Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
وكان ترنسفكأيشن من الحمض النووي لا تقدر بثمن للعلوم البيولوجية ومع التطورات الحديثة لعضوي النمط الاستعدادات شريحة الدماغ، وتأثير الجينات المختلفة مغاير وبالتالي يمكن تحقيق بسهولة مع الحفاظ على جوانب كثيرة من الجسم الحي في علم الأحياء. كان هناك اهتمام متزايد لبالنقل الخلايا العصبية متباينة عضال التي كانت طرائق نقل التقليدية محفوف بالصعوبات مثل عوائد منخفضة وخسائر كبيرة في قدرتها على البقاء. ترنسفكأيشن Biolistic يمكن الالتفاف العديد من هذه الصعوبات فقد تم تعديل هذه التقنية حتى الآن إلا في الآونة الأخيرة بحيث تكون قابلة للاستخدام في أنسجة الثدييات.
وقد عززت التعديلات الجديدة إلى غرفة مسرع دقة اطلاق النار من بندقية الجينات وزيادة أعماقها من التغلغل في الوقت الذي تسمح أيضا استخدام انخفاض ضغط الغاز (50 رطل) دون فقدان الكفاءة ترنسفكأيشن وكذلك السماح للانتشار regioselective تركيزا للسلطة الفلسطينيةrticles في حدود 3 مم. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية هي على التوالي إلى الأمام وأسرع أداء من microinjections مملة. كلا عابرة والتعبير مستقر ممكنة مع جسيمات متناهية الصغر القصف حيث يمكن الكشف عن episomal التعبير خلال 24 ساعة، وتبين بقاء الخلية ليكون أفضل من أو يساوي على الأقل، بالطرق التقليدية. هذا الأسلوب له إلا واحد ميزة حاسمة: فهو يسمح ترنسفكأيشن ليكون موضعيا داخل دائرة نصف قطرها واحد ضبط النفس مما يتيح للمستخدم لعزل تشريحيا تأثيرات الجين مغاير ل. هنا نقدم بروتوكول متعمقة لإعداد الكبار قابلة للحياة شرائح عضوي النمط ورفعها إلى regioselective ترنسفكأيشن باستخدام مدفع الجينات المحسنة.
تأسست أصلا تقنية biolistic، عبارة تحول من ل"المقذوفات البيولوجية"، على الجسيمات بوساطة نقل الجينات إلى الخلايا النباتية 1. هذه الطريقة المادي للتحول الخلية يسرع الجزئي أو النانوية في سرعة عالية للتغلب على الحواجز المادية للأغشية الخلايا منيعة من أجل إيصال الشحنات مثل الحمض النووي أو الأصباغ. لأنها لا تعتمد على مستقبلات يجند محددة و / أو الخصائص الكيميائية الحيوية في الأغشية سطح الخلية، بوساطة الجسيمات نقل الجينات يمكن تطبيقها بسهولة إلى مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية مثل شرائح الدماغ عضوي النمط.
باستخدام شرائح عضوي النمط لها مزايا أكثر من غيرها من منصات في المختبر لأنها الحفاظ على العديد من الخصائص التشريحية والكيميائية الحيوية التي تتصل في الجسم الحي البيولوجيا 2-4. شرائح حفاظ معظمها الخصائص المعمارية المحلية من حيث أنها قد نشأت وبريزرلقد نشاط كيميائي عصبي والتواصل بين نقاط الاشتباك العصبي. استخدام شرائح الدماغ للبحوث الأساسية، والمساعي الأدوية، زادت بصورة متزامنة مع عدد من التلاعب التكنولوجيا الحيوية الممكنة لقياس ورصد السلوكيات العصبية الحيوية في الدماغ في الجسم الحي في مثل السياق 3،5-7. المزايا الرئيسية لاستخدام أنظمة الفحص القائم على شريحة عضوي النمط هو أنه يوفر سيطرة التجريبية سهلة ويتيح التلاعب دقيقة من بيئات خارج الخلية.
مثمر، تم إنشاء أنظمة ثقافة شريحة عضوي النمط من مجموعة متنوعة من مناطق الدماغ مثل، ولكن لا تقتصر على، القشرة، والحبل الشوكي والمخيخ 8-10. علاوة على ذلك، تظاهر عدد من cocultures، والتي تسمح بتقييم الاتصالات بين الخلايا في مناطق الدماغ البعيدة وكذلك بين الخلايا العصبية والخلايا المرضية 11،12. وقد تم إنشاء العديد من البروتوكولات لقuccessfully شرائح ثقافة عضوي النمط ويمكن الحفاظ على الاستمرار في الأجل الطويل والعديد من الدراسات الحديثة الآن تستخدم أساليب واجهة الغشاء ومختلف التعديلات عليها 13. يحافظ هذا المبدأ شرائح عضوي النمط في واجهة بين المتوسطة وجو الحاضنة ترطيب عن طريق وضع شرائح على فلتر غشاء مسامي. وبالتالي يمكن للمتوسطة توفير المواد الغذائية الكافية لإطعام شرائح عضوي النمط عبر الحركة الشعرية. عادة تم إعداد شرائح من الحيوانات في وقت مبكر بعد الولادة (3-9 أيام القديمة، P3 – 9). ومع ذلك، أنسجة المخ من هذه الشرائح عرض على مستوى عال من اللدونة الخلوية ولها المقاومة المتأصلة للضغوط الميكانيكية، وهو أمر مفيد للحصول على الثقافات قابلة للحياة، بعد أن نقاط الاشتباك العصبي ناضجة والدوائر تشريحي عصبي لم تتطور بشكل كامل في الجسم الحي حتى 2 إلى 3 أسابيع من العمر 14. على سبيل المثال، كانت الملاحظات السابقة أظهرت أن شرائح قرن آمون تم الحصول عليها من P0 – 1 حديثي الولادة، على الرغم من درجة عالية viabلو بعد إعداد، فقدت تدريجيا بعض الخصائص المورفولوجية. في الأساس، وعرضت عليهم أن يكونوا غير صالحة للثقافات على المدى الطويل مما يدل على خلايا غير ناضجة كانوا أكثر عرضة للإزالة يفرق مقارنة الثقافات عضوي النمط من الحيوانات القديمة 15،16. لهذا السبب فقد تم تحسين أسلوبنا لشرائح الدماغ الكبار عضوي النمط الذي النضج والتطور العمراني وصلت إلى المراحل النهائية من 13،17-21. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة لحديثي الولادة وشرائح عضوي النمط الأحداث.
مرة واحدة وقد تم إنتاج شرائح عضوي النمط قابلة للحياة لوحة كاملة تحتوي على شرائح يمكن جلبها إلى جبل biolistic وتقديمها إلى regioselective التسليم وترنسفكأيشن. التركيب الصحيح للبندقية الجينات (كما هو موضح في الشكل 1)، موجهة 90 ° على مسافة 10 ملم مباشرة على شرائح (من الفتحة إلى الأنسجة)، يسمح تسليم biolistic السريع ل40 نانومتر يذهبدينار الجسيمات مغلفة الشحنات. هذه الشحنات مثل الأصباغ وناقلات DNA الفلورسنت، وكذلك أي جين من الفائدة، يتم تسليم بسهولة في شرائح قابلة للحياة بكل سهولة. وبالتالي هذه الطريقة يصف بروتوكول الضرورة أن يسلم، بطريقة regioselective والبضائع المغلفة جزيئات الذهب إلى شرائح عضوي النمط الدماغ قابلة للحياة. يمكن أن ينظر إلى برميل بندقية الجينات والتركيب الأمثل في الشكل 1. لمزيد من المعلومات حول تحسين برميل جسيمات متناهية الصغر والمقذوفات، يرجى الاطلاع اوبراين، وآخرون 17.
يشار إلى التحسينات اللاحقة أيضا للمستخدم لتحسين ظروف مثل كمية مناسبة من الذهب تسليمها في المنطقة المستهدفة، الذي يعرف بأنه Microcarrier تحميل الكمية (MLQ)، وتحديد كمية الحمض النووي تحميل لكل ملغ من الذهب، الذي يعرف بأنه نسبة DNA تحميل (DLR). قبل ترسيب الحمض النووي على جزيئات الذهب وتحميلها في أنابيب Tefzel التي تضم خراطيش بندقية الجينات الفعلي "9؛، فمن الضروري حساب كمية الحمض النووي والذهب المطلوبة لكل ترنسفكأيشن التي يمكن أن تختلف قليلا بين الأنسجة والشروط (ينبغي الحفاظ على النسبة بين الذهب 1 ملغ و 1 ميكروغرام DNA إلى 1: 5). فمن الأهمية بمكان أن تعد نسبة مناسبة من MLQ إلى DLR وإلا DNA المغلفة جزيئات الذهب يمكن أن تلتزم معا تشكيل التكتل أكبر من المتوقع، والتي يمكن أن تقلل من التجانس العام للانتشار biolistic فضلا عن الأضرار زيادة الأنسجة وسمية الخلايا.
يظهر هذا الأسلوب التحسينات الأخيرة في تسليم biolistic، التي تم اختبارها وعازمة على أن تكون قابلة للشرائح الدماغ عضوي النمط حديثي الولادة، الأحداث والبالغين. وعلاوة على ذلك، من خلال استغلال انخفاض انتشار الجين بندقية برميل في biolistic، المستخدم هو الآن قادرة على بالنقل انتقائي منطقة المنضبطة في الدماغ. بعد فترة حضانة مناسبة، والتعبير عن البروتينات الفلورية، والتي تصل إلى أقصى معدلاتها بين 24 و 48ساعة، يمكن تصور بواسطة epifluorescence والفحص المجهري متحد البؤر. تسمح هذه fluorophores التحليل الصرفي وتوطين الخلايا الفردية داخل الهياكل ذات الصلة من الناحية البيولوجية. ومع ذلك، فإن تعديل regioselective من شرائح عضوي النمط من الجينات مغاير أخرى يمكن أيضا أن تراقب من قبل أي اختبارات أخرى قابلة لهذه الاستعدادات. يتم عرض استراتيجيات العمل الممكنة لتوصيل الجينات محلية في الشكل 2.
يصف بروتوكول النهج لتقديم الأصباغ والمواد الوراثية إلى شرائح عضوي النمط الكبار باستخدام مدفع الجينات المحسنة. أساسا، وأنواع الأصباغ ومتنوعة من الجينات المحتملة تجعل هذه الطريقة متعددة الأوجه وقابلة للرد على مجموعة واسعة من المسائل البيولوجية. طريقة التسليم regioselective المستخدمة، في هذه الحالة لمنطقة محددة في الدماغ، ويفتح آفاقا جديدة للتجريب وتعديل الجينات مغاير من مناطق محددة داخل بنية ذات الصلة بيولوجيا لم يكن ممكنا بسهولة من قبل. فقد قررنا سابقا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها في شرائح عضوي النمط الكبار، حيث تتشكل نقاط الاشتباك العصبي ناضجة تماما، حيث أظهرت تحسن بقاء الخلية ومغاير التعبير الجيني لعدة أسابيع 13. مع ظهور ظروف ثقافة جديدة ومحسنة لأدمغة الثدييات، فضلا عن الأنسجة الأخرى، فإن استخدام التحويرات الوراثية regioselective تصبح مفيدة بشكل متزايد لطائفة واسعة من biocheيحلل mical.
كما يجب علينا تسليط الضوء هنا وسابقا من قبل الآخرين 24 أعلاه، يمكن أن تؤثر العديد من العوامل المختلفة بسهولة ودقة وموثوقية تسليم biolistic. أولا، إعداد الجسيمات الذهب مرتبطة الأصباغ أو الحمض النووي يجب أن تكون متوازنة بشكل كاف لمنع تجميع وتسهيل طرد البضائع خرطوشة. الكالسيوم وإنتاج الأسبرميدين في جسيمات متناهية الصغر حل DNA الذهب يمكن أن تساعد على ربط جزيئات DNA للجزيئات الذهب. القدرة على الجسيمات النانوية لاختراق الخلايا تحت ضغط منخفض تم تحديد سابقا 17. ثانيا، وبندقية الجينات يجب أن يتم تنظيمها ثابت ممكن مع الزاوية الصحيحة والمسافة. مقياس الضغط موثوقة أيضا أمر ضروري للاستنساخ، للحفاظ على سلامة الأنسجة، والإسراع بشكل صحيح جزيئات الذهب إلى أهدافهم المحددة. في الواقع، والمسافة، والتوجه، والاستقرار من المعدات أيضا على العوامل الحاسمة للرargeting ودقة التسليم regioselective. وهذه الهياكل الدماغ هي صغيرة جدا، يمكن أن الاختلافات الطفيفة في زاوية اطلاق تجعل بسهولة الإجراء بأكمله أقل موثوقية. وأخيرا، تم محفوفة إعداد وصيانة شرائح عضوي النمط قابلة للحياة مع الصعوبات لعدة عقود بعد بروتوكولات وفيرة وموثوقة لحيوانات مختلفة، مناطق الدماغ والأعمار وcocultures تتوفر 2،4،25،26 حاليا. وينبغي أن تكون هذه الإجراءات قبل تقديم الأنسجة إلى إجراءات biolistic الأمثل الاستعمال. هذا سوف يسمح بسهولة أكبر للمستخدم للتأكد unbiasedly تأثير الجسيمات biolistic وتأثير الجين مغاير على ثقافتهم. لهذه الغاية، واستخدام الجينات الفلورية مثل EYFP وEGFP على حد سواء يمكن أن تسمح للمستخدم رواية لاختبار دقة الاستهداف وأيضا اتباع جدوى الخلوية من خلال مغاير التعبير الجيني على مدى فترة طويلة من الزمن 13. العديد من الخطوات الحاسمة لموثوقيةواستنساخه استخدام هذا البروتوكول يتم تسليط الضوء في الفقرات الثلاث التالية.
لترنسفكأيشن كفاءة، يجب أن يكون تركيز الحمض النووي المناسب. أن تركيزات التي هي منخفضة جدا تعيق العائد ترنسفكأيشن في حين أن تركيزات مرتفعة جدا يمكن أن تسبب التكتل من الجسيمات النانوية. يمكن الركام من الذهب الحد بشكل كبير من كفاءة ترنسفكأيشن، يسبب توزيعات متفاوتة، ويمكن أن تؤدي إلى زيادة السمية الخلوية والاكسدة. مشاكل مع كفاءة الطلاء من المحتمل بسبب انتهاء الحل سبيرمدين (يجب أن يتم استبدال كل 2 إلى 3 أشهر). لانتشار biolistic كافية، يجب أن يكون وضع العلامات حتى. قد يكون راجعا إلى حل PVP ووضع العلامات غير متجانس من تعليق جسيمات متناهية الصغر الذهب / DNA. كما ينبغي استبداله كل 2 إلى 3 أشهر. ويمكن رؤية طلاء من الذهب النانوية على الاغاروز الكهربائي للهلام باعتباره أعلى ميغاواط الفرقة 27.
كل SYST البيولوجيم قيد التحقيق وكذلك كل صك المختلفة المستخدمة قد تتطلب تغييرات طفيفة في ضغط الغاز ليصل إلى مستويات الأمثل من ترنسفكأيشن وانتشار biolistic. المعلمة الحرجة هي ضغط نبض الهيليوم المطلوبة لتجريد المتناهية الصغر أو النانو شركات من خرطوشة من البلاستيك ودفعهم إلى الأنسجة. وهناك ضغط الغاز المرتفع يؤثر على بقاء الخلية، لأنه سيخلق موجات صدمة عبر المستهدفة وتعطيل أو فصل الأنسجة من مصفوفة 17. تهدف برميل بندقية الجينات وجود جهاز بالضبط عمودي على الأنسجة المهم للدقيقة تسليم biolistic. يجب وضع المنطقة المحددة في وسط المباشر للبرميل بحلول الساعة بدقة 10 مم من الفتحة الخارجية. هذه النتائج في القطر 3 ملم من تسليم الجسيمات الذهب حول مركز الزلزال. يجب تنظيف بندقية برميل الجينات مع الايثانول 70٪ بعد كل استخدام. لحماية الأنسجة من المجاميع الجسيمات الكبيرة، ويحتوي على برميل أيضا شبكة من النايلون التي SHOالصوفية استبدالها بانتظام للحفاظ على الأداء الأمثل. من أجل استبدال شبكة فك الغطاء ثم إدراج شبكة من النايلون جديدة بين الغطاء ويا الدائري.
Fluorescently الخلايا المسمى يجب أن يكون مرئيا على الأقل 1 – 2 بعد أيام ترنسفكأيشن حول مركز الزلزال. غياب أو اختلال وضع العلامات يمكن أن تنجم عن عدم كفاية الإعداد وعدم الاستقرار من تركيب مدفع الجينات. ملاحظات الخلايا باستخدام متحد البؤر المجهري يعتمد على عدد من العوامل: الطول الموجي للضوء الإثارة / الانبعاثات، وحجم الثقب، NA للعدسة موضوعية، معامل الانكسار من المكونات في مسار الضوء، وعمق الأنسجة، ومحاذاة الصك. ينبغي أن يكون الأمثل لكل هذه العوامل نظام قيد التحقيق.
تم استغلال التطورات الحديثة في biolistics لنجاح هذا الأسلوب. تم تعديل برميل بندقية الجينات المستخدمة في هذه الدراسة من أجل تقليل الضغط اللازم وكذلك قمع وbiolisticنمط مبعثر إلى منطقة أكثر مقيدة ومحددة 17،19. وقد حاول التعديلات برميل أخرى إلى تقييد انتشار biolistic وتخفيف الضغط تدفق 28 بعد هذا الجين مصمم خصيصا بندقية برميل صممه الدكتور أوبراين هو مكون واحد تركيبها على معيار بندقية الجينات هيليوس. بعد ذلك، تم استخدام جزيئات الذهب ميكرومتر الفرعي للحد من الغزو الجسيمات ميكرون أننا قد سبق تحديدها تسبب تلف الخلايا وفي نهاية المطاف، وفقدان متواصل مغاير التعبير الجيني. هذه التغييرات إلى إجراء biolistic تحسنت جدوى الشامل واستنساخ طريقة 13. التحسينات الأخرى على إعداد شريحة مثل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في عمق إجراء تشريح، وذلك باستخدام مصفوفة DMEM-الاغاروز للحفاظ على الدماغ، والعديد من الإنجازات الأخرى المفيدة في إعداد عضوي النمط شريحة الدماغ ذكرت سابقا 13 مكنتنا من استكشاف استخدام شرائح الكبار التي وضعت ناضجةشبكات متشابك.
في دراستنا استخدمنا أساسا الأصباغ الفلورية والجينات مغاير لتصور مورفولوجيا الخلايا وقراءات على كفاءة ترنسفكأيشن وقدرة على صورة الخصائص المورفولوجية من الخلايا العصبية في أنسجة مخ الفأر. إشارة إلى نسبة الضوضاء من تسليم ستوكاستيك داخل دائرة نصف قطرها محدد مكنتنا لعزل تماما الميناء خلية واحدة في تغصنية ضمن سياقها الأصلي. كما تستخدم العديد من الجهود للتحقيق في هذه الخصائص المورفولوجية، ورسم الخرائط "connectomics" أو لتسمية الخلايا واحد للتحليلات مختلفة، يمكن بسهولة الجمع بين هذه الطريقة مع البروتوكولات القائمة مثل الكهربية ومحوار القياسات 29،30. من الواضح، أن مجموعات من الجينات مغاير الفلورسنت تمكن من إجراء ترسيم أكثر قوة بكثير من الخلايا واحد وتوزيع مؤشر ستوكاستيك من البروتينات الفلورية، والجمع بينهما أن تحديد اللون من الخلايا الفردية 31،32. استخدام المروجين خلية معينة مثل synapsin الدبقية البروتين وحمض ييفي المنبع من اكسون جين مغاير يمكن أيضا تقييد التعبير إلى مجموعات سكانية فرعية 33. في الواقع، ويمكن أيضا أن يتم تسليم متنوعة لا تنتهي من المادة الوراثية بطريقة regioselective من الذهب النانوية باستخدام هذا الإجراء نفسه. وبالتالي يمكن تحليلها مجموع transfected المناطق مع الأساليب التقليدية، مثل تشريح وتقديم تلك المنطقة إلى immunoblotting الغربي لتحليل تأثير المترجمة من الجين مغاير.
والتحسينات في إجراءات شريحة عضوي النمط تسمح أيضا التوسع في استخدام أنسجة المخ لإجراء التجارب على المدى الطويل وكذلك تصريح استخدام الأنسجة وcocultures الأخرى وسيسهل الإجراءات ترنسفكأيشن. الدهون والبوليمر ترنسفكأيشن وقد ذكر سابقا أن تؤثر على توازن الغشاء، استيعاب، نفاذية البروتين 34 و كثيرا ما تظهر كفاءة منخفضة جدا لبالنقل الشركة المصرية للاتصالاتrminally متباينة الخلايا العصبية. خلية استهداف البضائع المحدد هو أيضا قابلة فقط إلى الخلايا التي تعبر عن مستقبلات سطح الخلية اللازمة لاستيعاب، وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن تكون انتقائية للغاية، ويمكن أن تفتقر regioselectivity 35 المستهدفة. ناقلات فيروسية وغير ذلك غالبا ما تكون صعبة ومكلفة لإنتاج، تتطلب أنظمة صارمة ويكون في بعض الأحيان أظهرت مخاوف تتعلق بالسلامة. وبالتالي تسليم Biolistic لديه قدرة لا مثيل لها لبالنقل regioselectively الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى داخل أنسجة قابلة للحياة. والذهب هو غير سامة، المزيد من التقدم في استخدام biolistics يمكن أن يمهد الطريق للاستخدامات الطبية الحيوية مثل تسليم الأدوية عبر الجلد، موسع في الجسم الحي توصيل الجينات، وكذلك العلاجات الموضعية الجين nonviral.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر ورشة العمل MRC-LMB لإنتاج المعززة برميل مدفع الجينات. ونود أيضا أن نشكر الدكتور ديفيد ر هامبسون في جامعة تورونتو لاستخدام المعدات والموارد.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |