Abstract
Analisi di una delle funzioni vitali epiteliale pigmentato retinico (RPE) cellule, la fagocitosi delle passate età frammenti distali dei segmenti esterni fotorecettori (POS) può essere eseguita in vitro. Fotorecettore segmenti esterni con pile di dischi membranose contenenti la macchina phototransduction vengono continuamente rinnovati nella retina. POS esausti vengono eliminati tutti i giorni dalle cellule RPE. Roditore, suina / bovini e cellule RPE umani riconoscono POS da varie specie in un modo simile. Per facilitare l'esecuzione di grandi serie di esperimenti con poca variabilità, un grande magazzino di POS può essere isolato da occhi suini e conservato congelato in aliquote. Questo protocollo sfrutta la caratteristica di fotopigmenti che visualizzano un colore arancione quando tenuti all'oscuro. Sotto fioca luce rossa, retine sono raccolti in un buffer da paraocchi aperte tagliate a metà. La sospensione cellulare retina viene omogeneizzata, filtrata e caricato su un gradiente di saccarosio continuo. Dopo centrifugation, POS sono situati in una banda discreta nella parte superiore della sfumatura che ha un caratteristico colore arancione. POS vengono poi raccolti, filato, risospese in sequenza in tamponi di lavaggio, contati e aliquotati. POS ottenute in questo modo possono essere utilizzati per saggi di fagocitosi ed analisi di attivazione della proteina, localizzazione o interazione in vari momenti dopo sfida POS. In alternativa, POS può essere etichettato con fluorofori, e. G., FITC, prima che si dispensa per la successiva quantificazione di fluorescenza di POS vincolanti o engulfment. Altre possibili applicazioni includono l'uso di modificato POS o POS sfida combinato con condizioni di stress per studiare l'effetto dello stress ossidativo o invecchiamento sulle cellule RPE.
Introduction
Nella retina, la visione viene attivato per isomerizzazione di molecole fotosensibili denominate opsine, prima di essere trasformato in un segnale che può essere trasmesso tra i neuroni fino alle aree visive del cervello. Queste molecole sono incorporati in pile di dischi membranose simili a frittelle che costituiscono le porzioni segmento esterno dei fotorecettori (PRS). Essere sottoposti a costante esposizione alla luce e quindi notevoli livelli di stress ossidativo, PR continuamente rinnovare i loro segmenti esterni per limitare il potenziale danno ossidativo. Segmenti esterni dei fotorecettori sono in stretto contatto con microvilli apicale delle retina epiteliali del pigmento (RPE) cellule vicine. Cellule RPE costituiscono la parte esterna della barriera emato-retinica e garantire numerosi compiti che sono cruciali per la salute e la funzione fotorecettori 1, come tempra raggi luminosi con pigmenti di melanina, ri-isomerizzazione del componente opsin fotoreattivo retina, fornendo nutrienti e gCRESCITA fattori, partecipando a disposizione PR metabolita.
Inoltre, le cellule RPE eliminano spesi POS e riciclano i loro componenti, un'occupazione quotidiana che è regolato dal ritmo circadiano in retina di mammifero 2,3. La clearance di capannone POS è assolutamente necessario per la sopravvivenza PR. Quando è completamente abrogato, POS detriti si accumulano e PRS degenerano causando una rapida 4,5 perdita della vista. Se il profilo ritmica viene persa e sostituita da un'attività costante, PR e RPE difetti accumulano con l'età 6. Pertanto, è molto importante per caratterizzare la regolazione molecolare di RPE fagocitosi in vitro per comprendere fenotipi legati al suo erettile. È interessante notare che il macchinario molecolare in cellule RPE è molto simile a quello utilizzato dai macrofagi per eliminare cellule apoptotiche ed entrambi sono determinati dal riconoscimento della fosfatidilserina esposta su detriti fagocitica 7-9. Tuttavia, le cellule RPE e macrofagi regolano phagocytosis diversamente, come macrofagi optare per l'eliminazione immediata di cellule apoptotiche al momento dell'incontro, mentre le cellule RPE ritmicamente inghiottire POS solo una volta al giorno, nonostante il loro contatto permanente con i segmenti esterni. Questo suggerisce specifici meccanismi di regolazione che non sono ancora pienamente compresi.
Molte delle molecole implicati nel meccanismo RPE fagocitica sono stati identificati o convalidato grazie all'utilizzo di POS isolata e coltura cellulare saggi fagocitosi. Il recettore alphavbeta5 integrina situata sulla superficie cellulare apicale RPE, in coordinamento con il suo ligando MFG-E8, si lega selettivamente al POS 10-12, che vengono poi interiorizzata attraverso il MerTK tirosina chinasi del recettore 13-15. Il recettore scavenger CD36 ha dimostrato di partecipare aspirazione POS ed influenzare la velocità 16,17, e potrebbe essere utilizzato come sensore di fosfolipidi ossidati in superficie POS 18. Internalizzazione deve il reclutamento di F-actina citoscheletro-assproteine ociated quali annessina 2 19, miosina II 20 e miosina VIIA 21,22. Sono utilizzati anche POS Native o ossidato in vitro per capire invecchiamento fenotipi di cellule RPE in vivo legati all'accumulo di mal digerito POS ossidato 23-28. La generazione di cellule RPE derivate da cellule staminali ha avviato una nuova applicazione per POS isolati che vengono utilizzati per dimostrare la funzionalità delle cellule prima di essere trapiantate in animali o pazienti 29,30,27.
Prima descritto da Molday e colleghi nel 1987 31, il protocollo per l'isolamento di POS bovina combina un passo ultracentrifugazione di omogenati retiniche sui continui gradienti di saccarosio con l'osservazione del caratteristico aspetto arancione di greggi fotopigmento retinica (portando 11- retinica cis). Negli ultimi 10 anni, a causa di precauzioni prese, al fine di minimizzare il rischio di morbo della mucca pazza, l'uso degli occhi suina è diventato sempre più dinamicongly prominente. Il protocollo qui descritto viene illustrato come ottenere grandi quantità di POS da suina o bovina occhi che possono essere aliquotati e conservati per lunghi periodi di tempo. Questo elimina la necessità di preparare POS da occhi roditore, che richiede l'utilizzo di un gran numero di animali per la preparazione e il dosaggio POS 32,33,21,22. Inoltre, dettagli di etichettatura POS prima memorizzazione utilizzando molecole fluorescenti sono indicati, per quantificare e visualizzare POS in modo semplificato e comparabile per alcune applicazioni rispetto all'etichettatura POS dopo la fagocitosi dosaggio 32,10. Pertanto, queste grandi scorte consentono riproducibilità e facilità d'uso in molti diversi tipi di esperimenti.
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Protocol
Questo esperimento di isolamento POS richiede tempo e può richiedere fino a 12 ore per completare se POS sono etichettati prima di riporlo. Il protocollo è stato adattato da un documento pubblicato da RS Molday e colleghi nel 1987 31 e modificato da SC Finnemann e colleghi nel 1997 10.
Gli animali sono stati trattati secondo l'Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO) Dichiarazione per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research. Protocolli sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico Charles Darwin dell'Università Pierre e Marie Curie di Parigi-06 e la Istituzionale Animal Care and Use Committee Fordham University.
1. Generale Set Up
- Ottenere 80 fresche di maiale o vacca occhi fresco come appena dopo la macellazione possibile e tenerli freddo al buio. Fornire istruzioni al provider così l'azienda procede nello stesso modo. Questo protocollo è ottimizzato per 80 occhi. Aprocedere con più occhi e ottenere scorte più grandi (ad esempio, dal 160 occhi), il doppio della quantità di soluzione ed effettuare 2 giri di ultracentrifugazione; campioni piscina più tardi nella fase di raccolta (vedi punto 2.2.2).
- Impostare sulla panchina della lampada luce di sicurezza rossa, tamponi assorbenti, salviette (tavolo Materials). Preparare 15 centimetri piatti e sacchetti per la raccolta dei rifiuti a rischio biologico (parti dell'occhio inutilizzato, vetrose ...). Indossare aderente labcoat, guanti, protezioni maniche e occhiali.
- Precauzioni:
- Pre-raffreddare tutte le soluzioni poi tenerli freddo durante tutte le fasi. Mantenere occhi e gradienti raffreddata su ghiaccio per quanto possibile.
- Mantenere occhi e tessuti derivati nel buio più possibile fino alla fase di raccolta dopo l'ultracentrifugazione per evitare photobleaching di pigmenti visivi e della perdita del colore rosa-arancio della forma attiva della fotopigmenti.
2. Protocollo Azioni
- Preparare soluzioni e gradienti:
- Taurina Thaw magazzino completamente con un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Preparare tutte le soluzioni di soluzioni madre (Tabella 1, soluzioni di archivio) e mescolare bene il saccarosio con altri ingredienti con un agitatore magnetico per ogni soluzione.
- Preparare 15 ml della soluzione di omogeneizzazione ad una concentrazione finale del 20% di saccarosio, 20 mM Tris pH7.2 acetato, 2 mM MgCl 2, 10 mM glucosio e taurina 5 mM.
- Preparare la soluzione di saccarosio al 25% ad una concentrazione finale del 25% di saccarosio (utilizzando 70% stock saccarosio), 20 mM tris acetato pH 7,2, glucosio 10 mM e taurina 5 mM.
- Preparare la soluzione di saccarosio al 60% ad una concentrazione finale del 60% di saccarosio (utilizzando polvere saccarosio), 20 mM Tris pH7.2 acetato, glucosio 10 mM e taurina 5 mM.
- Preparare la soluzione di lavaggio 1 per una concentrazione finale di 20 mM acetato tris pH 7,2 e 5 taurina mm.
- Preparare la soluzione di lavaggio 2ad una concentrazione finale del 10% di saccarosio, 20 mM Tris acetato pH 7,2 e 5 mM taurina.
- Preparare la soluzione di lavaggio 3 ad una concentrazione finale del 10% di saccarosio, 20 mM sodio fosfato pH 7,2 taurina e 5 mM.
- Fissa Il creatore gradiente su un agitatore magnetico e inserire una ancoretta nella camera vicina all'uscita cui verrà inserita la soluzione al 60%. Utilizzare una cut-off punta P200 pipetta posto all'uscita del tubo per ottenere la corretta velocità di colata.
- Cast gradienti lineari delicatamente diluendo e agitando la soluzione di saccarosio del 60% a quello del 25% con 12 ml di ciascuna soluzione (cioè, totale 6 tubi per 80 occhi) in tubi ultracentrifuga pre-refrigerati. Mescolare bene la soluzione di saccarosio gradualmente-diluizione del 60%. Stazionario il gradiente di velocità del flusso, versando la soluzione uniformemente e non troppo veloce.
NOTA: Al fine di ottenere un continuo, gradiente lineare, mantenere l'apertura puntale destra alla superficie della soluzione per l'intero gradiente formation. - Lasciate che i gradienti sedersi sul ghiaccio per circa 1 ora per la stabilizzazione. Tenere i gradienti refrigerate fino caricato. Non agitare le provette per evitare di disturbare il gradiente.
- Collezione Tessuto:
- Raccogliere tessuti sotto fioca luce rossa. Dai un occhio in una mano e colpire la parte anteriore con bordo di lama di rasoio tenendo l'occhio lontano (per evitare spruzzi; Figura 1). Utilizzare la lama di rasoio per tagliare il bulbo oculare anteriore in 2 metà (cornea più di almeno 5 mm nella sclera). Rimuovere la lente e capovolgere l'oculare dentro e fuori in modo che possa essere tenuto sopra la punta di un dito esponendo così la retina.
- Utilizzando la lama di rasoio in un angolo, raschiare delicatamente la retina, staccando facilmente e costituirsi strato rosata, la superficie tapetum tagliati a testa del nervo ottico (Figura 1). Raccogliere tutte le retine in 2 x 50 ml tubetti contenenti ciascuno 15 ml di soluzione di omogeneizzazione sul ghiaccio.
- Homo Retinagenization:
- Agitare la sospensione vigorosamente a mano per 2 minuti per interrompere i diversi strati cellulari, rompere POS fuori dal resto della cellula PR, frammento POS e omogeneizzare la sospensione retina.
- Filtro 3x attraverso un doppio strato di garza pulita per rimuovere frammenti di tessuto di grandi dimensioni e raccogliere il flusso continuo in clean 50 ml tubi (Figura 1). La sospensione della retina di essere abbastanza spessa, per massimizzare la resa, premere delicatamente sulla garza per rilasciare rimanenti tessuti frammentati dopo ogni filtrazione.
- Fotorecettore esterno frammento segmento (POS) isolamento:
- Adagiare la retina preparazione greggio, intorno 6-7 ml per provetta, oltre 6 x 30 ml tubi ultracentrifuga ciascuno contenente 24 ml di fresche refrigerate continua 25 - 60% di saccarosio gradiente (Figura 1). Bilanciare i tubi opposte come appropriato per essere utilizzato il rotore. Ultracentrifuga a 106.000 xg per 50 min a 4 ° C. Rimuovere la maggior parte della soluzione sopra la banda rosa-arancio nel terzo superiore del gradiente per aspirazione (Figura 2A). Raccogliere la banda rosa-arancio con un cut-off P1000 punta in un bicchiere. Eliminare il riposo dopo neutralizzazione con candeggina (rifiuti biologici).
- Diluire con ~ 4 - 5 volumi di ghiacciata Wash 1 soluzione. Separare in altrettanti tubi 30 ml come necessario. Centrifugare a 3.000 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare con cautela il surnatante.
- Pellet Risospendere in 10 ml di Wash 2 soluzione e far girare a 3000 g per 10 minuti come descritto sopra. Risospendere pellet in 15 ml Lavare 3 e girano di nuovo a 3000 xg per 10 min. Combina le sospensioni da diverse pellet per ridurre il numero di tubi necessari prima della centrifugazione in Wash 2 e lavare 3 soluzioni.
- POS aliquotando senza etichettatura:
- Risospendere POS in 10-20 ml DMEM. Prediluito 10 ml in 490 microlitri DMEM (1:50) e contano allungata così come POS turbinava in uncamera di conteggio delle cellule (Figura 2B). Calcola la resa e la concentrazione in particelle POS per mL.
NOTA: La resa varia a seconda principalmente dall'età e ceppo di suini / mucche e dimensioni degli occhi, per esempio, una buona preparazione varia da 5 - occhi 8 x 10 9 POS da 80 suini. - Stabilire volume finale DMEM (tipicamente 10 - 20 ml) e aggiungere saccarosio per ottenere una concentrazione finale di 2,5% di saccarosio.
- Preparare aliquote della dimensione desiderata, ad esempio, 5 x 10 7 POS per provetta per un volume risospensione 2 ml per un esperimento a 96 pozzetti a 40 microlitri / pozzetto. Spin 1 aliquota per 5 min a 2300 xg a temperatura ambiente e valutare le dimensioni del pellet. Preparare varie dimensioni aliquote per i diversi volumi di applicazione come POS non deve essere congelato e scongelato due volte.
- Congelare aliquote POS a -80 ° C fino a nuovo uso.
NOTA: Aliquote sono stabili per molti mesi. Nelle nostre mani, senza etichetta o con etichetta POS può essere conservato per almeno un anno.
- Risospendere POS in 10-20 ml DMEM. Prediluito 10 ml in 490 microlitri DMEM (1:50) e contano allungata così come POS turbinava in uncamera di conteggio delle cellule (Figura 2B). Calcola la resa e la concentrazione in particelle POS per mL.
- Etichettatura POS e in aliquote:
NOTA: Usiamo tipicamente FITC etichettare POS per la quantificazione dei test di fagocitosi, ma altri coloranti possono essere utilizzati come pure a seconda delle esigenze.- Risospendere 1 10 mg FITC flaconcino a 2,5 mg / ml in concentrazione 0,1 M Na tampone carbonato pH 9,5 mescolando 2,6 ml 0,1 M NaHCO3 pH 8,4 con 1,4 ml di 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (Tabella 2, Soluzioni di riserva). Ruotare per 1 ora a temperatura ambiente, proteggendo dalla luce e girare per 5 minuti alla massima velocità per far sedimentare i solidi FITC non risospese.
- Risospendere il pellet POS in 10 ml di soluzione di lavaggio 3 (o DMEM) e aggiungere 2 ml di soluzione FITC per 80 occhi. Conservare rimasto FITC congelato a -80 ° C. Ruotare per almeno 1,5 ore a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio.
- Lavare POS etichettato due volte con soluzione di lavaggio 3 come descritto nel paragrafo 2.3.4, quindi una o due volte in DMEM fino quasi nessun FITC gratuito è visto nel surnatante fraction. Risospendere POS in DMEM e procedere come per il POS senza etichetta per il conteggio e la suddivisione in aliquote (sezione 2.4).
- Utilizzando POS in esperimenti:
- POS Scongelare a temperatura ambiente, e tenerli all'oscuro il più possibile se sono fluorescenza etichettati. Spin per 5 min a 2300 xga RT. Aspirare il surnatante.
- Subito risospendere in volume appropriato di soluzione di dosaggio come dettato dall'esperimento. In caso di diversi momenti della sfida POS, negozio risospeso POS a RT al buio tra i punti temporali per diverse ore.
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Representative Results
La combinazione del gradiente di saccarosio lineare e l'ultracentrifugazione permette la separazione dei vari componenti della sospensione retinica per densità. Cellule e detriti RPE grande retiniche pesanti si depositano o vicino al fondo del gradiente (Figura 2A). Accendino POS e cellule singole leggeri o detriti cellulari dalla retina migrano bande come separati per raggiungere la metà superiore del gradiente entro la fine del periodo di centrifugazione. Mantenendo gli occhi ed i campioni al buio fino a dopo la fase di centrifugazione, la band contenente POS può essere immediatamente riconosciuta per il suo brillante colore arancione. La larghezza e l'intensità di questa banda dipende qualità gradiente e altezza del tubo (89 mm di altezza è preferito). In genere, quando isolato correttamente POS dovrebbe apparire allungata, dritto o piegato quando osservate su un vetrino da microscopio (Figura 2B). A seconda del piano di fuoco sul microscopio, possono apparire spento o lucido. Se non Resuspended correttamente, rimarranno in gruppi. Se sono danneggiati (vedi paragrafo seguente), appariranno i pezzi più piccoli, un po 'come un' polveroso 'background.
I problemi che possono sorgere sono per lo più relativi a tre questioni. Il primo problema è possibile che la fase scuotimento dei omogenati retiniche non è abbastanza forti, che porta a POS rimangono aderenti al PRs quindi diminuita resa. Il secondo problema possibile è legata alla scarsa fusione gradiente o perdita di qualità sfumatura a tempo di stabilizzazione insufficiente prima di caricare o tubo eccessiva agitazione a qualsiasi passo prima della raccolta. In questo caso, le bande non possono essere chiaramente distinto e POS non possono essere raccolti nel tubo corrispondente. Infine, il terzo potenziale problema si pone se il pH di una delle soluzioni è sbagliato: le membrane POS può disintegrarsi e solo piccoli detriti POS sul microscopio appare quando li visualizzazione per la valutazione del rendimento.
Purificata POS puòessere utilizzato per diverse applicazioni relative a studiare la funzione fagocitica delle cellule RPE. Cellule RPE sono di solito usati come linee cellulari o in colture primarie di modelli animali 32,6,12,18-21. Più di recente, le cellule RPE derivate da cellule staminali riprogrammate come iPSC o ESC sono stati utilizzati 29,30,27,34. Isolati POS servono a testare direttamente la capacità fagocitica delle cellule RPE mutanti, ad esempio, POS sono facilmente fagocitato dalle cellule RPE primarie da topi wild-type, mentre le cellule di beta5 integrina e MFG-E8 topi knockout fagocitano meno POS nella stessa quantità di tempo 6,12. Quantificazione di POS fagocitosi può essere fatto sia contando marcata con FITC POS manualmente fotografie al microscopio 6 (Figura 3A), utilizzando apparecchiature in grado di leggere l'intensità di fluorescenza 10,24,15,35 o un citofluorimetro dopo tripsinizzazione delle cellule 36,27. Più di recente, l'assunzione di POS e il degrado è stato valutato on immunoblots sondato per opsine 37,38,27.
In vivo, il processo di assorbimento POS avviene in sequenza come riconoscimento / precede vincolanti sincronizzati internalizzazione 6. Le diverse fasi di assorbimento possono anche distinto in vitro utilizzando appropriate procedure sperimentali 39. Esperimenti Pulse-chase possono essere eseguite utilizzando interruttore termico: vincolante POS avviene a 20 ° C mentre interiorizzazione necessita di una temperatura di 37 ° C per procedere 32,40,7. Questa distinzione esiste anche in macrofagi, che possono riconoscere POS come bene e in cui il macchinario molecolare per eliminare le cellule apoptotiche è molto simile alle macchine del RPE 7. Dopo FITC-POS fagocitosi, rilegatura e internalizzazione può essere quantificata in campioni separati dalla tempra il FITC fluorescenza di POS-bound superficie durante la pre-incubazione con trypan blu prima di fissare le cellule 10. Nelle cellule trattate con blu Trypan, solo stagistaal POS verrà visualizzato, e POS legato può essere quantificato sottraendo POS interno dal totale conta POS fluorescenza. Quando fagocitosi è valutata immunoblots ottenuti con lisati raccolti dopo sfida POS, un trattamento equivalente con EDTA prima lisi permetterà il distacco di POS vincolati alla superficie cellulare per interno contro POS totale confronto fagocitosi 37,38.
Enormi progressi sono stati fatti nella identificazione dei macchinari fagocitaria grazie agli esperimenti che impiegano POS purificata. Proteine di reclutamento può essere valutata mediante saggi immunofluorescenza co-localizzazione 13-15,19-21,37,41 (Figura 3B). Assunzione di proteine o di attivazione possono essere convalidati sul immunoblots dopo immunoprecipitazione o verificando la fosforilazione 7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41 (Figura 3C). Studi più aperto sui cambiamenti globali di espressione genica dopo diverse ore del sfida POS hanno unLSO stata eseguita 42.
Isolato POS può anche essere usato per studiare l'eliminazione POS dalle cellule RPE. Infatti, durante il normale invecchiamento e / o quando POS non vengono digeriti correttamente, i prodotti di degradazione POS accumulano gradualmente come depositi di lipofuscina e possono portare a patologie a causa di meccanismi di ossidazione 24,27. Quindi, la comprensione degli effetti di luce e danno ossidativo correlato può richiedere POS sfida di cellule RPE 18,26. Infine, ripetuto alimentazione con normali 27 o ossidate 25,28 POS possono essere utilizzati per indurre effetti cumulativi in cellule RPE in coltura per comprendere meccanismi patologici che si sviluppano in vivo su periodi di tempo più lunghi.
Figura 1. Retina isolamento da occhi suini. Disegno che mostra le varie fasi della dissezione dell'occhio perraccogliere e omogeneizzare la retina prima della fase ultracentrifugazione su gradienti di saccarosio continuo, partendo in alto a sinistra. Una lama larga 60 millimetri è utilizzato per tagliare la sequenza occhio su un lato e poi l'altro per essere in grado di allungare dentro-fuori sulla punta di un dito, esponendo così la retina. Successivamente, la retina viene raccolto da demolizione dal tapetum con la lama. Retinae pool vengono poi agitata bene in tampone di omogeneizzazione, filtrato 3 volte attraverso doppi strati di garza e delicatamente versato sopra il 25 lineari - 60% gradiente di saccarosio.
Figura 2. purificazione POS da occhi suina (A) fotografia dei vari strati osservati su 25 -. Gradiente di saccarosio 60% dopo ultracentrifugazione di omogenati retina. La banda arancione corrisponde POS da raccogliere. Il bianco corrisponde banda superioreper materiali non legati POS, nonché rifiuti voluminosi migrazione accanto o sul fondo della provetta. (B) Immagine di isolato POS come osservato su un microscopio in campo chiaro su una cella di conteggio per la valutazione del rendimento. POS esiste in allungata (a, a ', c, d) e girava (a, a', b, b ', d) forme. Alcuni POS allungata in grado di visualizzare una estremità a spirale (c). Quando si cambia il piano di messa a fuoco, POS aspetto sposta dal lucido al buio (confrontare una e ', b e b'). Panel e illustra POS che non sono state risospese correttamente e risiedere in gruppi. Pannello f mostra POS che sono stati danneggiati e non sono utilizzabili, solo piccoli pezzi sono rilevabili. Scala 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Ficoure 3. Analisi della fagocitosi RPE utilizzando POS purificato. (A) immagine microscopio confocale e corrispondente quantificazione del numero di fagosomi per cella con tempo mostrano che FITC-marcato POS (verde) sono stati meno fagocitati dalle cellule primarie RPE isolate da beta5 integrina knockout (β5 - / -) rispetto ai topi wild-type (WT o β5 + / +) di controllo come indicato. Nuclei (rosso) sono stati etichettati con DAPI e giunzioni cellulari (blu) con il marcatore di giunzione a tenuta ZO-1. Scale bar 10 micron. . Tratto da © Nandrot et al, 2004, originariamente pubblicato su The Journal of Experimental Medicine 200 (12): 1539-1545. (B) le immagini confocale microscopio mostrano co-localizzazione (giallo-magenta, in basso pannello di destra) tra proteine β5-GFP fusione (verde, in alto a sinistra del pannello), αvβ5 superficie integrine recettori (rosso, in alto a destra del pannello) e POS (blu, fondopannello di sinistra). Scale bar 10 micron. . Tratto da Nandrot et al, 2012, pubblicato originariamente in Biologia della cellula 104 (6): 326-341, © Portland Press Limited. (C) Immunoblots (WB) e corrispondenti quantificazione (quantif.) Che mostra il fallo POS (POS) aumenta la fosforilazione di FAK sul residuo Tyr397 rispetto senza trattamento (/) o provocati con solo terreno (m) in cellule di controllo (c) mentre le cellule che esprimono una forma inattivata di FAK (F) non reagiscono, come indicato. Riprodotto da Finnemann 2003, pubblicato originariamente in EMBO Journal 22 (16):. 4143-4154 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2 Chamber gradient maker | Gradient maker with 30 ml chambers | ||
| 3 mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| Small size magnetic stir bar | Stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| Red safelight lamp | Inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm tubes | Beckman | 344058 | Ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | Ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | Swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | Fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| Counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| Dark ice buckets with lids | |||
| Scales | |||
| Magnetic stirrer and upholding pole | |||
| Refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| Labcoat | Health and safety | ||
| Gloves | |||
| Sleeve protectors | |||
| Goggles | |||
| Absorbent pads | |||
| Biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades | Dissection | 60 mm/2.25 inch wide razor blades | |
| 15 cm plastic dish | |||
| Sterile gauze sheets | |||
| 15 and 50 ml tubes | Common consumables | ||
| Microtubes | |||
| Aluminum foil | |||
References
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