Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
Трансфекция ДНК была неоценима для биологических наук и с учетом последних достижений в органотипических препаратов мозга срезов, влияние различных гетерологичных генов, таким образом, может быть исследован легко, сохраняя многие аспекты биологии в естественных условиях. Там было все больший интерес для трансфекции терминально дифференцированных нейронов, для которых обычные методы трансфекции которые были сопряжено с трудностями, например, низкой урожайности и значительным потерям в жизнеспособности. Biolistic трансфекции могут обойти многие из этих трудностей, но лишь недавно этот метод был модифицирован таким образом, что она поддается для использования в тканях млекопитающих.
Новые модификации ускорительной камеры имеют повышенную точность стрельбы гена пистолета и увеличил глубину проникновения, а также позволяет использование более низком давлении газа (50 фунтов на квадратный дюйм) без потери эффективности трансфекции, а также позволяет сфокусированный региоселективное распространение годовыхrticles в пределах 3 мм. Кроме того, этот метод является прямым и быстрее, чем для выполнения трудоемких микроинъекций. И переходным и стабильной экспрессии возможны наночастиц бомбардировки, где выражение эписомной может быть обнаружен в течение 24 ч и выживаемость клеток было показано, что лучше, чем, по крайней мере, равна, обычными способами. Эта техника имеет однако один решающее преимущество: она позволяет трансфекции быть локализованным в пределах одного сдержанный радиусом что позволяет пользователю анатомически изолировать эффекты гетерологичных генов в. Здесь мы представляем протокол углубленный подготовить жизнеспособным взрослых органотипической ломтики и отправляйте их региоселективного трансфекции с помощью усовершенствованного генной пушки.
Первоначально биолистическую техника, рубежа фраза для "биологических баллистики", была создана для переноса генов опосредованной частицами в клетках растений 1. Этот физический метод трансформации клеток ускоряет микро или наночастиц с высокой скоростью, чтобы преодолеть физические барьеры из непроницаемых мембран клеток для того, чтобы доставить грузы, такие как ДНК или красителей. Поскольку это не зависит от конкретных лиганд-рецепторов и / или биохимических свойств на поверхности мембран клеток, перенос генов опосредованной частицами могут быть легко применены в различных биологических системах, таких как органотипических срезах мозга.
Использование органотипической ломтики имеют преимущества перед другой в платформах пробирке, так как они поддерживают много анатомические и биохимические свойства, которые имеют отношение к в естественных условиях биологии 2-4. Ломтики основном сохранить местные архитектурные особенности от того, где они возникли и preserве нейрохимический активность и соединения синапсов. Использование срезах мозга для фундаментальных исследований, так и в фармацевтических начинаниях, уже одновременно увеличивается с числом возможных биотехнологических манипуляций возможность определять и отслеживать нейробиологические поведения мозга в в естественных условиях, как контексте 3,5-7. Основные преимущества для использования органотипической ломтик основе тест-систем является то, что он обеспечивает легкий экспериментального контроля и позволяет получить точные манипуляции внеклеточных средах.
Плодотворно, системы культуры органотипической ломтик были созданы из различных областях мозга, таких как, но не ограничиваясь, коры, спинного мозга и мозжечке 8-10. Кроме того, ряд совместных культурах было продемонстрировано, которые позволяют оценить межклеточной коммуникации по дистальных отделах головного мозга, а также между нейронами и патологических клеток 11,12. Многие протоколы уже были созданы, чтобы сuccessfully ломтики культура органотипической и может поддерживать долгосрочную жизнеспособность и многие недавние исследования в настоящее время используют методы интерфейса мембрана и различные изменения в нем 13. Этот принцип сохраняет органотипической ломтики на границе раздела между средой и увлажненной атмосфере инкубатора путем размещения ломтики на пористом мембранном фильтре. Среда может, таким образом, обеспечить достаточного количества питательных веществ, чтобы накормить органотипической ломтики через капиллярную движения. Обычно ломтики были получены из ранних послеродовых животных (3 – 9 дней старых; P3 – 9). Однако, мозговые ткани из этих кусочков отображения высокий уровень клеточного пластичности и имеют неотъемлемое стойкость к механическим воздействиям, что очень удобно для получения жизнеспособных культур, еще зрелые синапсы и нейроанатомическом схема не полностью не развились в естественных условиях до 2 до 3-недельного возраста 14. Например, предыдущие наблюдения показали, что срезах гиппокампа, полученных от P0 – 1 новорожденных, хотя и очень viabле следующее подготовки, постепенно потеряли некоторые морфологические характеристики. По сути, они были показаны непригодными для длительных культур предлагая незрелые клетки, скорее всего, де-дифференцируемая по сравнению с органотипических культур из старых животных 15,16. По этой причине наш метод был оптимизирован для взрослых органотипических срезах мозга, при которой созревание и архитектурного развития достигли своих терминальных стадий 13,17-21. Тем не менее, этот метод также подходит для новорожденных и малолетних органотипических ломтиками.
Как только жизнеспособные органотипической ломтики были произведены вся пластина, содержащая ломтики могут быть доведены до биобаллистической горе и представлен региоселективного доставку и трансфекции. Правильная установка в генной пушки (как описано на рисунке 1), ориентированных на 90 ° на расстоянии 10 мм непосредственно над ломтиками (с отверстием в ткани), позволяет быстрое Biolistic поставка 40 нм перейтисть частиц покрытием грузов. Эти грузы, такие как красители и флуоресцентные ДНК-векторов, а также любая интерес ген, легко доставлены в жизнеспособных срезов с легкостью. Этот метод, таким образом описывает протокол необходимо доставить, в региоселективного образом, грузовые покрытием наночастицы золота в жизнеспособные органотипических срезах мозга. Ствол генной пушки и оптимальное крепление можно увидеть на рисунке 1. Дополнительную информацию о улучшенными баррель и наночастиц баллистики, смотрите О'Брайен, и др. 17.
Последующие усовершенствования также показаны для пользователя с целью оптимизации условий, таких как надлежащее количество золота поставляемого за целевой области, определяемой как микроносителю количество нагрузки (MLQ), и для определения количества ДНК, загруженной на мг золота, определяемая как ДНК Loading Соотношение (DLR). До осаждения ДНК на частицах золота и загрузки их в трубки TEFZEL который содержит картриджи фактического генной пушки "9 ;, необходимо рассчитать количество ДНК и золота, необходимое для каждой трансфекции, которые могут слегка отличаются друг от тканей и условий (соотношение следует поддерживать в диапазоне от 1 мг золота и 1 мкг ДНК до 1: 5). Это имеет жизненно важное значение для подготовки надлежащего долю MLQ в DLR как в противном случае частицы золота ДНК покрытием может придерживаться вместе, образуя больше, чем ожидалось, агломерации, которые могли бы уменьшить общую однородность биобаллистической распространения, а также повреждения увеличение тканей и цитотоксичности.
Этот метод показывает недавние улучшения в биобаллистической поставки, которые были испытаны с точки зрения их поддаются для новорожденных, несовершеннолетних и взрослых органотипических срезах мозга. Кроме того, за счет использования пониженной Biolistic распространение гена ствола пушки, пользователь теперь может выборочно трансфекции пунктуальность область в мозге. После соответствующей времени инкубации, выражение из флуоресцентных белков, которые достигает своих максимальных показателей между 24 и 48ч, могут быть визуализированы эпифлуоресцентной и конфокальной микроскопии. Эти флуорофоров разрешить морфологического анализа и локализации отдельных клеток в биологически соответствующих структур. Тем не менее, региоселективный модуляция органотипических ломтиками другими гетерологичных генов также можно контролировать с помощью любых других тестов, поддающихся этих препаратов. Возможные рабочие стратегии для локализованной доставки гена представлены на рисунке 2.
Протокол описывает подходы к решению красители и генетические материалы во взрослую органотипических ломтиками с помощью расширенной генной пушки. По существу, типы красителей и разнообразие возможных генов делают этот метод многогранен и поддаются ответить на широкий спектр биологических вопросов. Региоселективный способ доставки используется, в данном случае к конкретной области мозга, открывает новые возможности для экспериментов в качестве гетерологичных генов модуляции локализованных районах в пределах биологически соответствующего архитектуры не было легко осуществимо прежде. Ранее мы определили, что этот метод может быть использован на взрослых органотипических ломтиками, где зрелые синапсы полностью сформирован, как это показали улучшение выживаемости клеток и экспрессией гетерологичных генов в течение многих недель 13. С появлением новых и улучшенных условий культивирования для мозга млекопитающих, а также других тканей, применение Региоселективный генетических модуляции становится все более полезным для широкого спектра биохимическиеческое анализов.
Как мы будем выделить здесь и ранее упомянуто другими 24, много различных факторов может легко повлиять на точность и надежность биобаллистической доставки. Во-первых, подготовка золотой частицы связаны с красителями или ДНК должны быть надлежащим образом сбалансированы для предотвращения агрегации и содействовать картридж грузовой изгнание. Кальций и спермидин в ДНК-золото микрочастиц решения может помочь связывание молекул ДНК, чтобы наночастиц золота. Способность к наночастиц проникать в клетки при пониженном давлении ранее определено 17. Во-вторых, генной пушки должен быть установлен как устойчивый, как можно с правильным углом и расстоянием. Надежный манометр также необходимо для воспроизводимости, чтобы сохранить целостность тканей, а также должным образом ускорить частицы золота на их предполагаемых целей. В самом деле, расстояние, ориентацию и устойчивость оборудования являются также важными факторами для тargeting и точность региоселективного доставки. Поскольку эти структуры мозга очень малы, незначительные колебания угла зажигания может легко сделать вся процедура менее надежны. И, наконец, подготовка и сопровождение жизнеспособных органотипических ломтиками были сопряжено с трудностями для многих десятилетий еще обильные и надежные протоколы для различных животных, областей головного мозга, возрастов и совместных культурах в настоящее время доступны 2,4,25,26. Эти процедуры должны быть удобными для оптимизированы перед отправкой ткани для Biolistic процедур. Это будет легче разрешить пользователю беспристрастно установить воздействие Biolistic частиц и эффект гетерологичных генов на своих культур. С этой целью, использование флуоресцентных генов, таких как EYFP и EGFP может разрешить как новый пользователь, чтобы проверить точность таргетинга, а также следить за клеточную жизнеспособность через экспрессии гетерологичных генов в течение длительного периода времени 13. Многие из важных шагов для надежнойи воспроизводимое использование этого протокола выделены три следующих пункта.
Для эффективной трансфекции, концентрация ДНК должна быть соответствующей. Концентрации, которые являются слишком низкими будет препятствовать выход трансфекции в то время как концентрации, которые являются слишком высокой может вызвать агломерацию наночастиц. Агрегаты золота может значительно снизить эффективность трансфекции, вызывают неравномерное распределение, и может привести к увеличению цитотоксичности и окислительного стресса. Проблемы с эффективностью покрытия, скорее всего, в связи с истечением срока спермидина решения (должны быть заменены каждые 2 до 3 месяцев). Для адекватного биобаллистической распространения, маркировка должна быть четной. Неоднородный маркировки суспензии наночастиц золота / ДНК может быть связано с раствором ПВП. Он также должен быть заменен каждые 2 до 3 месяцев. Покрытие из наночастиц золота можно увидеть на электрофореза в агарозном геле как высшего диапазона MW 27.
Каждый биологический систет под следствием, а также друг другом анализаторе используется может потребоваться небольшие изменения давления газа, чтобы достичь оптимизированные уровни трансфекции и биобаллистической распространения. Критическим параметром является давление гелия импульса, необходимого, чтобы лишить микро или нано-носителей из пластмассового патрона, и вывести их в ткани. Высокое давление газа будет влиять на выживаемость клеток, потому что она будет создавать ударные волны по всей мишени и нарушать или отделить ткань из матрицы 17. С целью гена ствол и имеющий устройство точно перпендикулярно к ткани имеет важное значение для точного баллистической доставки. Выбранный участок должен быть размещен в непосредственном центре ствола именно в 10 мм от наружной диафрагмы. Это приводит к диаметром 3 мм поставки частиц золота вокруг эпицентра. Ген ствол должен быть очищен с 70% этанола после каждого использования. Для защиты ткани от крупных агрегатов частиц, ствол также содержит нейлоновую сетку, шоÜLD регулярно заменять для поддержания оптимальной производительности. Для того, чтобы заменить сетки отвинтить колпачок затем вставить новую нейлоновая сетка между крышкой и уплотнительным кольцом.
Флуоресцентно меченые клетки должны быть видны по крайней мере 1 – 2 дня после трансфекции вокруг эпицентра. Отсутствие или смещение маркировки может быть результатом недостаточной подготовки и нестабильности генной пушки монтажа. Наблюдения клеток с использованием конфокальной микроскопии зависит от ряда факторов: от длины волны света возбуждения / излучения, обскура размера, Н. А. линзы объектива, показатель преломления компонентов на пути света, глубина ткани, и выравнивание прибор. Эти факторы должны быть оптимизированы для каждого исследуемой системы.
Последние достижения в области биолистики эксплуатировались для успеха этого метода. Ген ствол, используемый в этом исследовании, была модифицирована, чтобы уменьшить давление, необходимое, а также воронки BiolisticРазброс модели в более ограниченном и конкретном районе 17,19. Другие модификации баррель пытались ограничить Biolistic распространение и уменьшить давление оттока 28 еще этот обычай разработан ген ствол предназначен доктором О'Брайен является однокомпонентным установлены на стандартный Helios генной пушки. Впоследствии частицы золота суб-микронных были использованы, чтобы снизить инвазивность частиц микронных, что мы ранее определенных причиной повреждения клеток и в конечном итоге потери устойчивой экспрессии гетерологичных генов. Эти изменения в биобаллистической процедуры улучшили общую целесообразность и воспроизводимость метода 13. Другие улучшения по подготовке среза, такие как углубленного поиска неисправностей процедуры нарезки, с использованием матрицы DMEM-агарозы сохранить мозг, и множество других полезных достижений в органотипической подготовки мозг среза сообщалось ранее 13 позволило нам изучить возможность использования взрослых ломтиками, что разработали зрелыесинаптические сети.
В нашем исследовании мы в основном используется красители и флуоресцентные гетерологичных генов визуализировать морфологию клеток как отсчетом на эффективность трансфекции и способность к изображению морфологические характеристики нейронов в тканях мозга мыши. Отношение сигнал-шум стохастического доставка по определенному радиусу позволило нам полностью изолировать dentritic гавань одной клетки в пределах своей родной контексте. Как показывают многочисленные усилия используются для расследования этих морфологических характеристик, картографические 'connectomics »или маркировать отдельные клетки для различных анализов, этот метод может быть легко объединены с существующими протоколами, такими как электрофизиологии и аксонов измерений 29,30. Очевидно, комбинации люминесцентных гетерологичных генов может позволить гораздо более устойчивый разграничение отдельных клеток, как стохастического распределения флуоресцентных белков, а их сочетание будет определять цвет отдельных элементов 31,32. Использование специфических промоторов клеток, таких как synapsin и глиальных фибриллярного белка кислоты выше гетерологичного гена экзона может также ограничить выражение субпопуляций 33. В самом деле, бесконечное разнообразие генетического материала также может быть доставлен в региоселективного образом с помощью наночастиц золота с использованием этой же процедуре. Суммарные трансфецировали регионы могут таким образом быть проанализированы с традиционными методами, такими как рассечение и утверждая, что область к западной иммуноблотинга анализировать локализованную эффект гетерологичных генов.
Улучшения в органотипических процедур срезов также позволит более широкому использованию тканях мозга для долгосрочного экспериментов, а также разрешения на использование других тканей и совместных культурах и будет способствовать процедуры трансфекции. Липидов и полимер трансфекции были ранее сообщалось влияет мембраны гомеостаза, интернационализации, белка проницаемость 34 и часто показывают очень низкую эффективность трансфицировать теrminally дифференцированы нейроны. Конкретной ячейке нацеливание груза также поддаются только клетки, которые экспрессируют рецепторы клеточной поверхности, необходимые для интернализации, и хотя этот метод может быть очень избирательным, он может не хватать целевых региоселективность 35. Вирусные векторы в противном случае часто сложно и дорого производить, требуют строгие правила и при случае показали проблемы безопасности. Biolistic доставка таким образом, имеет беспрецедентную возможность региоселективно трансфекции нейронов и другие типы клеток в жизнеспособных тканей. Как золото не токсичен, дальнейший прогресс в использовании биолистики может проложить путь для биомедицинских применений, таких как трансдермального фармацевтической доставки, неинвазивной естественных доставки генов в, а также локализованных невирусных генной терапии.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить мастерскую MRC-LMB для производства усиленного баррель генной пушки. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида Р. Хэмпсон в Университете Торонто за использование оборудования и ресурсов.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |