Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
Transfeksjon av DNA har vært uvurderlig for biologi og med nylige fremskritt til organotypic hjernen slice forberedelser, kan effekten av ulike heterologe gener dermed bli undersøkt lett og samtidig opprettholde mange aspekter av in vivo biologi. Det har vært økende interesse for å transfektere terminalt differensierte nevroner som konvensjonelle transfeksjonsmetoder har vært nervøs med vanskeligheter som lave avlinger og betydelige tap i levedyktighet. Biolistic transfeksjon kan omgå mange av disse vanskelighetene ennå bare nylig har denne teknikken blitt modifisert slik at det er mottagelig for bruk i pattedyr-vev.
Nye endringer i gasskammeret har forbedret genet pistolens skyting nøyaktighet og økt sine dypet av penetrasjon og samtidig tillate bruk av lavere gasstrykk (50 psi) uten tap av transfeksjon effektivitet så vel som tillater en fokusert regioselektiv spredning av particles til i løpet av 3 mm. I tillegg, er denne teknikken rett frem og hurtigere å utføre enn kjedelige microinjections. Både forbigående og stabilt uttrykket er mulig med nanopartikkel bombardement hvor episomal ekspresjon kan påvises i løpet av 24 timer og celleoverlevelse ble vist å være bedre enn, eller minst lik, konvensjonelle metoder. Denne teknikken har imidlertid en avgjørende fordel: den tillater transfeksjon å være lokalisert innenfor en enkelt behersket radius og dermed slik at brukeren kan anatomisk isolere det heterologe genet effekter. Her presenterer vi en grundig protokoll for å forberede levedyktig voksen organotypic skiver og sende dem til regioselektiv transfeksjon ved hjelp av en forbedret genet pistol.
Opprinnelig biolistic teknikk, en turn-of-setning for "biologiske ballistikk", ble etablert for partikkel-mediert genoverføring inn i planteceller en. Denne fysiske metode for celletransformasjon akselererer mikro-eller nanopartikler med høy hastighet til å overvinne de fysiske barrierer av de tette cellemembraner for å levere last som for eksempel DNA-eller fargestoffer. Fordi det ikke er avhengig av spesifikke ligand-reseptorer og / eller biokjemiske egenskaper ved de celleoverflatemembraner, kan partikkel-mediert genoverføring lett kan anvendes på en rekke forskjellige biologiske systemer slik som organotypic hjerneskiver.
Bruke organotypic skiver har fordeler fremfor andre in vitro-plattformer siden de opprettholder mange anatomiske og biokjemiske egenskaper som er relevante for in vivo biologi 2-4. Sektorene hovedsakelig bevare de lokale arkitektoniske egenskaper fra der de har sin opprinnelse og preserve neurochemical aktivitet og tilkobling av synapser. Bruken av hjernen skiver for grunnleggende forskning, og i farmasøytiske bestrebelser, har samtidig økt med antall mulige bioteknologiske manipulasjoner for å måle og overvåke de nevrobiologiske atferd av hjernen i en in vivo som kontekst 3,5-7. De største fordelene for bruk av organotypic skive-baserte analysesystemer er at det gir enkel eksperimentell kontroll og tillater presis manipulasjoner av ekstracellulære miljøer.
Fruktbar måte, har organotypic skive kultur systemer er etablert fra en rekke områder av hjernen slik som, men ikke begrenset til, cortex, ryggmargen, og lillehjernen 8-10. Videre har en rekke cocultures blitt påvist, noe som tillater vurdering av intercellulær kommunikasjon på tvers av de distale områder av hjernen, så vel som mellom nevroner og patologiske celler 11,12. Mange protokoller er allerede etablert for å successfully kultur organotypic skiver og kan opprettholde langsiktig levedyktighet og mange nyere studier nå benytte membran grensesnittmetoder og ulike endringer i det 13. Dette prinsippet opprettholder organotypic skiver ved grenseflaten mellom mediet og inkubatoren er fuktet atmosfære ved å plassere skivene i en porøs membranfilter. Mediet kan dermed gi tilstrekkelig næring til å mate de organotypic skiver via kapillær bevegelse. Vanligvis skiver er utarbeidet fra tidlig postnatal dyr (3-9 dager gammel, P3 – 9). Imidlertid hjernevev fra disse skiver viser en høy grad av cellulær plastisitet og har en iboende motstandsdyktighet mot mekaniske påkjenninger, som er nyttig for å få levedyktige kulturer, men modne synapser og nevroanatomi kretser har ikke fullt utviklet in vivo til 2 til 3 ukers alder 14. For eksempel, hadde tidligere observasjoner vist at hippocampus skiver hentet fra P0 – en nyfødte, selv om svært viable etter forberedelse, gradvis mistet noen morfologiske kjennetegn. I hovedsak ble de vist seg å være uegnet for langsiktige kulturer tyder umodne celler var mer sannsynlig å de-differentiate forhold til organotypic kulturer fra eldre dyr 15,16. Av denne grunn vår metode har blitt optimalisert for voksne organotypic hjernen skiver der modning og arkitektoniske utvikling har nådd sin siste fasene 13,17-21. Likevel er denne metoden også egnet for nyfødte og juvenile organotypic skiver.
Når levedyktige organotypic skiver har blitt produsert hele platen inneholder skiver kan bli brakt til biolistic mount og sendt til regioselektiv levering og transfeksjon. Riktig montering av genet pistolen (som beskrevet i figur 1), orientert 90 ° i en avstand på 10 mm direkte over skivene (fra åpningen til vevet), tillater den hurtige biolistic levering av de 40 nm gåld partikkel belagt last. Disse lastene som fargestoffer og fluorescerende DNA vektorer, samt eventuelle gen av interesse, er lett overgis i levedyktige skiver med letthet. Denne fremgangsmåte beskriver således protokollen er nødvendig for å levere, på en regioselektiv måte, laste belagt gull nanopartikler til levedyktige organotypic hjerneskiver. Genet pistol og optimal montering kan sees i figur 1. For ytterligere informasjon om de forbedrede fat og nanopartikkel ballistikk, se O'Brien, et al. 17.
Senere forbedringer er også indikert for brukeren å optimalisere betingelsene for eksempel den riktige mengde gull avlevert pr target-området, definert som Mikrobærere lastes Mengde (MLQ), og for å bestemme mengden av DNA lastet pr mg av gull, definert som DNA lastes Ratio (DLR). Før utløsende DNA på gullpartikler og legger dem i Tefzel slangen som består av selve genet pistol 'patroner9 ;, det er nødvendig å beregne mengden av DNA og gull er nødvendig for hver transfeksjon som kan variere noe mellom vev og forhold (forhold må opprettholdes mellom 1 mg gull og 1 mikrogram DNA til 1: 5). Det er viktig å forberede riktig andel av MLQ til DLR som ellers DNA belagt gull partikler kan feste sammen danner større enn forventet tettbebyggelse, noe som kan redusere den totale homogenitet av biolistic spredning samt øke vevsskade og cytotoksisitet.
Denne metoden viser siste forbedringene i biolistic levering, som er testet og fastslått å være mottagelig for neonatale, unge og voksne organotypic hjernen skiver. Videre, ved å utnytte genet pistol reduserte biolistic spredning, er at brukeren nå i stand til selektivt transfektere en punktlig region i hjernen. Etter passende inkubasjonstid, ekspresjonen av de fluorescerende proteiner, som når sitt maksimum frekvenser mellom 24 og 48time, kan bli visualisert ved epifluorescence og konfokal mikroskopi. Disse fluoroforer tillate morfologisk analyse og lokalisering av individuelle celler innenfor biologisk relevante strukturer. Imidlertid kan den regioselektiv modulering av de organotypic skiver med andre heterologe gener også overvåkes ved andre tester mottagelig for disse preparater. Mulige arbeids strategier for den lokaliserte genet levering er presentert i figur 2.
Protokollen beskriver tilnærminger for å levere fargestoffer og genetisk materiale inn i voksen organotypic skiver ved hjelp av en forsterket gen pistol. Hovedsak, hvilke typer av fargestoffer og ulike mulige gener gjør denne metoden mangefasettert og mottagelig for å svare på et bredt spekter av biologiske spørsmål. Den regioselektiv leveringsmetode som brukes, i dette tilfelle til spesifikke hjerneregion, åpner nye muligheter for eksperimentering som heterologt gen modulering av lokaliserte områder i et biologisk relevant arkitektur har ikke vært lett gjennomførbart før. Vi har tidligere bestemt at denne metoden kan anvendes på voksne organotypic skiver, der modne synapser er fullstendig dannet, som det viste forbedret celleoverlevelse og heterolog genekspresjon i mange uker 13. Med bruk av nye og forbedrede dyrkningsbetingelser for mammalske hjerne så vel som andre vev, vil bruken av regioselektiv genetiske modulasjoner blitt stadig mer nyttig for et bredt utvalg av Biochemical analyser.
Som vi skal markere her og tidligere nevnt av andre 24, kan mange ulike faktorer lett påvirke nøyaktigheten og påliteligheten av biolistic levering. For det første må fremstillingen av gullpartikkel knyttet til fargestoffer eller DNA være tilstrekkelig balansert for å forhindre aggregering og å lette patron lasten utstøtning. Kalsium og spermidin i DNA-gull mikropartikler løsning kan hjelpe bindingen av DNA-molekyler til de gull nanopartikler. Muligheten for nanopartikler å trenge inn i cellene under redusert trykk ble tidligere fastslått 17. For det andre må genet gun monteres så jevnt som mulig med den riktige vinkel og avstand. En pålitelig trykkmåler er også nødvendig for reproduserbarhet, for å opprettholde integriteten til vev, og for å akselerere riktig gullpartikler til sine tiltenkte mål. Faktisk avstand, retning og stabilitet av utstyr er også en avgjørende faktorer for targeting og presisjon av regioselektiv levering. Ettersom disse hjernestrukturer er svært liten, kan mindre variasjoner i avfyring vinkel lett gjengi hele prosedyren mindre pålitelig. Og til slutt, utarbeidelse og vedlikehold av levedyktige organotypic skiver har vært nervøs med vanskeligheter for mange tiår ennå rikelig og pålitelige protokoller for forskjellige dyr, hjerneregioner, aldre og cocultures er for tiden tilgjengelig 2,4,25,26. Disse prosedyrene skal være bruker optimalisert før du sender vev til biolistic prosedyrer. Dette vil lettere tillate brukeren å unbiasedly fastslå virkningen av de biolistic partikler, og effekten av det heterologe gen på sine egne kulturer. For å oppnå dette, kan bruk av fluorescerende gener som EYFP og EGFP både tillate en roman bruker å teste målretting presisjon og også følge den cellulære levedyktighet gjennom heterologe genuttrykk over en lengre tidsperiode 13. Mange av de kritiske trinnene for påliteligog reproduserbar bruk av denne protokollen er uthevet i følgende tre avsnitt.
For effektiv transfeksjon, må DNA-konsentrasjon være hensiktsmessig. Konsentrasjoner som er for lave vil hindre transfeksjon utbytte, mens konsentrasjoner som er for høye kan forårsake agglomerering av nanopartikler. Aggregater av gull kan dramatisk redusere transfeksjon effektivitet, forårsaker ujevne fordelinger, og kan føre til økt cytotoksisitet og oksidativt stress. Problemer med belegg effektivitet skyldes mest sannsynlig utløpet av spermidin løsning (bør skiftes hver 2 til 3 måneder). For en tilstrekkelig biolistic spredning, må merkingen være enda. En ikke-homogen merking av gull nanopartikkel / DNA-suspensjonen kan være på grunn av PVP-løsning. Det bør også skiftes hver 2 til 3 måneder. Belegg av gull nanopartikler kan sees på agarose gel-elektroforese som et høyere MW båndet 27..
Hver biologisk system under etterforskning samt hver annen instrument som brukes kan kreve små endringer i gasstrykk for å nå optimale nivåer av transfeksjon og biolistic spredning. Den kritiske parameter er trykket av helium puls som kreves for å strippe den mikro-eller nano-bærere fra plastpatronen og drive dem inn i vevet. En høy gasstrykket vil påvirke celleoverlevelse, fordi den vil skape sjokkbølger over hele målet og forstyrrer eller løsne vev fra matrisen 17.. Sikter genet pistol og har anordningen nøyaktig vinkelrett på vev er viktig for nøyaktig biolistic levering. Det valgte område bør plasseres i direkte sentrum av sylinderen på nøyaktig 10 mm fra den ytre åpning. Dette resulterer i en 3 mm diameter av gullpartikkel levering rundt i sentrum. Genet pistol bør rengjøres med 70% etanol etter hver bruk. For å beskytte vev fra store partikkel-aggregater, inneholder sylinderen også en nylonmesh som should byttes ut regelmessig for å opprettholde optimal ytelse. For å erstatte mesh skru hetten deretter sette inn en ny nylon mesh mellom hetten og o-ring.
Fluorescensmerkede celler skal være synlig på minst 1-2 dager etter transfeksjon rundt i sentrum. Fravær eller forskyvning av merking kan skyldes utilstrekkelig forberedelse og ustabilitet av genet pistol montering. Observasjonene av celler ved hjelp av konfokal mikroskopi, avhenger av en rekke faktorer: bølgelengden til eksitasjon / emisjon lys, pinhole størrelse, NA av objektivlinsen, brytningsindeks av komponenter i lysbanen, dybden av vevet, og justeringen av instrumentet. Disse faktorene bør være optimalisert for hvert system under etterforskning.
Nylige fremskritt i biolistics ble utnyttet for å lykkes med denne metoden. Genet gun barrel brukt i denne studien ble modifisert for å redusere trykket som er nødvendig, så vel som trakt biolisticscatter mønster i et mer begrenset og bestemt område 17,19. Andre fat modifikasjoner har forsøkt å begrense biolistic spredning og redusere utstrømningen trykket 28 men dette tilpasset designet genet pistol designet av Dr. O'Brien er en enkelt komponent montert på standard Helios Gene pistol. Deretter ble sub-mikrometer gullpartikler som brukes til å redusere invasivitet av mikrometerpartikler som vi tidligere hadde bestemt forårsaket cellulær skade og til slutt, vedvarende tap av heterolog gen-ekspresjon. Disse endringer i biolistic fremgangsmåte forbedres den samlede gjennomførbarheten og reproduserbarheten av metoden 13. Andre forbedringer på skive forberedelse for eksempel inngående feilsøking av slicing prosedyre, ved hjelp av en DMEM-Agarose matrise for å bevare hjernen, og en rekke andre nyttige fremskritt i organotypic hjernen skive forberedelse tidligere rapportert 13 aktivert oss å utforske bruken av voksne skiver som har utviklet modensynaptiske nettverk.
I vår undersøkelse vi brukt hovedsakelig fluorescerende fargestoffer og heterologe gener for å visualisere cellemorfologi som en avlesning på transfeksjon effektivitet og evne til å bilde de morfologiske karakteristika for nevroner i mus hjernevev. Signal til støyforhold på den stokastiske levering innen en definert radius aktivert oss å fullstendig isolere en enkelt celle dentritic havn innenfor sin opprinnelige kontekst. Som mange innsats brukes til å undersøke disse morfologiske egenskaper, for å kartlegge 'connectomics' eller påføres enkeltceller for ulike analyser, kan denne metoden lett kombineres med eksisterende protokoller som elektrofysiologi og neurite målinger 29,30. Øyensynlig, kombinasjoner av fluorescerende heterologe gener kunne muliggjøre en mer robust avgrensning av enkeltceller som stokastisk fordeling av fluorescerende proteiner, og deres kombinasjoner vil bestemme fargen av de individuelle celler 31,32. Bruken av cellespesifikke promotorer slik som synapsin og glial fibrillary syre protein oppstrøms for det heterologe gen ekson kan også begrense ekspresjonen til 33 subpopulasjoner. Faktisk kan den uendelige rekke av genetisk materiale også bli levert i en regioselektiv måte av gull nanopartikler ved hjelp av den samme prosedyre. De samlede transfektert regioner kunne således bli analysert med tradisjonelle metoder, slik som disseksjon og sende den regionen til vestlig immunoblotting for å analysere den lokaliserte virkning av det heterologe genet.
Forbedringer i organotypic skive prosedyrer vil også tillate større bruk av hjernen vev for langsiktig eksperimentering samt tillate bruk av andre vev og cocultures og ville lette transfeksjonsteknologier prosedyrer. Lipid og polymer transfeksjon tidligere har blitt rapportert å påvirke membran homeostase, internalisering, protein permeabilitet 34 og ofte viser svært lav effektivitet for å transfektere terminally differensiert nevroner. Cell bestemt laste målrettingen er også mottagelig bare til celler som uttrykker celleoverflatereseptorer som er nødvendig for internalisering, og selv om denne metode kan være svært selektiv, kan den mangel målrettet regioselectivity 35. Virale vektorer ellers er ofte vanskelige og kostbare å produsere, krever strenge regler og har til tider vist sikkerhetsmessige bekymringer. Biolistic levering har dermed en enestående evne til å regioselectively transfektere nevroner og andre celletyper innenfor levedyktig vev. Som gull er ikke giftig, ytterligere fremskritt i bruk av biolistics kunne bane vei for biomedisinske anvendelser som transdermal farmasøytiske levering, noninvasive in vivo genet levering, samt lokaliserte ikke-virale genterapi.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke MRC-LMB verksted for produksjon av den forsterkede genet pistol. Vi ønsker også å takke Dr. David R. Hampson ved Universitetet i Toronto for bruk av utstyr og ressurser.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |