Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
Transfection של DNA כבר לא יסולא בפז למדעים ביולוגיים ועם התקדמות שחלה באחרונה להכנות פרוסה מוח organotypic, ההשפעה של גנים שונים יכולה Heterologous כך להיחקר בקלות, תוך שמירה על היבטים רבים של הביולוגיה in vivo. יש כבר התעניינות גוברת לtransfect תאי עצב סופני הבדיל שלשיטות transfection קונבנציונליים היו כרוכות בקשיים, כגון תשואות נמוכות והפסדים משמעותיים ביכולת קיום. transfection biolistic יכול לעקוף רבים מהקשיים אלה עדיין רק לאחרונה טכניקה זו שונו כך שתהיה נוח לשימוש ברקמות של יונקים.
שינויים חדשים לתא המאיץ שיפרו את דיוק הירי של אקדח הגן והגדילו את מעמקיו של חדירה בעת גם מאפשר שימוש בלחץ נמוך יותר גז (50 psi) ללא אובדן יעילות transfection כמו גם מאפשרים התפשטות regioselective ממוקדת של הרשותrticles עד למרחק של 3 מ"מ. בנוסף, טכניקה זו היא ישר קדימה ומהר יותר לבצע מאשר microinjections מייגע. חולף וביטוי יציב שניהם אפשריים עם הפגזת חלקיק שבו ביטוי episomal יכול להתגלות בתוך 24 שעות והישרדות התא הוצגה להיות טוב יותר מאשר, או לפחות שווה ל, שיטות קונבנציונליות. טכניקה זו יש עם זאת יתרון אחד מכריע: הוא מאפשר transfection להיות מקומיים ברדיוס מאופק יחיד ובכך מאפשרים למשתמש לבודד מבחינה אנטומית ההשפעות של גן Heterologous. כאן אנו מציגים פרוטוקול לעומק להכין פרוסות organotypic מבוגרות קיימא ולשלוח אותם לregioselective transfection באמצעות אקדח גנים משופר.
במקור טכניקת biolistic, ביטוי Turn-of-ל" בליסטיקה הביולוגית ", הוקמה להעברת גנים בתיווך חלקיקים לתאי צמח 1. שיטה פיזית זה של שינוי התא מאיצה מיקרו או חלקיקים במהירות גבוהה כדי להתגבר על המחסומים הפיזיים של קרום התא אטום כדי לספק מטענים כגון DNA או צבעים. כי זה לא תלוי בליגנד-קולטנים ספציפיים ו / או את התכונות הביוכימיות בקרומי תא השטח, העברת גנים בתיווך חלקיק יכולה להיות מיושמת בקלות למגוון רחב של מערכות ביולוגיות כגון פרוסות מוח organotypic.
יש לי פרוסות organotypic באמצעות יתרונות על פני אחרים בפלטפורמות מבחנה שכן הם לשמור על מאפיינים אנטומיים ויוכימיים רבים כי הם רלוונטיים לin vivo הביולוגיה 2-4. פרוסות בעיקר לשמר את המאפיינים אדריכליים המקומיים משם יש להם המקור וpreserve פעילות וקישוריות של סינפסות neurochemical. השימוש בפרוסות מוח למחקר בסיסי, ובמאמצי תרופות, גדלו במקביל עם מספר המניפולציות ביוטכנולוגיים ניתן למדוד ולעקוב אחר ההתנהגויות הנוירוביולוגי של המוח בin vivo כמו הקשר 3,5-7. היתרונות העיקריים לשימוש במערכות מבוססת assay פרוס organotypic הוא שהיא מספקת שליטה ניסיונית קלה ומאפשרת מניפולציות מדויקות של סביבות תאיים.
פורה, מערכות תרבות הפרוסה organotypic הוקמו ממגוון רחב של אזורים במוח כגון, אך לא מוגבלת ל, קליפה, חוט השדרה, ו8-10 המוח הקטן. יתר על כן, מספר cocultures הוכח, המאפשר ההערכה של תקשורת בין תאית על פני אזורי מוח דיסטלי, כמו גם בין תאי עצב ותאים פתולוגיים 11,12. פרוטוקולים רבים כבר הוקמו ליםuccessfully פרוסות organotypic התרבות ויכול לשמור על יכולת קיום לטווח ארוך ורבים מחקרים שנעשה לאחרונה עם החברה לנצל את שיטות ממשק קרום ושינויים שונים לזה 13. עיקרון זה שומר את פרוסות organotypic בממשק שבין הבינוני והאווירה humidified של החממה על ידי הצבת את הפרוסות על מסנן קרום נקבובי. כך הבינוני יכול לספק חומרים מזינים מספיק כדי להאכיל את פרוסות organotypic באמצעות תנועת נימים. בדרך כלל פרוסות הוכנו מבעלי החיים המוקדמים שלאחר לידה (3 – בן 9 ימים; P3 – 9). עם זאת, רקמות מוח מפרוסות אלה להציג רמה גבוהה של גמישות סלולרית ויש לי התנגדות טבועה לחצים מכאניים, שהוא מועיל להשגת תרבויות קיימא, עדיין סינפסות הבוגרת ומעגלי neuroanatomical לא פיתחו באופן מלא בגוף חי עד 2 עד 3 שבועות של גיל 14. לדוגמא, תצפיות קודמות שהראו כי פרוסות בהיפוקמפוס המתקבלות מP0 – 1 ילודים, למרות שמאוד viable הבא הכנה, איבד בהדרגה חלק ממאפיינים מורפולוגיים. בעיקרו של דבר, הם הוצגו להיות מתאימים לטווח ארוך תרבויות המצביעות על תאים לא בוגרים נטו יותר דה להבחין בהשוואה לתרבויות organotypic מבעלי חיים מבוגרים 15,16. מסיבה זו השיטה שלנו כבר מותאמת לפרוסות מוח organotypic מבוגרות שבהתבגרות והתפתחות אדריכלית הגיעו שלבי המסוף שלהם 13,17-21. עם זאת, שיטה זו מתאימה גם לילוד ופרוסות organotypic לנוער.
ברגע שפרוסות organotypic קיימא הופקו כולו הצלחת המכילה את הפרוסות ניתן להביא להר biolistic והוגשה לregioselective משלוח וtransfection. הרכבה נכונה של אקדח הגן (כמתואר באיור 1), בכיוון 90 ° במרחק של 10 מ"מ ישירות מעל את הפרוסות (מהצוהר לרקמות), מאפשרת משלוח biolistic המהיר של 40 ננומטר ללכתחלקיקי ld מצופים מטענים. מטענים אלה כגון צבעים ווקטורי DNA ניאון, כמו גם כל גן של עניין, מועברים בקלות לתוך פרוסות קיימא בקלות. שיטה זו ובכך מתארת את הפרוטוקול נחוץ כדי לספק, באופן regioselective, חלקיקי זהב מטען מצופים לפרוסות מוח organotypic קיימא. קנה אקדח הגן וההרכבה אופטימלית שניתן לראות באיור 1. למידע נוסף לגבי בליסטיקה החבית והחלקיק השתפרה, אנא ראו אובריאן, et al. 17.
חידודים לאחר גם מצוינים עבור המשתמש כדי לייעל את התנאים כגון הכמות הנכונה של זהב נמסרה לאזור היעד, מוגדרת ככמות טוען microcarrier (MLQ), ולקבוע את הסכום של DNA הטעון למ"ג של זהב, שהוגדר כיחס טוען DNA (DLR). לפני מזרז DNA על חלקיקי זהב וטעינתם בצינורות TEFZEL שכולל מחסניות "אקדח הגן בפועל9 ;, יש צורך לחשב את כמות DNA והזהב הנדרשת לכל transfection שיכול להשתנות מעט בין רקמות ותנאים (יחס צריך להישמר בין מ"ג זהב 1 וDNA מיקרוגרם 1 עד 1: 5). זה חיוני כדי להכין את היחס הראוי של MLQ לDLR אחרת חלקיקי זהב DNA מצופים יכולים לדבוק יחד יוצרים גדול יותר ממסכת צפויה, אשר יכול להפחית את ההומוגניות הכוללת של התפשטות biolistic כמו גם נזק ורעיל רקמת גידול.
שיטה זו מציגה את השיפורים האחרונים במסירת biolistic, שנבדקו ונקבעו להיות נוח עבור פרוסות מוח organotypic בילוד, לנוער ולמבוגרים. יתר על כן, על ידי ניצול התפשטות biolistic המופחת של קנה רובה הגן, המשתמש יכול transfect סלקטיבי אזור דייקן במוח עכשיו. בעקבות זמן הדגירה המתאים, הביטוי של חלבוני הניאון, אשר מגיע שיעורים מרביים בין 24 ו48שעה, ניתן דמיינה ידי epifluorescence ומיקרוסקופיה confocal. fluorophores אלו מאפשר ניתוח הצורני ולוקליזציה של תאים בודדים בתוך מבנים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. עם זאת, אפנון regioselective של פרוסות organotypic על ידי הגנים Heterologous אחרים יכול גם להיות במעקב על ידי בדיקות אחרות ניתנות להכנות אלה. אסטרטגיות עבודה אפשריות למסירת הגן המקומית מוצגות באיור 2.
הפרוטוקול מתאר גישות כדי לספק צבעים וחומרים גנטיים לפרוסות organotypic מבוגרות באמצעות אקדח גנים משופר. בעיקרו של דבר, הסוגים של צבעים והמגוון הרחב של גנים אפשריים לעשות בשיטה זו רבת פנים ונוחים לענות למגוון רחב של שאלות ביולוגיות. שיטת הצגת regioselective משמשת, במקרה זה לאזור מסוים במוח, פותחת אפיקים חדשים לניסויים כאפנון גן Heterologous של אזורים מקומיים בתוך ארכיטקטורה רלוונטית מבחינה ביולוגית לא היה בקלות אפשרית לפני. יש לנו נקבעו בעבר כי שיטה זו ניתן להשתמש בפרוסות organotypic מבוגרות, שבו סינפסות בוגרות נוצרות באופן מלא, כפי שהראה הישרדות תא משופרת וביטוי גני Heterologous לשבועות רבים 13. עם כניסתו של תנאים חדשים ומשופרים תרבות למוח של יונקים, כמו גם רקמות אחרות, השימוש במודולציות גנטית regioselective תהפוך שימושית יותר ויותר עבור מגוון רחב של biocheמיכל ניתוחים.
כפי שמדגישים כאן ובעבר הוזכר על ידי אחרים 24, גורמים רבים ושונים יכולים בקלות להשפיע על הדיוק והמהימנות של מסירת biolistic. ראשית, הכנת חלקיקי הזהב קשור לצבעים או DNA חייב להיות מאוזנת במידה מספקת כדי למנוע הצטברות וכדי להקל על גירוש מטען מחסנית. סידן וspermidine בפתרון חלקיקי מיקרו DNA-זהב יכולים לסייע המחייב של מולקולות דנ"א לחלקיקי זהב. היכולת לחלקיקים לחדור את התאים תחת לחץ מופחת נקבעה בעבר 17. שנית, אקדח הגן חייב להיות מותקן יציב ככל האפשר עם הזווית ומרחק הנכונים. מד לחץ אמין הוא גם הכרחי לשחזור, כדי לשמור על שלמות רקמה, וכדי להאיץ כראוי חלקיקי זהב למטרות שלהם נועדו. ואכן, המרחק, הכיוון, והיציבות של הציוד גם גורמים מכריעים לtargeting ודיוק של משלוח regioselective. כמבנים מוחיים אלה הם קטנים מאוד, שינויים קלים בזווית הירי יכולים היו בקלות להפוך את ההליך כולו פחות אמין. ולבסוף, ההכנה והתחזוקה של פרוסות organotypic קיימא כבר כרוכה בקשיים במשך עשורים רבים עדיין פרוטוקולים בשפע ואמינים לבעלי חיים שונים, אזורים במוח, גילים וcocultures זמינים כעת 2,4,25,26. נהלים אלה צריכים להיות לפני הגשת הרקמות לפרוצדורות biolistic-מותאם משתמש. זה יותר בקלות יאפשר למשתמש להעריך את השפעתה של חלקיקי biolistic וההשפעה של הגן Heterologous על התרבויות שלהם unbiasedly. לשם כך, השימוש בגני ניאון כגון EYFP וEGFP יכולים גם מאפשרים למשתמש רומן כדי לבדוק את דיוק המיקוד וגם לבצע את הכדאיות הסלולרית דרך ביטוי גני Heterologous על פני תקופה ממושכת של זמן 13. רבים מהצעדים הקריטיים לאמיניםושימוש לשחזור של פרוטוקול זה מודגשים בשלוש הפסקאות הבאות.
לtransfection יעיל, ריכוז DNA חייב להיות מתאים. ריכוזים נמוכים מדי ימנעו את תשואת transfection בעוד ריכוזים גבוהים מדי עלולים לגרום להצטברות של חלקיקים. מצרפים של זהב יכולים להפחית באופן דרמטי את יעילות transfection, לגרום להפצות לא אחידות, ויכולים להוביל לרעיל מוגברים וסטרס חמצונים. בעיות עם יעילות ציפוי צפויות בשל פקיעת תוקפו של פתרון spermidine (יש להחליף כל 2 עד 3 חודשים). להתפשטות biolistic נאותה, התיוג חייב להיות אפילו. תיוג הלא הומוגנית של ההשעיה חלקיק זהב / DNA יכול להיות בגלל פתרון PVP. גם זה צריך להיות מוחלף כל 2 עד 3 חודשים. ציפוי של חלקיקי הזהב ניתן לראות על ג'ל אלקטרופורזה agarose כלהקת MW גבוהה 27.
כל syst הביולוגישלהם תחת חקירה, כמו גם כל מכשיר אחר המשמש עשוי לדרוש שינויים קטנים בלחץ גז כדי להגיע לרמות מותאמות של transfection והתפשטות biolistic. הפרמטר הקריטי הוא הלחץ של דופק הליום נדרש להתפשט מיקרו או ננו נשאים ממחסנית הפלסטיק ולהניע אותם לרקמה. לחץ גז גבוה ישפיע הישרדות תא, משום שהיא תיצור גלי הלם על פני היעד ולשבש או לנתק את הרקמה מהמטריצה 17. מכוון את קנה רובה גן ויש להם המנגנון בדיוק בניצב לרקמה חשוב למסירת biolistic מדויקת. האזור שנבחר צריך להיות ממוקם במרכז הישיר של החבית בדיוק 10 מ"מ מהפתח החיצוני. התוצאה היא בקוטר 3 מ"מ של משלוח חלקיקי זהב סביב מוקד הרעש. קנה אקדח הגן יש לנקות עם אתנול 70% לאחר כל שימוש. כדי להגן על הרקמות מאגרגטים חלקיקים גדולים, החבית מכילה גם רשת ניילון שshoULD להיות מוחלף באופן קבוע כדי לשמור על רמת ביצועים אופטימליים. על מנת להחליף את הרשת לפתוח את המכסה ואז להכניס רשת ניילון חדשה בין הכובע וO-הטבעת.
Fluorescently תאים שכותרתו צריכים להיות גלויים לפחות 1 – 2 ימים לאחר transfection סביב המוקד. עדר או חוסר תיאום של תיוג יכול להיגרם כתוצאה מהכנה וחוסר היציבות מספקת של הרכבת אקדח הגן. התצפיות של תאים באמצעות מיקרוסקופיה confocal תלויה במספר הגורמים: אורך הגל של אור עירור / הפליטה, גודל חריר, NA של העדשה האובייקטיבית, מקדם שבירה של רכיבים בנתיב האור, עומק הרקמה, והיישור של המכשיר. גורמים אלו צריכים להיות מותאמים לכל מערכת תחת חקירה.
התקדמות שחלה באחרונה בbiolistics נוצלה להצלחה של שיטה זו. קנה אקדח הגן שימש במחקר זה היה שונה על מנת להפחית את הלחץ הדרוש, כמו גם לנתב biolisticדפוס פיזור לאזור יותר מוגבל וספציפי 17,19. שינויי חבית אחרים לא ניסו להגביל את התפשטות biolistic ולהפחית את לחץ יצוא 28 עדיין חבית זו מעוצבת בהתאמה אישית גן האקדח תוכננה על ידי ד"ר אובריאן היא מצויד לאקדח הליוס ג'ין הסטנדרטי רכיב בודד. בהמשך לכך, חלקיקי זהב תת מיקרומטר שמשו כדי להפחית את הפולשנות של חלקיקי מיקרומטר שקבענו בעבר שנגרמו נזק לתאים וסופו של דבר, אובדן של ביטוי גני Heterologous המתמשך. שינויים אלה להליך biolistic שיפרו את ההיתכנות ואת שחזור הכולל של השיטה 13. שיפורים אחרים בהכנת פרוסה כגון פתרון בעיות מעמיקות של הליך החיתוך, באמצעות מטריצת DMEM-Agarose לשמר את המוח, והתקדמות שימושית רבות אחרת בהכנת פרוסה מוח organotypic שדווחו בעבר 13 אפשרו לנו לחקור את השימוש בפרוסות מבוגרות ש פיתח בוגררשתות הסינפטי.
במחקר שלנו אנו משמשים בעיקר צבעים והגנים Heterologous ניאון לדמיין מורפולוגיה של תאים כקריאה על יעילות transfection ויכולת תמונת המאפיינים מורפולוגיים של תאי עצב ברקמות מוח עכבר. יחס האות לרעש של המשלוח סטוכסטיים ברדיוס מוגדר אפשרה לנו לבודד את נמל dentritic של תא בודד לחלוטין בהקשר המקורי שלו. מאמצים רבים נעשו שימוש כדי לחקור מאפיינים מורפולוגיים אלה, 'connectomics' המיפוי או לתייג תאים בודדים עבור ניתוחים שונים, שיטה זו יכולה היתה בקלות להיות משולבת עם פרוטוקולים קיימים כגון מדידות אלקטרופיזיולוגיה וneurite 29,30. ככל הנראה, שילוב של גני Heterologous ניאון יכול לאפשר הרבה יותר חזק תיחום של תאים בודדים כהפצה סטוכסטיים של חלבוני ניאון, והשילוב שלהם היה לקבוע את הצבע של התאים הבודדים 31,32. השימוש במקדמי תא ספציפיים כגון synapsin וחלבון חומצת fibrillary גליה במעלה הזרם של אקסון גן Heterologous יכול גם להגביל את הביטוי לאוכלוסיות 33. ואכן, מגוון בלתי פוסק של חומר גנטי יכול גם להיות מועבר באופן regioselective על ידי חלקיקי זהב תוך שימוש באותו הליך זה. סך הכל transfected האזורים ובכך יכולים להיות מנותחים בשיטות מסורתיות, כגון נתיחה והגשת שהאזור לimmunoblotting המערבי כדי לנתח את ההשפעות נקודתיות של גן Heterologous.
שיפורים בנהלים פרוס organotypic גם יאפשר שימוש רחב יותר של רקמות מוח לניסויים לטווח ארוך, כמו גם היתר השימוש ברקמות וcocultures אחרים והיה להקל על הליכי transfection. שומנים בדם וtransfection פולימר כבר דיווחו בעבר להשפיע על הומאוסטזיס קרום, הפנמה, חדירות חלבון 34 ולעתים קרובות להראות יעילות נמוכה מאוד לtransfect terminally מובחן תאי עצב. מיקוד מטען ספציפי תא הוא גם נוח רק לתאים המבטאים את הקולטנים בתא השטח דרושים להפנמה, ולמרות ששיטה זו יכולה להיות מאוד סלקטיבית, יכול לחסור ממוקד זה regioselectivity 35. וקטורים ויראליים אחרים הם לעתים קרובות קשים ויקרים לייצור, דורשים תקנות מחמירות ויש מדי פעם הפגינו חששות בטיחות. לכן יש משלוח Biolistic יכולת שאין כמו transfect regioselectively נוירונים וסוגי תאים אחרים בתוך רקמות קיימא. כזהב הוא לא התקדמות רעילה, נוספת בשימוש בbiolistics יכולה לסלול את הדרך לשימושים ביו כגון משלוח דרך העור תרופות, in vivo מסירת גן לא פולשנית, כמו גם טיפולי גן nonviral מקומיים.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לסדנת MRC-LMB לייצור חבית אקדח גן המשופר. כמו כן, אנו רוצים להודות לד"ר דוד ר 'Hampson באוניברסיטת טורונטו לשימוש בציוד ובמשאבים.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |