Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
생체 생물학의 여러 측면을 유지하면서, DNA의 형질 생물학 및 뇌 슬라이스의 Organotypic 제제로 최근 발전으로 귀중한왔다 다양한 이종 유전자의 효과는 따라서 용이하게 조사 할 수있다. 기존의 형질 전환 방법은 낮은 수율과 생존에 상당한 손실로 어려움을 내포왔다있는 말기 차별화 된 신경 세포를 트랜 관심이 증가되고있다. 과 유전자 형질 감염은 포유 동물 조직에서의 사용을위한 의무가되도록 이러한 어려움의 많은 또 최근에이 기법이 수정 된 피할 수있다.
가속기 실 뉴 변형 유전자 총의 발사의 정확도를 개선하고 또한 형질 전환 효율의 손실없이 더 낮은 가스 압력 (50 PSI)의 사용을 허용하면서 침투의 깊이를 증가뿐만 아니라 PA의 포커스 위치 선택적 확산을 허용했다3mm 이내 rticles. 또한,이 기술은 곧장 앞으로 빠르게 지루한 microinjections보다 수행하는 것입니다. 에피 솜 발현이 24 시간 이내에 검출 될 수 있으며, 세포 생존을보다, 또는, 종래의 방법과 적어도 동일한 것으로 도시 된 위치 과도 안정적인 발현 모두 나노 입자 폭격으로 가능하다. 그러나이 기술은 하나의 중요한 장점을 갖는다 : 그것은 이렇게 해부학 이종 유전자의 효과를 분리하는 것은 사용자를 활성화 한 억제 반경 지역화되는 형질 감염을 허용한다. 여기에서 우리는 개선 된 유전자 총을 사용하여 형질 전환을 위치 선택적하기 위해 가능한 성인의 Organotypic 슬라이스를 준비하고 제출에 대한 깊이있는 프로토콜을 제시한다.
원래 유전자 총 기술, "생물학적 탄도"에 대한 차례의 문구는, 식물 세포 하나에 입자 매개 유전자 전달을 위해 설립되었다. 셀이 변환의 물리적 방법은 DNA 또는 염료화물을 제공하기 위해 불 투과성 세포막의 물리적 장벽을 극복하기 위해 높은 속도로 마이크로 또는 나노 입자를 가속. 그것이 특정 리간드 – 수용체 및 / 또는 세포 표면 막에서 생화학 적 특성에 의존하지 않기 때문에, 입자 – 매개 유전자 전달을 용이 등의 Organotypic 뇌 조각으로 생물학적 시스템의 다양한 적용 할 수있다.
그들은 생체 생물학 2-4 관련된 많은 해부학 적, 생화학 적 특성을 유지하기 때문에 사용의 Organotypic 슬라이스 체외 플랫폼에서 다른 이상 장점이있다. 조각은 대부분 그들이 유래 preser 한 곳에서 지역의 건축 특성을 보존신경 화학적 활동과 시냅스의 연결을했습니다. 기초 연구를위한 뇌 조각의 사용은 제약 노력에서, 병용 측정 문맥 3,5-7 같이 생체 내에서 뇌의 신경 생물학적 행동을 모니터링하는 바이오 가능한 조작의 수와 함께 증가하고있다. Organotypic 슬라이스 기반의 분석 시스템을 사용하는 주요 장점은 쉽게 실험을 제어하고, 세포 외 환경을 정확하게 조작을 허용한다는 것이다.
이러한 결실, Organotypic 슬라이스 배양 시스템과 같은 뇌 영역의 다양한 수립했지만 피질 척수, 소뇌 및 8-10에 한정되지되었다. 더욱이, 공 배양의 수는 원위 뇌 영역을 가로 질러뿐만 아니라 신경 병적 세포 간 통신 (11, 12) 사이의 평가를 허용하는 입증되었다. 대부분의 프로토콜은 이미 s로 설립되어uccessfully 문화의 Organotypic 슬라이스와 장기적인 생존 능력을 유지할 수 많은 최근의 연구는 지금 13에 막 인터페이스 방법과 다양한 변형을 사용합니다. 이 원리는 다공성 멤브레인 필터를 슬라이스를 배치함으로써 매체의 가습 인큐베이터 대기 사이의 계면에서의 Organotypic 슬라이스를 유지한다. 매체는 따라서 모세관 운동을 통해의 Organotypic 슬라이스를 공급하기에 충분한 영양분을 제공 할 수 있습니다. 일반적으로 조각이 출생 초기 동물에서 작성되었습니다 (- 9 일 이전 3, P3 – 9). 그러나, 이들 조각에서 뇌 조직은 세포 가소성의 높은 수준을 표시 가능한 배양을 구하는 것이 유용하다 기계적 응력에 고유 저항을 가지고, 아직 성숙 시냅스와 신경 해부학 회로는 완전히 연령 2-3주까지는 생체 내에서 개발하지 14. 예를 들어, 이전의 관찰은 P0에 의한 것 해마 조각을 (를) 찾았습니다 -, 한 신생아를 매우 viab 있지만제작은 준비 다음, 점차적으로 어떤 형태 학적 특성을 잃었다. 본질적으로, 그들은 오래된 동물 (15, 16)에서의 Organotypic 문화 비교 – 차별화 해제 할 가능성이 더 높았다 미성숙 세포를 제안 장기 문화에 적합하지 않은 것으로 밝혀졌다. 이러한 이유로 우리의 방법은 성숙과 건축 개발이 자신의 말기 13,17-21에 도달하는 성인의 Organotypic 뇌 조각에 최적화되어 있습니다. 그럼에도 불구하고,이 방법은 신생아와 청소년의 Organotypic 조각에 적합하다.
생존의 Organotypic 조각이 생성 된 이후에 조각을 포함하는 전체 판과 유전자 마운트에 가져 와서 배달 및 형질 전환을 위치 선택성에 제출 될 수있다. (조직에 개구로부터) 직접 조각 위에 10mm의 거리에서 90도 배향 (도 1에서 설명) 유전자 총의 적정 부착은, 40 나노 미터의 신속한 이동과 유전자 전달이 허용LD 입자화물 코팅. 이러한 형광 염료 및 DNA 벡터로서 선택된화물뿐만 아니라, 관심있는 유전자는 쉽게 용이 가능한 슬라이스로 전달된다. 이 방법을 따라서 위치 선택적 방식으로 제공 할 수있는 프로토콜이 필요 설명 가능한의 Organotypic 뇌 조각으로화물 코팅 된 금 나노 입자. 유전자 총신과 최적의 설치는 그림 1에서 볼 수 있습니다. 개선 배럴 및 나노 입자의 탄도에 대한 자세한 내용은, 등. 17 오브라이언을 참조하십시오.
후속 세목 또한 사용자는 마이크로 캐리어 로딩 수량 (MLQ)로 정의 대상 면적당 전달 금 적당량 같은 조건을 최적화하기 위해, 그리고 DNA 로딩 비로 정의 금 밀리그램 당로드 DNA의 양을 결정하기 위해 표시된다 (DLR). 금 입자에 DNA를 침전과 실제 유전자 총 '카트리지를 포함하는 TEFZEL 튜브에로드하기 전에9 ;,는 조직과 조건 사이에서 약간 다를 수 있습니다 각 형질에 필요한 DNA와 골드의 양을 계산하는 것이 필요하다 (비율이 1에 1 mg의 골드와 1 μg의 DNA 사이에 유지되어야한다 : 5). 이것은 달리 DNA 코팅 된 금 입자는 증가 조직 손상과 세포 독성뿐만 아니라 유전자 총 확산 전체적인 균질성를 낮출 수있는 것으로 응집,보다 크게 형성 함께 부착 할 수 DLR하는 MLQ의 적절한 비율을 제조하는 것이 중요하다.
이 방법과 유전자 전달의 최근 개선, 테스트, 신생아 청소년 및 성인의 Organotypic 뇌 조각에 대한 의무로 결정되었습니다 보여줍니다. 또한, 유전자 총 배럴의 저감과 유전자 확산을 이용하여, 사용자가 현재 선택적 뇌 영역 폭시 형질 할 수있다. 적절한 배양 시간 후에, 24과 48 사이의 최대 속도에 도달 형광 단백질의 발현,시간은 표면 형광 및 공 초점 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. 이 형광 물질은 생물학적으로 관련 구조 내에서 형태 학적 분석 및 개별 셀의 현지화를 허용합니다. 그러나, 다른 이종 유전자로의 Organotypic 조각의 위치 선택적 변조는 이러한 준비 의무가 다른 시험으로 모니터링 할 수 있습니다. 지역화 된 유전자 전달에 가능한 작업 전략은 그림 2에 제시되어있다.
프로토콜은 향상된 유전자 총을 사용하여 성인의 Organotypic 조각으로 염료 및 유전 물질을 전달하는 방법을 설명한다. 본질적으로, 염료의 종류와 가능한 유전자의 다양한 생물학적 질문에 다양한 답변을이 방법은 다각적와 의무합니다. 뇌의 특정 영역이 경우, 사용되는 위치 선택적 전달 방법은 생물학적으로 관련 아키텍처 내에서 지역화 된 영역의 이종 유전자 변조 등의 실험에 대한 새로운 길을 여는 것은 전에 쉽게 실현되지 않았습니다. 우리는 이전에이 방법이 많은 주 (13)에 대한 향상된 세포 생존 및 이종 유전자 발현을 가리 켰을 때, 성숙한 시냅스가 완전히 형성되고, 성인의 Organotypic 조각에 사용될 수 있음을 확인했다. 포유 동물의 뇌에 대한 새롭고 개선 된 배양 조건뿐만 아니라 다른 조직의 출현으로, 위치 선택적 유전 변조의 사용은 bioche 다양한 점점 유용해질 것이다화학적 인 분석.
우리가 다른 사람 (24)에 의해 언급 여기에 이전에 강조한다, 많은 다른 요인이 용이과 유전자 전달의 정확성과 신뢰성에 영향을 미칠 수 있습니다. 첫째로, 염료 또는 DNA 연결 금 입자의 제조는 적절한 응집을 방지하고, 카트리지화물 제명을 용이하게 균형을 이루어야한다. DNA-금 미세 입자 용액에 칼슘과 스퍼 미딘이 금 나노 입자에 DNA 분자의 결합을 도울 수있다. 감압하에 세포를 침투 나노 입자는 이전 기능 (17)을 결정 하였다. 둘째, 유전자 총은 정확한 각도와 거리를 최대한 상승 장착되어야한다. 안정적인 압력 게이지는 직물의 무결성을 유지하기 위해, 적절하게 그들의 의도 된 타겟에 금 입자를 가속하기 위해, 또한 재현성이 필요하다. 사실, 장치의 거리, 방향 및 안정성도 t위한 중요한 요인argeting 및 위치 선택적 전달의 정밀도. 이들 뇌 구조가 매우 작을 경우, 점 호각의 사소한 변화가 쉽게 전체 절차가 적은 안정적인 렌더링 할 수있다. 그리고 마지막으로, 준비 및 실행 가능한의 Organotypic 조각의 유지 보수는 다른 동물, 뇌 영역, 연령과 공 배양을 위해 아직 풍부하고 신뢰할 수있는 프로토콜은 현재 2,4,25,26 사용할 수있는 수십 년에 대한 어려움을 내포하고있다. 이러한 절차는 사용자에 최적화 된 유전자 총 절차에 조직을 제출하기 전에해야합니다. 이것은 더 쉽게 unbiasedly 유전자 총 입자의 영향과 자신 배양에 이종성 유전자의 효과를 확인하기 위해 사용자를 허용 할 것이다. 이를 위해, 예컨대 EYFP EGFP와 같은 형광 유전자의 사용은 타겟팅 정확성을 테스트하고 또한 13 시간의 지속 기간 동안 이종 유전자 발현을 통해 세포 생존력을 따르는 신규 사용자를 허용 할 수있는 두. 신뢰성을위한 중요한 단계의 많은이 프로토콜의 재현 사용은 다음과 같은 세 단락으로 강조 표시됩니다.
효율적인 형질를 들어, DNA 농도가 적절해야합니다. 너무 높은 농도의 나노 입자의 응집을 일으킬 수있는 반면 너무 낮은 농도는 형질 전환 수율을 방해하는 것입니다. 금의 응집체 극적 형질 전환 효율을 감소 불균일 분포를 야기하고, 증가 된 산화 적 스트레스 및 세포 독성을 초래할 수있다. 스퍼 미딘 용액의 만료 (매 2-3개월 대체되어야한다) 때문에 코팅 효율의 문제가 예상된다. 적절한과 유전자 확산을 위해, 라벨도 있어야합니다. 금 나노 입자 / DNA 서스펜션의 비 균일 한 라벨은 PVP 솔루션에 기인 할 수있다. 또한 모든 2~3개월 교체해야합니다. 금 나노 입자의 코팅은 높은 MW 밴드 (27)로서, 아가 로스 겔 전기 영동에 알 수있다.
각 생물 SYST조사중인 그들뿐만 아니라 형질 전환 유전자 총 확산의 최적화 수준에 도달하는 가스 압력의 작은 변화가 필요할 수 있습니다 사용 된 각각의 서로 다른 악기. 임계 파라미터는 플라스틱 카트리지에서 마이크로 또는 나노 캐리어 스트립과 티슈로 추진하기 위해 필요한 펄스의 헬륨 압력이다. 그것은 목표 걸쳐 충격파를 생성하고 방해 또는 매트릭스 (17)로부터 조직을 분리하기 때문에 높은 가스 압력은 세포 생존에 영향을 미칠 것이다. 유전자 총 배럴을 목표로 정확히 수직 조직에 장치를 갖는 정확한과 유전자 전달을위한 중요합니다. 선택된 영역은 외측 개구로부터 정확히 10mm에서 배럴의 직접 중앙에 위치해야한다. 이 진원지 주위에 금 입자 전달의 3mm 직경 발생합니다. 유전자 총신은 각 사용 후 70 % 에탄올로 세척해야한다. 큰 입자 집합체로부터 조직을 보호하기 위해, 배럴도 SHO 나일론 메쉬를 포함최적의 성능을 유지하기 위해 주기적으로 교체 될 ULD. 바꾸기 위해 메쉬 캡 후 캡과 O-링 사이에 새로운 나일론 메쉬를 삽입 푼다.
2 일 진원지 주위에 형질 전환 후 – 형광 표지 세포는 적어도 1 볼 수 있어야합니다. 부재 또는 라벨의 어긋남은 유전자 총 설치의 불충분 준비와 불안정성이 발생할 수 있습니다. 공 초점 현미경을 사용하여 세포의 관찰은 여러 가지 요인에 의존한다 : 여기 / 발광 광의 파장, 핀홀 크기, 대물 렌즈의 NA, 광로 구성 요소의 굴절률, 조직, 그리고 배향의 깊이 악기. 이러한 요소는 조사중인 각 시스템에 맞게 최적화되어야한다.
바이오리 스틱스 (biolistics)의 최근 발전은이 방법의 성공을 위해 이용되었다. 본 연구에 사용 된 유전자 총신은 필요한 압력을 줄일뿐만 아니라, 유전자 총을 깔때기 위해 수정더 제약 및 특정 영역 (17, 19)에 산란 패턴. 기타 배럴 수정과 유전자 확산을 제한하고 유출 압력 28을 줄이기 위해 노력했다 아직 박사 오브라이언에 의해 디자인이 사용자 정의 설계 유전자 총신은 표준 헬리오스 유전자 총에 장착 된 하나의 구성 요소입니다. 이어서, 서브 마이크로 미터의 금 입자는 세포 손상 및 궁극적으로 지속 이종성 유전자 발현의 상실을 야기 우리는 이전에 결정된 한 마이크로 입자의 침입을 줄이기 위해 사용되었다. 과 유전자 절차 이러한 변화는 방법 (13)의 전반적인 타당성과 재현성을 향상시켰다. 등의 Organotypic 뇌 슬라이스 준비에 대한 심층적 인 슬라이싱 절차의 문제 해결, 뇌를 유지하기 위해 DMEM-아가로 오스 행렬을 사용하여, 수많은 다른 유용한 진보로 슬라이스 준비에 다른 개선 사항은 이전에 13 성인 조각의 사용을 탐구 할 수있게보고했다 성숙한 개발시냅스 네트워크.
우리의 연구에서 우리는 주로 형질 전환 효율에 판독 및 이미지 기능을 마우스의 뇌 조직에서 신경 세포의 형태 학적 특성으로 세포 형태를 시각화하기 위해 염료 및 형광 이종 유전자를 사용했다. 정의 된 반경 스토캐스틱 전달 신호 대 잡음비는 완전히 원래 문맥 내 하나의 셀의 dentritic 항구를 분리 할 수있게. 많은 노력이 이러한 형태 학적 특성을 조사하기 위해 사용하는, 매핑 'connectomics'또는 다양한 분석을위한 단일 세포를 라벨,이 방법은 쉽게 같은 전기 생리학 및 신경 돌기 측정 (29, 30)과 같은 기존 프로토콜과 결합 될 수있다. 분명히, 형광 이종 유전자의 조합은 형광 단백질의 확률 분포와 같은 단일 셀의 훨씬 더 강력한 묘사 할 수있게하고, 그들의 조합은 각각의 셀 (31, 32)의 색을 결정하는 것이. 이러한 synapsin 및 이종 유전자 엑손의 상류 신경교 원 섬유 산 단백질로서 세포 특이 적 프로모터의 사용은 또한 소집단 (33) 식을 제한 할 수있다. 사실, 유전 물질의 끝없는 다양한이 같은 절차를 사용하여 금 나노 입자에 의해 위치 선택적 방식으로 전달 될 수있다. 총 형질 지역 따라서 전통적인 방법, 같은 절개로하고 이종 유전자의 지역화 효과를 분석하기 위해 서부 면역 블로에 그 지역을 제출하여 분석 할 수있다.
Organotypic 슬라이스 절차의 개선은 또한 넓은 장기 실험을위한 뇌 조직의 사용 허가뿐만 아니라 다른 조직과 공 배양의 사용을 허용하는 방법 및 형질 전환을 용이하게한다. 지질 중합체 형질는 이전 34 자주은 Te 트랜 매우 낮은 효율을 보여 막 항상성, 내재화 단백질 투과성에 영향을 미치는 것으로보고되었다rminally 신경 세포를 분화. 셀 특정화물 타겟팅은 단지 필요한 내면화 세포 표면 수용체를 발현하는 세포에도 순종하며,이 방법이 매우 선택적이 될 수 있지만, 위치 선택성 (35)를 대상으로 결여 할 수있다. 바이러스 성 벡터는 달리, 생산 종종 어렵고 비용이 많이 드는 엄격한 규정이 필요하고 경우에이 안전 문제를 보여 주었다. 과 유전자 전달은 따라서 위치 선택적으로 실행 가능한 조직 내에서 신경 세포와 다른 세포 유형에 감염 될 수있는 비교할 수없는 기능이 있습니다. 금은 비이기 때문에 바이오리 스틱스 (biolistics)의 사용에 독성이 더 진보는 경피 제약 배달, 비 침습적 생체 내 유전자 전달뿐만 아니라 지역화 된 비 바이러스 성 유전자 치료와 같은 생물 의학 사용에 대한 방법을 포장 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 강화 된 유전자 총 배럴의 생산을위한 MRC-LMB 워크샵에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 장비와 자원의 사용을 위해 토론토 대학에서 박사 데이비드 R. Hampson에게 감사의 말씀을 전합니다.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |