Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
DNA转染是非常宝贵的生物科学和最新进展,以器官型脑片的准备,各种异源基因的影响因此可以很容易地调查,同时保持体内生物学的许多方面。已经有越来越多的关注,转染终末分化的神经元的传统转染方法一直困难重重,如低收益率和存活率显著损失。基因枪转染可以规避许多的这些困难,但只有最近,这种技术被修改,使得它适合于在哺乳动物组织中。
新修改的加速器腔增强了基因枪的射击精度,并增加了它的深度渗透,同时还允许使用较低的气体压力(50磅),而转染效率的损失,以及允许PA的聚焦区域选择性扩散rticles在3毫米。此外,这种技术是直线前进和速度比乏味显微注射来执行。瞬态和稳定表达是可能的纳米粒子轰击,其中附加型表达可以在24小时内被检测到,并在细胞存活被证明是优于或至少等于,常规的方法。该技术具有但是1关键优点:它允许转染到在单个约束半径之内本地化从而使用户能够将解剖分离的异源基因的影响。在这里,我们提出了一个深入的协议,准备可行的成人器官切片,并提交他们使用了一种改进的基因枪区域选择性的转染。
最初的生物射弹技术中,点灯-的短语“生物弹道学”,建立了粒子介导的基因转移到植物细胞1。细胞转化的这种物理方法加速微 – 或纳米颗粒以高速来克服不渗透细胞膜的物理屏障,以提供货物,如DNA或染料。因为它不依赖于特定的配体 – 受体和/或在细胞表面的膜的生化性质,粒子介导的基因转移可以容易地适用于各种生物系统中,如器官型脑切片。
利用器官切片比其他优势, 在体外平台,因为他们认为很多解剖和生化性质是相关的体内生物学2-4。切片大多保存从那里起源和preser当地的建筑特色已经神经化学活性和突触连接。使用脑切片用于基础研究的,并在药剂的努力,已伴随增加,可能的生物技术操作来测量和监测大脑在体内的神经生物学行为,如上下文3,5-7数。使用器官切片为基础的检测系统的主要优点是它提供了容易的实验控制,并且允许细胞外环境的精确操作。
富有成效,器官切片培养系统已经建立了从各种脑区域,例如,但不限于,皮质,脊髓和小脑8-10。此外,一些共同培养已经证实,这允许在远端的脑区,以及神经元和神经病理细胞11,12间的连接通讯的评估。许多协议已经建立送uccessfully文化的器官切片,并能保持长期的活力和最近的许多研究,现在利用膜界面的方法和各种修改它13。这个原理通过将片上的多孔膜过滤器保持器官切片在培养基和培养器的加湿空气之间的界面。因此,媒体可以提供足够的营养物质通过毛细血管运动喂器官切片。通常切片已准备从出生后早期的动物(3 – 9天之久; P3 – 9)。然而,从这些切片的脑组织显示细胞可塑性的高水平和有机械应力的固有电阻,这是有益的,以获得可行的培养物,但成熟的突触和神经解剖学电路没有完全开发在体内直到2至3周龄14。例如,以前的观察结果表明,从P0得到的海马切片 – 1新生儿,虽然高度VIAB乐以下准备,逐渐失去了一些形态特征。本质上,它们被证明不适合于长期培养表明未成熟细胞更可能去分化相比从老年动物15,16器官型培养。由于这个原因,我们的方法进行了优化,成人器官大脑切片在其成熟和建筑发展已达到其终端阶段13,17-21。然而,这种方法也适用于新生儿和少年器官切片。
一旦可行器官切片已经生产含有切片的整个板可以被带到该基因枪安装并提交给区域选择性输送和转染。正确安装的基因枪(如在图1中描述的)的,面向90°的距离为10毫米的正上方的片(从开口至所述组织),允许快速基因枪递送的40纳米的去LD颗粒涂层货物。这些货物如染料和荧光DNA载体,以及任何感兴趣的基因,可容易地输送到活切片自如。这种方法从而说明了此协议需要交付,在区域选择性的方式,货物涂层的金纳米粒子转化为可行的器官大脑切片。基因枪枪管和最佳的安装可以看出,在图1中 ,有关改进枪管和纳米弹道的详细信息,请参阅奥布莱恩等17。
随后精炼还适用于用户优化的条件,如金每个目标区域传递适量的,其定义为微载体装载量(MLQ),并以确定的DNA的每金毫克装载量,定义为DNA加载比率(DLR)。此前沉淀的DNA在金颗粒和其装入Tefzel管,它包括实际基因枪“墨盒9;,它是必要的,以计算DNA和金的需要为每个转染,可以组织和条件之间略有不同的量(比率应保持在1毫克黄金和1微克DNA到1:5)。至关重要的是,制备MLQ的适当比例,以DLR另有DNA包被的金颗粒会粘附在一起,形成比预期的结块,这可能会降低基因枪传播的整体均匀性,以及增加组织损伤和细胞毒性更大。
这种方法显示了基因枪递送的最新改进,这已经过测试,确定为适合新生儿,青少年和成人的器官大脑切片。此外,通过利用基因枪枪管的降低基因枪传播,用户现在能够选择性地转染准时区域中的脑。下列适当的温育时间,所述荧光蛋白的表达,从而达到其24和48之间的最大速率小时,可通过荧光和共聚焦显微镜观察。这些荧光团允许范围内的生物相关结构的形态学分析和单个细胞的定位。然而,器官切片由其它异源基因的区域选择性调制,也可以通过适合于这些制剂中的任何其他测试来监测。可能的工作策略的局部基因递送示于图2。
本协议描述的方法通过使用增强基因枪提供染料和遗传物质进入成人器官切片。本质上,染料的种类和各种可能的基因使该方法多方面和适合于回答广泛的生物学问题。用,在这种情况下,以特定的大脑区域中的区域选择性递送方法,打开用于实验作为局部区域的异源基因的调制的新途径的生物学相关架构内尚未容易可行之前。我们先前已经确定的,该方法能对成人器官切片,其中成熟的突触被完全成形的,因为它显示出改善的细胞存活和异源基因表达的许多周13被使用。用的新的和改进的培养条件为哺乳动物大脑以及其它组织的出现,使用区域选择性遗传调制的,将成为各种各样bioche的日益有用MICAL分析。
正如我们将要在这里和前面突出显示由他人24所提到的,许多不同的因素可容易地影响基因枪递送的准确性和可靠性。首先,与染料或DNA的金颗粒的制备方法,必须有足够的平衡,以防止聚集,并促进暗盒货物驱逐。钙和亚精胺中的DNA的金微粒溶液可以帮助DNA分子结合于金纳米颗粒。穿透细胞减压能力的纳米颗粒被预先决定的17。其次,基因枪必须安装尽可能平稳和正确的角度和距离。一个可靠的压力表也是必要的重复性,以维持组织的完整性,并妥善加快金颗粒其预定的目标。事实上,距离,方向,和设备的稳定性也是一个重要的因素为吨argeting和精确的区域选择性交付。作为这些大脑结构是非常小的,在触发角的微小变化可以很容易地使整个过程更不可靠。最后,编写和维护的可行器官切片已经误人子弟用了几十年的困难对于不同的动物,大脑区域,年龄和共培养物还丰富,可靠的协议是目前可用的2,4,25,26。这些程序应该是用户提交的优化组织,以基因枪过程之前。这将会更容易地允许用户无偏确定该生物射弹粒子的影响,所述异源基因的上自己的文化的影响。为此,利用荧光基因如EYFP和EGFP的既可以使一个新的用户,以测试靶向精度和也遵循通过异源基因表达的细胞的存活率随着时间13持续的时期。许多可靠的关键步骤且可重复使用该协议在以下三段突出显示。
对于高效的转染,所述DNA浓度必须适当。浓度过低会妨碍转屈服而浓度是太高会导致纳米颗粒的附聚。黄金的聚集体可以显着降低转染效率,导致不均匀的分布,并且可以导致增加的细胞毒性和氧化胁迫。与涂覆效率的问题很可能是由于亚精胺溶液期满(应改为每2〜3个月)。对于适当的基因枪传播,标签必须是偶数。金纳米颗粒/ DNA悬浮液的非均相标记可能是由于PVP的溶液。它也应更换,每2至3个月。黄金纳米粒子的涂层,可以看到在琼脂糖凝胶电泳更高MW波段27。
每个生物SYST根据调查青霉以及使用可能需要在气体压力的微小变化,达到转染和基因枪传播的优化水平各个不同的仪器。关键参数是剥离从塑料盒中的微米或纳米载体和推动它们进入组织所需的氦脉冲的压力。高气体压力会影响细胞存活,因为它会造成整个目标冲击波,破坏或从基质17中分离的组织。针对基因枪管和具有完全垂直于组织的装置是用于精确基因枪递送重要。所选择的区域应当放置在枪管的直接中心在从外开口恰恰10mm以下。这将导致一个直径3毫米的震中周围的金颗粒递送。基因枪枪管应在每次使用后70%的乙醇进行清洗。为了防止大颗粒聚集体组织,桶中还含有尼龙网的SHOULD定期更换以保持最佳性能。为了更换筛网拧开盖子然后将盖和O形环之间的新的尼龙网。
2天震中周围染后 – 荧光标记的细胞应该至少1是可见的。没有或标签错位可导致制剂基因枪安装的不足和不稳定。使用共聚焦显微镜细胞的观察结果取决于许多因素:在激发/发射光的波长,针孔大小,物镜的NA,组件中的光路的折射率,所述组织,并且对齐的深度仪器。这些因素应为每个系统在调查进行优化。
在基因枪法的最新进展进行了利用这种方法的成功。在本研究中使用的基因枪管,以便减少所需的压力以及漏斗生物射弹已被修改散射图案融入了更多的限制和具体的区域17,19。其他桶改装试图限制基因枪传播,减少流出压力28但这种定制设计的基因枪枪管由奥布莱恩博士设计是安装在标准的Helios基因枪单个组件。接着,亚微米的金颗粒被用来减少我们先前已经确定的微米颗粒的浸润引起的细胞损伤,并最终持续异源基因表达的丧失。这些变化的生物射弹方法改进了方法13的整体可行性和可重复性。片上制备其他诸如深入的故障排除在切片过程中,使用的DMEM琼脂糖基质以保护大脑,和许多其他有用的进步,器官型脑片的制备此前报道13使我们能够探索利用成人片了已经开发成熟突触网络。
在我们的研究中,我们主要使用的染料和荧光异源基因以可视化细胞的形态作为转染效率的读出,并有能力将图像的小鼠脑组织的神经元的形态学特征。该信号所定义的范围内随机配送的信噪比使我们的母语环境中完全分离单个细胞的树突状海港。无数的努力被用来研究这些形态特征,绘制“connectomics”或标记单个细胞的各种分析,这种方法可以很容易地与现有的协议,如电生理和神经突起的测量29,30组合。显然,荧光异源基因的组合可以使一个更强大的划分单细胞荧光蛋白的随机分布,他们的组合将确定各个单元31,32的颜色。使用细胞特异性启动子,如突触蛋白和胶质原纤维酸性蛋白的异源基因的外显子的上游,也可以限制为表达对亚群33。事实上,无休止各种遗传物质,也可以在一个区域选择性地通过使用相同的过程金纳米颗粒递送。的总转染区域因此可以用传统的方法,如解剖并提交该区域的免疫印迹分析,异源基因的局部效果进行分析。
在器官切片程序的改进也将允许更广泛地使用脑组织的长期试验,以及允许使用其它组织和共培养的,并能促进转染程序。脂和聚合物的转染之前已经报道了影响膜稳态,内化,蛋白渗透率34和经常表现出非常低的效率,转染德rminally分化的神经元。小区特定货物的定位也适合仅向细胞中表达所需的内在化的细胞表面受体,并且虽然这种方法可以是高度选择性的,它可以缺乏靶向区域选择性35。病毒载体否则往往困难和昂贵的生产,需要严格的法规,并且对之际显示的安全性顾虑。基因枪递送因而具有无与伦比的能力,可行的组织中,以区域选择性转染神经元和其他类型的细胞。作为金是非在用基因枪法有毒,进一步进展将铺路生物医学用途,例如经皮药物递送,非侵入性的体内基因递送,以及局部的非病毒基因疗法。
The authors have nothing to disclose.
笔者想感谢的MRC-LMB车间生产的增强型基因枪枪管。我们还要感谢大卫·R·汉普森博士在多伦多大学使用的设备和资源。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |