Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
Transfectie van DNA van onschatbare waarde voor biologische wetenschappen en recente vorderingen op organotypische brain slice preparaten zijn, het effect van verschillende heterologe genen kan dus gemakkelijk onderzocht met behoud van vele aspecten van in vivo biologie. Er is steeds meer interesse geweest om terminaal gedifferentieerde neuronen waarvoor conventionele transfectie methoden zijn beladen met moeilijkheden geweest, zoals lage opbrengsten en een aanzienlijk verlies in levensvatbaarheid transfecteren. Biolistische transfectie kan omringen deze problemen maar pas onlangs deze techniek aangepast zodat het vatbaar voor gebruik in zoogdierlijke weefsels.
Nieuwe veranderingen van het gaspedaal kamer hebben nauwkeurigheid afvuren het gen pistool verbeterde en verhoogde de diepte van penetratie, terwijl ook de mogelijkheid voor het gebruik van lagere gasdruk (50 psi) zonder verlies van transfectie-efficiëntie alsook op een gerichte regioselectieve spreiding van de partikelen binnen 3 mm. Daarnaast is deze techniek is eenvoudig en sneller worden uitgevoerd dan vervelende micro-injecties. Zowel de tijdelijke als stabiele expressie mogelijk met nanodeeltjes bombardement waar episomale expressie kan worden opgespoord binnen 24 uur en celoverleving bleek beter dan of ten minste gelijk aan conventionele methoden. Deze techniek heeft echter een belangrijk voordeel: het maakt het mogelijk de transfectie te worden gelokaliseerd binnen een enkele ingetogen straal waardoor de gebruiker in staat om de effecten van het heterologe gen anatomisch isoleren. Hier presenteren we een diepgaande protocol om levensvatbare volwassen organotypische plakjes bereiden en legt deze voor aan transfectie Regioselectieve behulp van een verbeterde gen pistool.
Oorspronkelijk werd de biolistische techniek, een draai-van-zin voor "biologische ballistiek", werd opgericht voor-deeltje gemedieerde genoverdracht in plantencellen 1. Deze fysieke Werkwijze celtransformatie versnelt micro of nanodeeltjes met hoge snelheid naar de fysieke grenzen van de niet-doorlaatbare celmembranen om ladingen zoals DNA of kleurstoffen leveren overwinnen. Omdat het niet door specifieke ligand-receptoren en / of biochemische eigenschappen op het celoppervlak membranen, kunnen deeltjes-gemedieerde genoverdracht gemakkelijk worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen zoals organotypische hersencoupes.
Met behulp van organotypische plakjes hebben voordelen ten opzichte van andere in vitro platforms, omdat ze te behouden vele anatomische en biochemische eigenschappen die relevant zijn voor in vivo biologie 2-4 zijn. De plakjes vooral de instandhouding van het lokale architectonische kenmerken van waar zij zijn ontstaan en preserve neurochemische activiteit en connectiviteit van de synapsen. Het gebruik van de hersenen plakjes voor fundamenteel onderzoek, en in de farmaceutische inspanningen, heeft gelijktijdig verhoogd met het aantal mogelijke biotechnologische manipulaties te meten en monitoren van de neurobiologische gedrag van de hersenen in een in vivo als context 3,5-7. De belangrijkste voordelen voor het gebruik organotypische slice gebaseerde testsystemen is dat het eenvoudig experimentele controle en is nauwkeurige manipulaties van extracellulaire omgeving.
Vruchtbaar zijn organotypische slice cultuur systemen ontwikkeld uit verschillende hersengebieden zoals, maar niet beperkt tot, de cortex, ruggenmerg en cerebellum 8-10. Daarnaast is een aantal hulpkweken aangetoond, dat de beoordeling van intercellulaire communicatie tussen distale hersengebieden en tussen neuronen en pathologische cellen 11,12 toestaan. Veel protocollen zijn al ingesteld op successfully cultuur organotypische plakjes en kunnen levensvatbaarheid op lange termijn te behouden en vele recente studies nu gebruik maken van het membraan-interface methodes en diverse aanpassingen aan het 13. Dit principe houdt de organotypische plakken aan het grensvlak tussen het medium en bevochtigde atmosfeer van de incubator door het plaatsen van de plakjes op een poreus membraan filter. Het medium kan dus voldoende voedingsstoffen naar de organotypische plakjes waarbij via capillaire beweging. Typisch plakjes werden bereid uit de vroege postnatale dieren (3-9 dagen oud; P3 – 9). Echter, hersenweefsel van deze segmenten vertonen een hoge mate van cellulaire plasticiteit en een inherente bestandheid tegen mechanische spanningen, die nuttig levensvatbare kweken verkrijgen, toch volwassen synapsen en neuroanatomisch circuits niet volledig ontwikkeld in vivo tot 2 tot 3 weken oud 14. Bijvoorbeeld, had vorige observaties laten zien dat de hippocampus plakjes verkregen uit P0 – 1 pasgeborenen, hoewel zeer VIABle na de bereiding, verloor een aantal morfologische kenmerken. Wezen, werden ze getoond ongeschikt voor de lange termijn culturen suggereert onrijpe cellen zijn, hadden meer kans om de-differentiëren ten opzichte van organotypische culturen uit oudere dieren 15,16. Daarom onze methode is geoptimaliseerd voor volwassen organotypische hersencoupes waarbij rijping en architectuurontwikkeling de eindstadia 13,17-21 bereikt. Toch is deze werkwijze ook geschikt voor pasgeborenen en jonge organotypische plakjes.
Zodra de levensvatbare organotypische plakjes zijn geproduceerd de hele plaat met de schijfjes kan met de biolistische mount worden gebracht en voorgelegd aan de levering en transfectie regioselectieve. Een goede bevestiging van het genenkanon (zoals beschreven in figuur 1), 90 ° ten op een afstand van 10 mm direct over de segmenten (van het diafragma op het weefsel), maakt de snelle biolistische levering van de 40 nm gaanld deeltje gecoat ladingen. Deze ladingen zoals kleurstoffen en fluorescerende DNA vectoren, alsmede gen van belang, worden gemakkelijk afgegeven in de levensvatbare plakjes met gemak. Deze methode beschrijft dus het protocol nodig is om te leveren, in een regioselectieve manier lading goud gecoate nanodeeltjes in levensvatbare organotypische plakjes hersenen. Het gen geweerloop en optimale bevestiging is te zien in figuur 1. Meer informatie over de verbeterde loop en nanodeeltjes ballistiek Zie O'Brien, et al. 17.
Latere verfijningen worden ook geïndiceerd voor de gebruiker te optimaliseren zoals de goede hoeveelheid goud geleverd per doelgebied, gedefinieerd als microdrager geladen Hoeveelheid (MLQ), en de hoeveelheid DNA per mg goud beladen, gedefinieerd als DNA beladingsgraad bepalen (DLR). Voorafgaand aan het neerslaan van DNA op gouddeeltjes en ze in de Tefzel slangen die cartridges de eigenlijke gen pistool 'bestaat9 ;, moet de hoeveelheid DNA en goud voor elke transfectie die enigszins kunnen verschillen tussen weefsels en condities berekenen (verhouding wordt gehouden tussen 1 mg goud en 1 ug DNA tot 1: 5). Het is essentieel om de juiste verhouding van MLQ bereiden op DLR anders DNA-gecoate gouddeeltjes kon aaneenhechten vormen groter dan verwacht agglomeratie, die de totale homogeniteit van het biolistische verspreiding en kan verminderen als schade toename weefsel en cytotoxiciteit.
Deze methode geeft de recente verbeteringen in biolistische levering, die zijn getest en bepaald vatbaar voor pasgeborenen, jeugdige en volwassen organotypische plakjes hersenen te zijn. Bovendien, door gebruik te maken van het gen geweerloop's verminderd biolistische spreiding, de gebruiker is nu in staat om selectief te transfecteren een punctuele regio in de hersenen. Na de geschikte incubatietijd, de expressie van het fluorescerende eiwitten, waarbij de maximale weer tussen 24 en 48 bereikthr, kunnen worden gevisualiseerd door epifluorescentie en confocale microscopie. Deze fluoroforen maken de morfologische analyse en lokalisatie van afzonderlijke cellen in biologisch relevante structuren. Echter, de regioselectieve modulatie van de organotypische plakjes andere heterologe genen worden gecontroleerd door andere proeven vatbaar voor deze preparaten. Mogelijke werken strategieën voor de gelokaliseerde genafgifte zijn weergegeven in figuur 2.
Het protocol beschrijft benaderingen kleurstoffen en genetisch materiaal in volwassen organotypische plakjes leveren met een verbeterde genpistool. In wezen, de soorten kleurstoffen en de vele mogelijke genen methode veelzijdige en vatbaar voor uiteenlopende biologische vragen. De regioselectieve levering methode gebruikt, in dit geval aan specifieke regio hersenen, opent nieuwe wegen voor experimenten als heterologe gen modulatie van gelokaliseerde gebieden binnen een biologisch relevante architectuur heeft niet eerder gemakkelijk haalbaar geweest. We hebben eerder vastgesteld dat deze werkwijze kan worden toegepast op volwassen organotypische segmenten, waarbij volwassen synapsen volledig gevormd, zoals bleek verbeterde celoverleving en heterologe genexpressie wekenlang 13. Met de komst van nieuwe en verbeterde kweekomstandigheden voor zoogdierlijke hersenen en andere weefsels, zal het gebruik van regioselectieve genetische modulaties steeds bruikbaar voor allerlei Bioche gewordensche analyses.
Zoals we hier eerder en zorgen voor het propageren door anderen 24 gasten, kan veel verschillende factoren direct van invloed op de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van biolistische levering. Ten eerste moet de bereiding van het goud deeltje verbonden kleurstoffen of DNA adequaat evenwicht gehouden om aggregatie te voorkomen en de cartridge lading uitzetting te vergemakkelijken. Calcium en spermidine in de DNA-gouden microdeeltjes oplossing kan helpen de binding van DNA moleculen aan het goud nanodeeltjes. Het vermogen van de nanodeeltjes aan de cellen penetreren onder verminderde druk werd vooraf bepaalde 17. Ten tweede moet het gen pistool zo stabiel mogelijk gemonteerd met de juiste hoek en afstand. Een betrouwbare manometer is ook noodzakelijk voor reproduceerbaarheid, met weefselintegriteit te behouden en om de gouddeeltjes hun beoogde doelen behoren versnellen. Inderdaad, de afstand, oriëntatie, en de stabiliteit van de apparatuur zijn ook een cruciale factoren voor de targeting en nauwkeurigheid van regioselectieve levering. Aangezien deze hersenstructuren zijn erg klein, kunnen kleine variaties in de aansnijhoek gemakkelijk de gehele procedure minder betrouwbaar maken. Tenslotte, de bereiding en het onderhoud van levensvatbare organotypische plakjes werden beladen met problemen voor vele decennia nog overvloedig en betrouwbare protocollen voor verschillende dieren, hersengebieden, leeftijden en hulpkweken beschikbaar 2,4,25,26. Deze procedures moeten door de gebruiker geoptimaliseerd voor het indienen van de weefsels te biolistische procedures. Dit zal gemakkelijker de gebruiker mogelijk om het effect van de biolistische deeltjes en het effect van het heterologe gen op hun eigen cultuur unbiasedly bepalen. Hiertoe kan het gebruik van fluorescerende genen zoals EYFP en EGFP zowel mogelijk een nieuwe gebruiker het richtende nauwkeurigheid testen en volgen ook de cellulaire levensvatbaarheid door heterologe genexpressie gedurende langere tijd 13. Veel van de kritische stappen voor betrouwbareen reproduceerbare gebruik van dit protocol worden gemarkeerd in de volgende drie alinea's.
Voor een efficiënte transfectie, moet de DNA-concentratie geschikt. Concentraties te lage opbrengst zou de transfectie worden gehinderd concentraties te hoge agglomeratie van de nanodeeltjes kan veroorzaken. Aggregaten van goud kan drastisch verminderen transfectie-efficiëntie, veroorzaakt ongelijkmatige verdelingen, en kan leiden tot verhoogde cytotoxiciteit en oxidatieve stress. Problemen met coating efficiency waarschijnlijk vanwege het verstrijken van het spermidine-oplossing (moeten elke 2 tot 3 maanden worden vervangen). Voor een adequate biolistische spread moet het etiket zelfs. Een niet-homogene kenmerken van de gouden nanodeeltjes / DNA suspensie kan door de PVP-oplossing. Ook dient elke 2 tot 3 maanden worden vervangen. Coating van de gouden nanodeeltjes te zien op agarose gelelektroforese als hogere MW-band 27.
Elke biologische system in onderzoek evenals alle verschillende instrumenten gebruikt kunnen kleine veranderingen in gasdruk nodig om optimale niveaus van transfectie en biolistische spreiding te bereiken. De kritische parameter is de druk van het helium puls vereist het micro-of nano-dragers van het plastic cartridge strip en deze voortbewegen in het weefsel. Een hoge gasdruk beïnvloedt celoverleving, omdat schokgolven over het doel zal creëren en verstoren of los weefsel van de matrix 17. Richten het gen geweerloop en met de inrichting exact loodrecht op het weefsel van belang voor een nauwkeurige biolistische levering. De geselecteerde gebied moet in het directe midden van het vat worden geplaatst precies 10 mm van de buitenste opening. Dit resulteert in een 3 mm diameter gouddeeltje levering rond het epicentrum. Het gen geweerloop reinigen met 70% ethanol na gebruik. Om het weefsel van grote deeltjesaggregaten beschermen, de loop bevat ook een nylon mesh die should regelmatig worden vervangen om optimale prestaties te behouden. Met het oog op vervanging van het gaas draai de dop en plaats vervolgens een nieuwe nylon gaas tussen de kap en de O-ring.
Fluorescent gelabelde cellen moet zichtbaar zijn minimaal 1 – 2 dagen na transfectie rond het epicentrum. Afwezigheid of verkeerde uitlijning van de etikettering kunnen het gevolg zijn van onvoldoende voorbereiding en instabiliteit van het gen pistool montage. De opmerkingen van cellen met confocale microscopie afhankelijk van een aantal factoren: de golflengte van de excitatie / emissie licht, pinhole grootte NA van de objectieflens brekingsindex van componenten in het lichtpad, de diepte van het weefsel, en de aanpassing van het instrument. Deze factoren worden geoptimaliseerd voor elk systeem onderzocht.
Recente ontwikkelingen in biolistiek uitgebuit voor het succes van deze werkwijze. Het gen geweerloop in deze studie werd gewijzigd om de nodige druk te verlagen en de trechter biolistischescatter patroon in een bepaald gebied beperkt en 17,19. Andere vat wijzigingen geprobeerd de biolistische verspreiding beperken en verminderen de uitstroom druk 28 Nog dit douane ontworpen gen gun barrel gemaakt door Dr O'Brien een los onderdeel ingericht als de Helios Gene gun. Vervolgens werden sub-micrometer gouddeeltjes gebruikt om de invasiviteit van micrometer deeltjes die we eerder vastgestelde vermindering veroorzaakte cellulaire schade en uiteindelijk verlies van aanhoudende heterologe genexpressie. Deze wijzigingen in de biolistische procedure verbeterd de algehele haalbaarheid en de reproduceerbaarheid van de methode 13. Andere verbeteringen op segment preparaat zoals grondig oplossen van het snijden procedure, met een DMEM-Agarose matrix naar de hersenen te behouden, en talrijke andere bruikbare ontwikkelingen in organotypische brain slice voorbereiding eerder beschreven 13 konden we het gebruik van volwassen segmenten exploreren hebben volwassen ontwikkeldsynaptische netwerken.
In onze studie hebben we voornamelijk kleurstoffen en fluorescerende heterologe genen celmorfologie visualiseren als een uitlezing voor transfectie-efficiëntie en het vermogen om het beeld morfologische kenmerken van neuronen in muizenhersenen weefsels. De signaal-ruisverhouding van het stochastische levering binnen een bepaalde straal konden wij loskoppelen dendritische haven een enkele cel in zijn natuurlijke context. Aangezien talrijke inspanningen worden gebruikt om deze morfologische onderzoeken mapping 'connectomics' of enkele cellen label voor verschillende analyses kan deze werkwijze eenvoudig worden gecombineerd met de bestaande protocollen zoals elektrofysiologische metingen en neuriet 29,30. Blijkbaar kunnen combinaties van fluorescente heterologe genen veel robuuster afbakening van afzonderlijke cellen zoals de stochastische verdeling van fluorescerende eiwitten mogelijk, en de combinatie zou de kleur van de individuele cellen 31,32 bepalen. Het gebruik van celspecifieke promoters zoals synapsin en gliale fibrillaire zure proteïne stroomopwaarts van het heterologe gen exon kan ook de expressie subpopulaties 33 beperken. Inderdaad, de oneindige verscheidenheid van genetisch materiaal kan ook in een regioselectieve manier uit met goud nanodeeltjes met dezelfde procedure. De totale getransfecteerde regio dus kan worden geanalyseerd met traditionele methoden, zoals dissectie en het indienen van die regio om de westerse immunoblottingtest naar de gelokaliseerde effect van het heterologe gen te analyseren.
Verbeteringen in organotypische slice procedures ook in staat ruimer gebruik van hersenweefsel langdurig experimenteren en het gebruik toestaan van andere weefsels en hulpkweken en zou transfectie te vergemakkelijken. Lipide en polymeer transfectie zijn eerder gerapporteerd membraan homeostase, internalisatie, eiwit permeabiliteit beïnvloeden 34 Vaak vertonen zeer lage efficiëntie te transfecterenrminally gedifferentieerde neuronen. Celspecifieke targeting lading is vatbaar alleen cellen die het celoppervlak receptoren nodig voor internalisatie drukken, en hoewel deze werkwijze zeer selectief is, kan het ontberen gericht regioselectiviteit 35. Virale vectoren anders zijn vaak moeilijk en kostbaar om te produceren, moeten strengere regelgeving en hebben soms gedemonstreerd bezorgdheid over de veiligheid. Biolistische aflevering heeft dus een ongeëvenaarde mogelijkheid om regioselectief transfecteren neuronen en andere celtypes binnen levensvatbare weefsels. Aangezien goud is niet giftig, verdere vooruitgang in het gebruik van biolistiek kan de weg voor biomedische toepassingen zoals transdermale farmaceutische levering invasieve in vivo gentherapie, als lokaal virale gentherapie effenen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag de MRC-LMB workshop bedanken voor de productie van de verbeterde gen geweerloop. Wij zouden ook graag Dr David R. Hampson danken aan de Universiteit van Toronto voor het gebruik van apparatuur en middelen.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |