponeret phosphatidylserin på fagocytisk debris 7-9. Still, RPE-celler og makrofager regulerer phagocytosis forskelligt, som makrofager vælge øjeblikkelig afskaffelse af apoptotiske celler ved møde tid, mens RPE celler rytmisk opsluge POS kun en gang om dagen på trods af deres permanent kontakt med ydre segmenter. Dette tyder på specifikke reguleringsmekanismer, som endnu ikke fuldt forstået.
Mange af de molekyler, der er impliceret i RPE fagocytisk maskiner er blevet identificeret eller valideres takket være brugen af isolerede POS og cellekultur fagocytose assays. Den alphavbeta5 integrinreceptor placeret i RPE apikale celleoverfladen, i samarbejde med dets ligand MFG-E8, binder specifikt til POS 10-12, som derefter internaliseres via MerTK tyrosinkinasereceptor 13-15. The CD36 scavenger receptor har vist sig at deltage i POS indtagelse og påvirke dens hastighed 16,17, og kan tjene som en sensor af oxiderede phospholipider ved POS overflade 18. Internalisering brug for rekruttering af F-actincytoskelettet-associated proteiner, såsom annexin 2 19 myosin II 20 og myosin VIIA 21,22. Native eller oxideret POS in vitro anvendes også til at forstå aldring fænotyper af RPE celler in vivo er forbundet med akkumulering af dårligt fordøjet oxideret POS 23-28. Frembringelsen af RPE celler afledt af stamceller har indledt en ny ansøgning om isolerede POS, der bruges til at bevise funktionaliteten af celler, før de transplanteres til dyr eller patienter 29,30,27.
Først beskrevet af Molday og kolleger i 1987 31, protokollen til isolering af bovin POS kombinerer en ultracentrifugering skridt af retinale homogenater på løbende saccharosegradienter med observation af den karakteristiske orange udseende ubleget retinal photopigment (transporterer 11- cis retinal). I de seneste 10 år, på grund af sikkerhedsforanstaltninger, der er truffet for at minimere risikoen for kogalskab, er brug af svin øjne bliver increasingly fremtrædende. Den her beskrevne protokol viser, hvordan man får store mængder af POS fra svin eller kvæg øjne, der kan alikvoteres og lagres i længere tid. Dette eliminerer behovet for at forberede POS fra gnaver øjne, som kræver hjælp af et stort antal dyr pr POS forberedelse og analyse 32,33,21,22. Desuden er oplysninger om POS mærkning før opbevaring ved hjælp af fluorescerende molekyler givet, at kvantificere og visualisere POS i en forenklet og sammenlignelig måde for nogle programmer i forhold til mærkning POS efter fagocytose assay 32,10. Derfor er disse store lagre tillader reproducerbarhed og brugervenlighed i mange forskellige typer af eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette POS isolation eksperiment er tidskrævende og kan tage op til 12 timer at fuldføre, hvis POS er mærket før opbevaring. Protokollen er blevet tilpasset fra et papir udgivet af RS Molday og kolleger i 1987 31 og modificeret af SC Finnemann og kolleger i 1997 10.
Dyrene blev behandlet i overensstemmelse med Foreningen for Forskning i Vision og Ophthalmology (ARVO) Redegørelse for anvendelse af dyr i Ophthalmic og Vision Research. Protokoller blev gennemgået og godkendt af Charles Darwin etiske komité fra University Pierre og Marie Curie-Paris 06 og Fordham University Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Generelt opsætning
- Opnå 80 friske svin eller ko øjne så frisk, som snart efter slagtningen som muligt og holde dem kølet i mørke. Give instrukser til udbyderen så selskabet fortsætter på samme måde. Denne protokol er optimeret til 80 øjne. TilFortsæt med flere øjne og få store lagre (f.eks, fra 160 øjne), fordoble opløsningen mængder og udføre 2 runder af ultracentrifugering; pool prøver senere på trin samling (se trin 2.2.2).
- Opsætning på bænken den røde safelight lampe, absorberende puder, servietter (Materialer tabel). Forbered 15 cm skåle og biohazard poser til indsamling af affald (ubrugt øjedele, glasagtige ...). Bær tætsiddende labcoat, handsker, ærmebeskyttere og beskyttelsesbriller.
- Forholdsregler:
- Pre-chill alle løsninger derefter holde dem kolde under alle trin. Hold øjne og gradienter afkølet på is så meget som muligt.
- Hold øjne og afledte væv i mørke så meget som muligt, indtil trinnet samling efter ultracentrifugering for at undgå fotoblegning af visuelle pigmenter og tab af orange-pink farve af den aktive form af photopigments.
2. Protokol Handlinger
- Forbered løsninger og gradienter:
- Thaw taurin lager fuldstændigt ved 37 ° C vandbad.
- Forbered alle løsninger fra stamopløsninger (tabel 1, stamopløsninger) og blandes grundigt saccharose med andre ingredienser ved hjælp af en magnetisk omrører i hver opløsning.
- Forbered 15 ml af homogenisering opløsning til en endelig koncentration på 20% saccharose, 20 mM Tris-acetat pH 7,2, 2 mM MgCl2, 10 mM glucose og 5 mM taurin.
- Forbered 25% sucrose-opløsning til en slutkoncentration på 25% saccharose (ved hjælp af 70% sucrose stock), 20 mM tris-acetat pH 7,2, 10 mM glucose og 5 mM taurin.
- Forbered 60% sucrose-opløsning til en slutkoncentration på 60% saccharose (ved hjælp af saccharose pulver), 20 mM Tris-acetat pH 7,2, 10 mM glucose og 5 mM taurin.
- Forbered Wash 1 opløsning til en endelig koncentration på 20 mM tris-acetat pH 7,2 og 5 mM taurin.
- Forbered Wash 2 løsningtil en slutkoncentration på 10% saccharose, 20 mM tris-acetat pH 7,2 og 5 mM taurin.
- Forbered Wash 3 opløsningen til en slutkoncentration på 10% saccharose, 20 mM natriumphosphat pH 7,2 og 5 mM taurin.
- Steady gradient maker på en magnetomrører og indsætte en omrører i kammeret nærmest til exit, hvor 60% opløsning vil blive indsat. Brug en cut-off P200 pipette spids anbragt for enden af slangen for at opnå ordentlig casting hastighed.
- Cast lineære gradienter fløje ved fortynding og omrøring af 60% sucrose opløsning med et 25% ved anvendelse af 12 ml af hver opløsning (dvs. i alt 6 rør til 80 øjne) i præ-kølet ultracentrifugerør. Rør gradvist-fortynding 60% rørsukkeropløsning godt. Steady hastighed gradient flow, hælde opløsningen jævnt og ikke for hurtigt.
BEMÆRK: For at få en kontinuerlig, lineær gradient, holde pipettespidsen åbning lige ved overfladen af opløsningen til hele gradient GERn. - Lad gradienter sidde på is i omkring 1 time til stabilisering. Hold gradienter kølet indtil indlæst. Ryst ikke rørene for at forhindre forstyrrelser af gradienten.
- Tissue samling:
- Saml væv under svagt rødt lys. Tag et øje i den ene hånd og stikke fronten med kant barberblad, mens du holder øje væk (for at undgå sprøjt, figur 1). Brug barberblad til at skære den forreste øjeæblet i 2 halvdele (hornhinden plus mindst 5 mm ind i sclera). Tag objektivet og flip øjestykket vrangen ud, så den kan holdes over spidsen af en finger dermed udsætter nethinden.
- Brug af barberblad i en vinkel, forsigtigt skrabe nethinden, afmontering let og optræder som en rødlig lag, off tapetum overflade og skæres ved synsnerven (figur 1). Saml alle nethinder i 2 x 50 ml rør, som hver indeholder 15 ml af homogenisering opløsning på is.
- Retina homogenization:
- Ryst suspensionen kraftigt i hånden i 2 minutter for at afbryde de forskellige cellelag, bryde POS off resten af PR celle, fragment POS og homogeniseres nethinden suspension.
- Filter 3x gennem et dobbelt lag af ren gaze for at fjerne store vævsfragmenter og indsamle gennemløbet i rene 50 ml rør (figur 1). Den nethinden suspension bliver helt tyk, for at maksimere udbyttet, tryk forsigtigt på gaze til at frigive de resterende fragmenterede væv efter hver filtrering.
- Fotoreceptor ydre segment fragment (POS) isolation:
- Forsigtigt lægge rå nethinden prep, omkring 6-7 ml pr rør, over 6 x 30 ml ultracentrifugerør hver indeholdende 24 ml frisk kølet uafbrudt 25 - 60% sucrose-gradient (figur 1). Balance de modstående rør, som passer til rotoren, der skal anvendes. Ultracentrifuge ved 106.000 xg i 50 min ved 4 ° C. Fjerne det meste af opløsningen over orange-lyserødt bånd i den øverste tredjedel af gradienten ved aspiration (figur 2A). Saml den orange-pink bånd med en cut-off P1000 spids i et bæger. Kassér resten efter neutralisering ved hjælp af blegemiddel (biologisk affald).
- Fortynd med ~ 4 - 5 volumener iskold Wash 1 løsning. Separere i så mange 30 ml rør efter behov. Centrifuger ved 3.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Kassere forsigtigt supernatanten.
- Resuspender pellets i 10 ml Vask 2-opløsning og centrifugering ved 3.000 xg i 10 min som beskrevet ovenfor. Resuspender pellets i 15 ml Vask 3 og spin igen ved 3.000 xg i 10 min. Kombiner suspensioner fra flere pellets at reducere antallet af rør, der er nødvendige før centrifugering i Wash 2 og vask 3 løsninger.
- POS alikvotere uden mærkning:
- Resuspender POS i 10 - 20 ml DMEM. Predilute 10 pi i 490 pi DMEM (1:50) og tælle langstrakt samt hvirvles POS i encelletælling kammer (figur 2B). Beregn udbyttet og koncentrationen i POS-partikler per ml.
BEMÆRK: Udbyttet varierer alt meste på alder og stamme af grise / køer og størrelsen af øjnene, fx en god forberedelse spænder 5-8 x 10 9 POS fra 80 svin øjne. - Bestem den endelige DMEM volumen (typisk 10 - 20 ml) og tilsætte saccharose til opnåelse af en slutkoncentration på 2,5% saccharose.
- Forbered portioner af ønsket størrelse, fx 5 x 10 7 POS per rør til et 2 ml resuspension volumen for en 96-brønds eksperimentet ved 40 pl / brønd. Spin 1 portion i 5 minutter ved 2.300 xg ved stuetemperatur og evaluere pellet størrelse. Forbered forskellige alikvote størrelser til forskellige anvendelsesområder mængder som POS ikke bør fryses og optøs to gange.
- Frys POS portioner ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
BEMÆRK: Portioner er stabile i mange måneder. I vores hænder, kan umærket eller mærket POS opbevares i mindst et år.
- Resuspender POS i 10 - 20 ml DMEM. Predilute 10 pi i 490 pi DMEM (1:50) og tælle langstrakt samt hvirvles POS i encelletælling kammer (figur 2B). Beregn udbyttet og koncentrationen i POS-partikler per ml.
- POS mærkning og udportionering:
BEMÆRK: Vi anvender typisk FITC at mærke POS til kvantificering af fagocytose assays, men andre farvestoffer kan anvendes såvel afhængigt af behov.- Resuspender 1 10 mg FITC hætteglasset på en 2,5 mg / ml koncentration i 0,1 M Na-carbonat, pH 9,5 ved at blande 2,6 ml 0,1 M NaHCO3, pH 8,4 med 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (tabel 2 Stamopløsninger). Drej i 1 time ved stuetemperatur og samtidig beskytte mod lys og spin for 5 min ved maksimal hastighed til pelletering ikke-resuspenderede FITC faste stoffer.
- Resuspender POS pellet i 10 ml Wash 3 opløsning (eller DMEM), og der tilsættes 2 ml FITC løsning til 80 øjne. Opbevar sidesten FITC frosset ved -80 ° C. Roter mindst 1,5 time ved stuetemperatur. Beskyt mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie.
- Vask mærket POS to gange med Wash 3 løsning som beskrevet i afsnit 2.3.4, så en eller to gange i DMEM indtil næsten intet frit FITC ses i supernatanten f-fraktion. Resuspender POS i DMEM og fortsætte som for umærket POS for optælling og udportionering (afsnit 2.4).
- Brug af POS i forsøg:
- Thaw POS ved stuetemperatur, og holde dem i mørke så meget som muligt, hvis de er fluorescens-mærket. Spin i 5 minutter ved 2.300 xg ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten.
- Umiddelbart opblande i passende mængde assay løsning som dikteret af eksperimentet. Ved forskellige tidspunkter af POS udfordring butik resuspenderet POS ved stuetemperatur i mørke mellem tidspunkter i flere timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kombinationen af den lineære saccharosegradient og ultracentrifugering tillader adskillelse af de forskellige komponenter i retinal suspension af tæthed. Heavy større retinale vragrester og RPE celler synker til eller nær bunden af gradient (figur 2A). Lighter POS og lysere individuelle celler eller cellerester fra retina migrere som separate bånd for at nå den øverste halvdel af gradienten ved udgangen af centrifugering periode. Ved at holde øjne og prøverne i mørke indtil efter centrifugeringen, kan båndet indeholder POS straks genkendt af sin lyse orange farve. Bredden og intensiteten af dette bånd afhænger gradient kvalitet og rør højde (89 mm højde foretrækkes). Typisk, når isoleret korrekt POS skal vises aflange, lige eller bøjet når de observeres på et objektglas (figur 2B). Afhængigt af fokusplan på mikroskopet, kan de vises enten mørke eller skinnende. Hvis ikke resusderet korrekt, vil de forblive i klumper. Hvis de er beskadiget (se punkt nedenfor), vil de fremstå som meget mindre stykker, lidt ligesom en "støvet" baggrund.
Problemer, der kan opstå for det meste relateret til tre spørgsmål. Den første mulige problem er, at rystning trin i retinale homogenater er ikke tilstrækkelig, hvilket fører til POS stadig er fastgjort til PRs således nedsat udbytte. Den anden mulige spørgsmål er knyttet til dårlig gradient støbning eller gradient tab af kvalitet til tiden utilstrækkelig stabilisering før lastning eller overdreven rør ryster på ethvert skridt inden indsamlingen. I dette tilfælde kan båndene ikke være behørigt skelnet POS kan ikke indsamles i den tilsvarende rør. Endelig opstår det tredje potentielt problem, hvis pH-værdien af nogen af de løsninger er forkert: POS membraner kan gå i opløsning og kun små POS vragrester vises på mikroskopet, når visualisere dem for udbytte vurdering.
Renset POS kananvendes til en række forskellige anvendelser til at studere fagocyterende funktion af RPE-celler. RPE-celler er normalt anvendes som cellelinier eller i primær kultur fra dyremodeller 32,6,12,18-21. Mere for nylig er RPE celler afledt fra omprogrammerede stamceller som iPSC eller ESC blevet anvendt 29,30,27,34. Isolerede POS tjener til at teste direkte fagocytiske evne mutant RPE celler fx er POS let fagocyteret af primære RPE celler fra vildtypemus, mens celler fra beta5 integrin og MFG-E8 knockout-mus fagocytere mindre POS i den samme mængde tid 6,12. Kvantificering af POS fagocytose kan ske enten ved at tælle FITC-mærket POS manuelt på mikroskop billeder 6 (figur 3A), ved hjælp af udstyr, der kan læse fluorescensintensitet 10,24,15,35 eller et flowcytometer efter celle trypsinisering 36,27. For nylig er POS indtag og nedbrydning blevet evalueret on immunoblots probede for opsiner 37,38,27.
In vivo, POS optagelse proces sker sekventielt som anerkendelse / bindende går forud synkroniserede internalisering 6. De forskellige faser af optagelse kan også skelnes in vitro ved anvendelse af passende eksperimentelle procedurer 39. Pulse-chase forsøg kan udføres ved anvendelse temperaturafbryder: POS binding forekommer ved 20 ° C, medens internalisering behov for en temperatur på 37 ° C for at fortsætte 32,40,7. Denne sondring findes også i makrofager, der kan genkende POS samt og hvor molekylære maskineri til at fjerne apoptotiske celler er meget lig RPE maskineri 7. Efter FITC-POS fagocytose, kan bindende og internalisering kvantificeres i separate prøver ved standsning af FITC-fluorescens af overfladebundet POS under præ-inkubering med trypanblå før fastsættelse af cellerne 10. I trypanblåt-behandlede celler, kun internal POS vil blive visualiseret, og bundne POS kan kvantificeres ved at trække intern POS fra de samlede POS fluorescens tæller. Når fagocytose vurderes på immunoblots opnået under anvendelse af lysater opsamlet efter POS udfordring, vil en tilsvarende behandling med EDTA før lysis tillade udstationering af POS bundet på celleoverfladen til intern versus total POS fagocytose sammenligning 37,38.
Enorme fremskridt er blevet gjort i identifikationen af de fagocytiske maskiner takket være eksperimenter beskæftiger renset POS. Protein rekruttering kan vurderes ved immunofluorescens co-lokalisering assays 13-15,19-21,37,41 (figur 3B). Protein rekruttering eller aktivering kan valideres på immunoblots efter immunopræcipitation eller ved at kontrollere for phosphorylering 7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41 (figur 3C). Mere åbne undersøgelser af de overordnede genekspression ændringer efter forskellige tidspunkter af POS udfordring har enLSO udført 42.
Isoleret POS kan også anvendes til at studere POS eliminering af RPE-celler. Faktisk under normal ældning og / eller når POS ikke fordøjes ordentligt, POS nedbrydningsprodukter akkumulere efterhånden som lipofuscin indskud og kan føre til patologier på grund af oxidation mekanismer 24,27. Derfor kan forstå effekten af lys og relaterede oxidative skader kræver POS udfordring RPE celler 18,26. Endelig gentages fodring med normale 27 eller oxiderede 25,28 POS kan anvendes til at inducere kumulative virkninger i RPE-celler i kultur for at forstå patologiske mekanismer, der udvikler in vivo over længere perioder.
Figur 1. Retina isolation fra svin øjne. Tegning, der viser de forskellige trin i øjet dissektion forat indsamle og homogenisere nethinden før ultracentrifugering skridt på kontinuerlige saccharosegradienter, startende øverst til venstre. En 60 mm bred klinge bruges til at skære øjet sekventielt på den ene side og derefter den anden med henblik på at være i stand til at strække det inde ud på en fingerspids, hvilket udsætter nethinden. Dernæst nethinden opsamlet ved skrotning det fra tapetum med bladet. Pooled retinae derefter rystet grundigt i homogeniseringsbuffer, filtreret 3 gange gennem dobbelte lag af gaze og fint hældes på toppen af den lineære 25-60% saccharosegradient.
Figur 2. POS oprensning fra svin øjne (A) fotografi af forskellige lag observeret på en 25 -. 60% saccharosegradient efter ultracentrifugering af nethinden homogenater. Den orange bånd svarer til POS, der skal indsamles. De hvide øvre bånd svarertil ikke-POS relaterede materialer samt større debris migrerer nær eller i bunden af røret. (B) Billede af isolerede POS som observeret på en lys felt mikroskop på en optælling celle til udbytte vurdering. POS eksisterer i aflang (a, a ', c, d) og hvirvlede (a, a', b, b ', D) former. Nogle langstrakt POS kan vise en oprullet ende (c). Ved skift flyet af fokus, POS udseende skifter fra skinnende til mørk (sammenligne a og a ', b og b'). Panel e illustrerer POS, som ikke er resuspenderet ordentligt og opholde sig i klumper. Panel f viser POS, der er blevet beskadiget og ikke er anvendelige, kun små stykker er påviselig. Skala 10 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figure 3. Analyse af RPE fagocytose anvendelse af oprenset POS. (A) konfokalt mikroskop billede og tilsvarende kvantificering af antallet af fagosomer per celle med tiden viser, at FITC-mærket POS (grøn) er blevet mindre fagocyteres af RPE primære celler isoleret fra beta5 integrin knockout (β5 - / -) sammenlignet med vildtype (wt eller β5 + / +) kontrolmus som angivet. Kerner (rød) blev mærket ved hjælp af DAPI og celle junctions (blå) ved hjælp af tight junction markør ZO-1. Scale bars 10 um. . Gengivet fra © Nandrot et al, 2004, oprindeligt udgivet i The Journal of Experimental Medicine 200 (12): 1539-1545. (B) konfokalt mikroskop billeder viser co-lokalisering (gul-magenta, nederst til højre panel) mellem β5-GFP fusionsproteiner (grøn, øverst til venstre panel), overflade αvβ5 integrinreceptorer (rød, øverst til højre panel) og POS (blå, bundvenstre panel). Scale bar 10 pm. . Gengivet fra Nandrot et al, 2012, oprindeligt udgivet i biologi af Cell 104 (6): 326-341, © Portland Press Limited. (C) Immunoblots (WB) og tilsvarende kvantificering (quantif.) Viser, at POS udfordring (POS) øger phosphorylering af FAK på Tyr397 rest sammenlignet uden behandling (/) eller udfordret med medium alene (m) i kontrolceller (C) mens celler, der udtrykker en inaktiveret form af FAK (F) ikke reagerer, som angivet. Gengivet fra Finnemann, 2003, oprindeligt udgivet i EMBO Journal 22 (16):. 4143-4154 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2 Chamber gradient maker | Gradient maker with 30 ml chambers | ||
| 3 mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| Small size magnetic stir bar | Stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| Red safelight lamp | Inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm tubes | Beckman | 344058 | Ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | Ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | Swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | Fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| Counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| Dark ice buckets with lids | |||
| Scales | |||
| Magnetic stirrer and upholding pole | |||
| Refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| Labcoat | Health and safety | ||
| Gloves | |||
| Sleeve protectors | |||
| Goggles | |||
| Absorbent pads | |||
| Biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades | Dissection | 60 mm/2.25 inch wide razor blades | |
| 15 cm plastic dish | |||
| Sterile gauze sheets | |||
| 15 and 50 ml tubes | Common consumables | ||
| Microtubes | |||
| Aluminum foil | |||
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
- LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
- Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
- Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
- Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
- Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
- Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
- Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
- Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
- Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
- Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
- Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
- Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
- Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
- Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
- Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
- Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
- Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
- Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
- Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
- Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
- Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
- Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
- Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152 (2009).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
- Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
- Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
- Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
- Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
- Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
- Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
- Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
- Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
- Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).
