Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
DNAのトランスフェクションは、生物科学のための非常に貴重であったとのin vivo生物学の多くの側面を維持しながら、器官型脳スライス標本への最近の進歩と、さまざまな異種遺伝子の効果が容易に調べることができた。従来のトランスフェクションの方法は、このような低利回り及び生存率の大幅な損失のような困難が伴うされたために最終的に分化したニューロンをトランスフェクトするために関心が高まっている。バイオリスティックトランスフェクションは、哺乳動物組織での使用に適しているように、まだごく最近、この技術が変更されているこれらの問題の多くを回避することができる。
加速器室に新たな修正は、遺伝子銃の発射精度が向上し、また、トランスフェクション効率の損失なしに低いガス圧(50 psi)での使用を可能にするだけでなく、パの集束位置選択的な拡散を可能にしながら浸透の深さを増加している3ミリメートル以内でrticles。また、この技術は、単純かつ退屈な微量注入よりも速く実行することである。エピソーム発現が24時間以内に検出することができ、細胞の生存はより良い、または、従来の方法に少なくとも等しいことが示された場合、一過性および安定な発現の両方がナノ粒子ボンバードメントで可能である。この技術は、しかし、という重要な利点があります:それは、このように、解剖学的に異種遺伝子の効果を分離するために、ユーザーを可能にする単一の拘束半径内局在することが、トランスフェクションを可能にする。ここでは、実行可能な大人の器官型スライスを準備し、改善された遺伝子銃を使用してトランスフェクションを位置選択的にそれらを提出する綿密なプロトコルを提示する。
もともと微粒子銃技術、ターンのフレーズ「生物学弾道」のは、植物細胞1に粒子媒介遺伝子導入のために設立されました。細胞形質転換のこの物理的方法は、DNAまたは染料などのカーゴを送達するために、不浸透性の細胞膜の物理的障壁を克服するために高速でマイクロまたはナノ粒子を加速する。それは、特定のリガンド – 受容体および/または細胞表面膜における生化学的特性に依存しないので、粒子媒介遺伝子導入を容易にそのような器官型脳切片のような生物学的システムの多様に適用することができる。
器官型スライスを使用して、彼らはin vivoでの生物学2-4に関連する多くの解剖学的および生化学的特性を維持するので、他のin vitroのプラットフォームよりも有利で ある。スライスは、主に地元の建築、彼らが発信された場所からの特性およびPRESERを節約神経化学的活動とシナプスの接続性をVEの。基礎研究のため、および医薬品の努力における脳切片の使用は、付随して、コンテキスト3,5-7などにおけるin vivoでの脳の神経生物学的挙動を測定し、監視することが可能生物工学的操作の数が増加している。器官型スライスベースのアッセイ系を使用する主な利点は、それが容易に実験的な制御を提供し、細胞外環境の正確な操作を可能にすることである。
実り、器官型スライス培養系のような脳領域の多様から確立が、皮質、脊髄および小脳8-10、に限定されてきた。さらに、共培養の数は、遠位の脳領域間で細胞間コミュニケーションを評価するだけでなく、神経細胞と病的細胞11,12の間を可能にする、実証されている。多くのプロトコルは、すでにsに確立されているuccessfully培養器官スライスおよび長期的な生存能力を維持することができ、多くの最近の研究では、今から13膜界面方法やさまざまな修正を利用する。この原則は、多孔質メンブレンフィルター上のスライスを配置することによって、培地および培養器の加湿雰囲気との界面での器官型スライスを維持します。メディアは、このように、毛管運動を介して、器官のスライスを養うために十分な栄養素を提供することができます。 ( – ; P3 – 9日齢3)通常のスライスは生後初期動物から調製されてきた。しかし、これらのスライスからの脳組織は、細胞の可塑性の高いレベルを表示し、実行可能な文化を取得すると便利です機械的ストレスに対する固有の抵抗を持って、まだ成熟したシナプスと神経解剖学的回路が完全に生後2〜3週間まで、 生体内で開発されていない14。例えば、以前の観察は、P0から得られた海馬スライス示していた – 、1新生児の高度viabもののル調製後、次第にいくつかの形態学的特徴を失った。基本的に、それらは高齢の動物15,16から器官培養物と比較して、脱分化をする可能性が高かった未熟細胞を示唆して長期培養には不向きであることが示された。このような理由から私たちの方法は、成熟と建築の開発は、その最終段階に達している13,17-21れる成人の器官型脳スライスに最適化されています。それにもかかわらず、この方法はまた、新生児や幼若器官のスライスに適しています。
実行可能な器官のスライスが生成されるとスライスを含む全プレートはバイオリスティックマウントにし、納期およびトランスフェクションを位置選択的に提出することができます。 (組織への開口部から)直接のスライスの上10mmの距離で90°に配向されます( 図1で説明したように)遺伝子銃の適切な実装は、40nmの迅速なバイオリスティック送達が行く許可ldは粒子は貨物をコーティングした。このような色素や蛍光DNAベクターとして、これらの貨物だけでなく、関心のある任意の遺伝子は、容易に容易に実行可能なスライスに配信されます。従って、この方法は、実行可能な器官型脳切片に、位置選択的な方法で、貨物コーティングされた金ナノ粒子を送達するのに必要なプロトコルについて説明します。遺伝子銃バレルと最適な実装が、図1で見ることができます。改良されたバレルとナノ粒子の弾道についての詳細は、 ら 17オブライエンを参照してください。
その後の改良はまた、ユーザがそのようなマイクロキャリアのローディング量(MLQ)として定義される標的領域ごとに配信金の適切な量、等の条件を最適化するために、及びDNAローディング比として定義金1mg当たりロードされたDNAの量を決定するために示されている(DLR)。金粒子上にDNAを沈殿させ、実際の遺伝子銃」カートリッジを含むテフゼルチューブにそれらをロードする前9 ;,それが組織や条件のうち、わずかに異なることが、各トランスフェクションのために必要とされるDNAと金の量を計算する必要がある(比率は1に1mgの金と1μgのDNAの間に維持されるべきである:5)。それは、そうでなければ、DNA被覆金粒子を微粒子銃の広がりの全体的な均一性を低下させるだけでなく、組織損傷および細胞障害性を高めることができると期待凝集、より大きく形成する互いに接着できたDLRするMLQの適切な比率を準備することが重要である。
この方法は、テストの結果、新生児、若年および成人器官型脳切片のために従順であると決定された、バイオリスティック送達における最近の改善を示している。さらに、遺伝子銃バレルの減少バイオリスティック広がりを活用することにより、ユーザが選択的に脳内の時間を守る地域をトランスフェクトすることができます。適切なインキュベーション時間の後、24および48の間のその最大速度に到達する蛍光タンパク質の発現は、時間は、落射蛍光および共焦点顕微鏡によって可視化することができる。これらのフルオロフォアは、生物学的に関連する構造物内の個別の細胞の形態学的解析や局在を可能にする。しかしながら、他の異種遺伝子による器官型スライスの位置選択的な調節は、これらの調製物に適する任意の他の試験によってモニターすることができる。ローカライズされた遺伝子送達のための可能な作業の戦略を図2に示す。
プロトコルが強化された遺伝子銃を使用して、大人の器官型スライスに染料および遺伝物質を提供するためのアプローチについて説明します。本質的には、色素の種類と可能な遺伝子の多様な生物学的な問題の広い範囲に答えることが、この方法は、多面的かつ従順にする。生物学的に関連するアーキテクチャ内の局所的な領域の異種遺伝子変調が前に簡単に実現可能ではなかったように、特定の脳領域に、この場合に、使用される位置選択的配信方法は、実験のための新たな道を開く。私たちは、以前に、この方法は、それが何週間13のための改良された細胞の生存および異種遺伝子発現を示した成熟シナプスが完全に形成され、成体器官スライスに使用することができることを決定した。哺乳類の脳、並びに他の組織のための新規で改良された培養条件の出現により、位置選択的な遺伝的変調の使用はbioche多種多様のためにますます有用になるであろうmical分析。
私たちがここで強調表示して、以前に他の人が言及しなければならない24のように、多くの異なる要因が容易にバイオリスティックデリバリーの精度や信頼性に影響を与える可能性があります。第一に、染料またはDNAに連結された金粒子の調製は、十分に凝集を防止し、カートリッジ貨物排出を容易にするためにバランスをとらなければならない。 DNA-金微粒子溶液中のカルシウムおよびスペルミジンは、金ナノ粒子へのDNA分子の結合を補助することができる。減圧下で細胞に浸透するナノ粒子の能力は、以前に17を決定した。第二に、遺伝子銃、正しい角度と距離を可能な限り安定したマウントする必要があります。信頼性の高い圧力計は、組織の完全性を維持するために、及び適切に意図されたターゲットへの金粒子を加速するために、また再現性のために必要である。実際に、機器の距離、方向、および安定性は、tのための重要な因子であるargetingと位置選択的配信の精度。これらの脳構造が非常に小さいとして、発射角の小さな変化を簡単に信頼性の低い手順全体をレンダリング可能性があります。そして最後に、実行可能な器官型スライスの準備と維持は、異なる動物のために、まだ脳の領域に豊富で信頼性の高いプロトコルに何十年もの間の困難に満ちていた、年齢や共培養は現在、2,4,25,26ご利用いただけます。これらの手順は、バイオリスティックプロシージャに組織を提出する前に、ユーザーに最適化されなければならない。これは、より容易にunbiasedlyバイオリスティック粒子の衝突、自分培養物に対する異種遺伝子の効果を確認するためにユーザーを可能にする。この目的を達成するために、そのようなEYFPおよびEGFPなどの蛍光遺伝子の使用は、ターゲティングの精度をテストし、また、時間13の持続的な期間にわたり、異種遺伝子発現を介した細胞の生存率を追跡する新たなユーザーに許可することができます両方。信頼性のための重要なステップの多くは、そしてこのプロトコルの再現性のある使用は、次の3つの段落で強調表示されます。
効率的なトランスフェクションのために、DNA濃度が適切である必要があります。高すぎる濃度は、ナノ粒子の凝集を引き起こす可能性がありながら、低すぎる濃度は、トランスフェクション収量を妨げる。金の凝集体は劇的に、トランスフェクション効率を低下させる不均一な分布を引き起こし、増加細胞毒性と酸化ストレスにつながることができます。スペルミジン溶液の満了(2〜3ヶ月毎に交換する必要があります)による塗着効率の問題が可能性があります。適切なバイオリスティックスプレッドについては、ラベリングは偶数でなければなりません。金ナノ粒子/ DNA懸濁液の不均一な標識は、PVP溶液に起因する可能性がある。また、2〜3ヶ月毎に交換する必要があります。金ナノ粒子のコーティングは、より高いMWバンド27としてアガロースゲル電気泳動上で見ることができる。
各生物学的SYST調査中の全角だけでなく、使用される各異なる機器は、トランスフェクションおよびバイオリスティック広がりの最適化されたレベルに到達するために、ガス圧の小さな変化を必要とする場合があります。重要なパラメータは、プラスチックカートリッジからマイクロまたはナノキャリアを除去し、組織にそれらを推進するために必要なヘリウムパルスの圧力である。それは、ターゲットを横切って衝撃波を作成し、マトリックス17からの組織を破壊または離脱するため、高いガス圧は、細胞の生存に影響を与える。遺伝子銃バレルを目指して組織に正確に垂直装置を有することは、正確なバイオリスティック送達のために重要です。選択されたエリアは、外側の開口部から正確に10ミリメートルでバレルの直接の中央に配置する必要があります。これは、震源の周りに金粒子送達の直径3mmになる。遺伝子銃バレルは、各使用後に70%エタノールで清掃する必要があります。大粒子凝集体から組織を保護するために、バレルもSHOナイロンメッシュが含まれています最適な性能を維持するために定期的に交換することがULD。メッシュを交換するために、キャップとOリングとの間の新たなナイロンメッシュを挿入し、次にキャップを外します。
2日震源地周辺でトランスフェクション後 – 蛍光標識された細胞は、少なくとも1表示されるはずです。不在または標識の位置ずれは、遺伝子銃実装の不十分な準備と不安定に起因することができます。共焦点顕微鏡を用いた細胞の観察は、多くの要因に依存する:励起/発光光の波長、ピンホールサイズ、対物レンズのNA、光路中の成分の屈折率、組織の深さ、および配置を楽器。これらの要素は、調査中の各システムのために最適化されるべきである。
微粒子銃における最近の進歩は、この方法の成功のために活用された。本研究で用いた遺伝子銃のバレルは、必要な圧力を減少させるだけでなく、遺伝子銃を集中させるために改変されたより制約と特定の領域17,19への散乱パターン。他のバレルの変更はバイオリスティック広がりを制限し、流出圧力28を削減することを試みた、まだ博士オブライエンがデザインし、このカスタム設計された遺伝子銃バレルは、標準的なヘリオス遺伝子銃に取り付けられた単一のコンポーネントです。続いて、サブミクロンの金粒子は、細胞の損傷および最終的には、持続的な異種遺伝子発現の損失を引き起こした私たちは、以前に決定されたマイクロ粒子の侵襲性を減少させるために使用した。バイオリスティックプロシージャへのこれらの変更は、方法13の全体的な実現可能性と再現性を向上させた。そのような器官型脳スライス標本中の深いスライス手順のトラブルシューティング、脳を維持するためにDMEM-アガロースマトリックスを用いて、および多数の他の有用な進歩としてスライス標本上のその他の改良点は、以前13は大人のスライスの使用を探索することができましたことを報告成熟した開発したシナプスのネットワーク。
われわれの研究では、主にトランスフェクション効率の読み出し及び画像化する能力、マウス脳組織における神経細胞の形態学的特徴として、細胞の形態を可視化するために染料や蛍光異種遺伝子を使用した。定義された半径内の確率的デリバリーの信号対雑音比は完全にネイティブのコンテキスト内で、単一の細胞の樹状港を隔離することができました。多くの努力は、これらの形態学的特徴、マッピング'connectomics」を調査することや各種分析のための単一の細胞を標識するために使用されているように、この方法は簡単にそのような電気生理学および神経突起の測定値29,30などの既存のプロトコルと組み合わせることができる。明らかに、蛍光異種遺伝子の組み合わせは、蛍光タンパク質の確率的な分布として単一細胞のより堅牢な描写を可能にすることができ、その組み合わせは、個別のセル31,32の色を決定するであろう。そのような異種遺伝子エクソンの上流シナプシンおよびグリア線維酸性タンパク質のような細胞特異的プロモーターの使用も、亜集団33に式を制限することができます。実際に、遺伝物質の果てしない多様も、これと同じ手順を使用して金ナノ粒子による位置選択的方法で送達することができる。総トランスフェクションした領域は、このようにそのような解剖などの伝統的な方法で分析し、異種遺伝子の局所的な影響を分析するために西部の免疫ブロッティングにその領域を提出することができた。
器官型スライス手順の改善は、長期の実験のために脳組織のより広い使用を可能にするだけでなく、他の組織との共培養の使用を許可し、トランスフェクション手順を容易にするであろう。脂質とポリマーのトランスフェクションは、予め34及び頻繁にはテトランスフェクトする非常に低い効率を示す膜ホメオスタシス、内在化、タンパク質の透過性に影響を与えることが報告されているrminallyニューロンを分化した。細胞標的の特定の貨物は、内在化に必要な細胞表面受容体を発現する細胞にも適しており、そしてこの方法は、高度に選択的であり得るが、それは位置選択性35標的欠くことができる。ウイルスベクターは、他の方法でしばしば製造が困難かつ高価であり、厳しい規制を必要とする際に安全性の懸念が実証されている。バイオリスティック送達は、このように位置選択的に生存可能な組織内のニューロンおよび他の細胞型をトランスフェクトするための比類のない能力を有する。金は、非毒性であるため、微粒子銃の使用におけるさらなる進歩は、経皮薬剤送達、非侵襲的in vivoでの遺伝子送達のほか、ローカライズされた非ウイルス遺伝子治療などの生物医学用途のために道を開く可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、強化された遺伝子銃バレルの生産のために、MRC-LMBのワークショップに感謝したいと思います。また、機器やリソースの使用のためにトロント大学のデビッド·R·ハンプソンに感謝したいと思います。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |