Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
Transfektion af DNA har været uvurderlig for biologiske videnskaber og med de seneste forskud til organotypiske hjerne skive præparater, kan effekten af forskellige heterologe gener således undersøges nemt samtidig opretholde mange aspekter af in vivo biologi. Der har været en stigende interesse for at transficere terminalt differentierede neuroner, for hvilke traditionelle transfektionsfremgangsmåder har været behæftet med vanskeligheder, såsom lave udbytter og betydelige tab i levedygtighed. Biolistisk transfektion kan omgå mange af disse vanskeligheder alligevel kun for nylig er denne teknik blevet modificeret, så det er modtagelig til anvendelse i mammale væv.
Nye ændringer speederen kammer har forbedret genkanonen fyring nøjagtighed og øget sine dybder penetration samtidig tillader anvendelse af lavere gastryk (50 psi) uden tab af transfektionseffektiviteten samt tillader en fokuseret regioselektiv spredning af paRTIKLER inden for 3 mm. Desuden er denne teknik er ligetil og hurtigere at udføre end kedelige microinjections. Både forbigående og stabil ekspression er muligt med nanopartikel bombardement hvor episomal ekspression kan detekteres inden 24 timer og den celle overlevelse viste sig at være bedre end, eller i det mindste svarer til, konventionelle metoder. Denne teknik har imidlertid en afgørende fordel: den tillader transfektion at være lokaliseret i en enkelt behersket radius således at brugeren anatomisk isolere heterologe gen virkninger. Her præsenterer vi en grundig protokollen til at forberede levedygtige voksne organotypiske skiver og indsende dem til regioselektive transfektion ved hjælp af en forbedret gen pistol.
Oprindeligt biolistiske teknik, en turn-of-sætning til "biologiske ballistik", blev oprettet med partikel-medieret genoverførsel i planteceller 1. Denne fysiske metode celletransformation accelererer mikro- eller nanopartikler ved høj hastighed for at overvinde de fysiske barrierer i det uigennemtrængelige cellemembraner for at levere laster, såsom DNA eller farvestoffer. Fordi det ikke er afhængig af specifikke ligand-receptorer og / eller biokemiske egenskaber på celleoverfladen membraner, kan partikel-medieret genoverførsel let anvendes til en række af biologiske systemer som organotypiske hjernesnit.
Brug organotypiske skiver har fordele i forhold til andre in vitro-platforme, da de opretholder mange anatomiske og biokemiske egenskaber, der er relevante for in vivo biologi 2-4. Skiverne meste bevare de lokale arkitektoniske karakteristika fra, hvor de har oprindelse og preserve neurokemiske aktivitet og tilslutning af synapser. Brugen af hjerneskiver til grundforskning, og i farmaceutiske bestræbelser, har samtidig øges med antallet af mulige bioteknologiske manipulationer til at måle og overvåge neurobiologiske adfærd i hjernen i en in vivo ligesom sammenhæng 3,5-7. De store fordele ved at bruge organotypiske skive-baserede assay-systemer er, at det giver nem eksperimentel kontrol og tillader præcise manipulationer af ekstracellulære miljøer.
Frugtbart, har organotypisk skive kultur systemer er etableret fra en række forskellige områder af hjernen, såsom, men ikke begrænset til, cortex, rygmarv, og lillehjernen 8-10. Desuden er der påvist en række cokulturer, som giver mulighed for vurdering af intercellulære kommunikation på tværs distale hjerneregioner samt mellem neuroner og patologiske celler 11,12. Mange protokoller er allerede blevet etableret for at successfully kultur organotypiske skiver og kan opretholde langsigtede rentabilitet og mange nyere undersøgelser nu udnytte de membran-interface metoder og forskellige modifikationer af det 13. Dette princip fastholder de organotypiske skiver på grænsefladen mellem mediet og inkubatoren er fugtig atmosfære ved at placere skiver på en porøs membran-filter. Mediet kan således give tilstrækkelige næringsstoffer til at fodre organotypiske skiver via kapillær bevægelse. Typisk skiver er blevet fremstillet fra begyndelsen af postnatale dyr (3 – 9 dage gamle P3 – 9). Imidlertid hjernevæv fra disse skiver vise et højt niveau af cellulær plasticitet og har en iboende modstandsdygtighed over for mekaniske påvirkninger, som er nyttige til opnåelse af levedygtige kulturer, men modne synapser og neuroanatomiske kredsløb har ikke fuldt udviklet in vivo indtil 2 til 3 uger gamle 14. For eksempel havde tidligere bemærkninger vist, at hippocampusskiver opnået fra P0 – 1 nyfødte, selvom meget viaBle efter tilberedningen efterhånden mistet nogle morfologiske karakteristika. Væsentlige, blev de vist sig at være uegnede til langvarige kulturer tyder umodne celler var mere tilbøjelige til at de-differentiere i forhold til organotypiske kulturer fra ældre dyr 15,16. Af denne grund vores metode er blevet optimeret for voksne organotypiske hjerneskiver hvor modning og arkitektoniske udvikling har nået deres terminale fase 13,17-21. Ikke desto mindre er denne metode er også egnet til nyfødte og unge organotypiske skiver.
Når man har produceret de levedygtige organotypiske skiver hele pladen indeholder skiverne kan bringes til biolistiske mount og indsendes til regioselektive levering og transfektion. Korrekt montering af genkanonen (som beskrevet i figur 1), orienteret 90 ° i en afstand på 10 mm direkte over skiverne (fra åbningen til væv), tillader den hurtige biolistisk levering af de 40 nm gåld partikel belagt laster. Disse laster såsom farvestoffer og fluorescerende DNA-vektorer, såvel som enhver gen af interesse, let leveres til de levedygtige skiver med lethed. Beskriver denne metode således protokollen er nødvendige for at levere, i en regioselektiv måde, fragt belagt guld nanopartikler til levedygtige organotypiske hjerneskiver. Genet geværløbet og optimal montering kan ses i figur 1. For yderligere oplysninger om de forbedrede tønde og nanopartikler ballistik, se O'Brien et al. 17..
Efterfølgende forbedringer er også angivet for brugeren at optimere forhold som den rette mængde guld leveret pr målområdet, defineret som microcarrier Loading Mængde (MLQ), og for at bestemme mængden af DNA indlæst per mg guld, defineret som DNA Loading Ratio (DLR). Forud for bundfældning af DNA på guldpartikler og lægger dem i Tefzel slanger, der omfatter selve gen pistol 'patroner9 ;, er det nødvendigt at beregne mængden af DNA og guld kræves for hver transfektion, som kan adskille sig lidt væv og forhold (forholdet bør holdes mellem 1 mg guld og 1 ug DNA til 1: 5). Det er vigtigt at forberede den korrekte andel af MLQ DLR andet DNA coatede guldpartikler kan klæbe sammen danner større end forventet byområde, hvilket kan reducere den samlede homogenitet biolistiske spredning samt øge vævsskade og cytotoksicitet.
Denne metode viser de seneste forbedringer i biolistisk levering, som er testet og bestemt til at være modtagelig for neonatale, unge og voksne organotypiske hjerneskiver. Endvidere, ved at udnytte gen geværløbet reducerede biolistisk spredning, brugeren er nu i stand til selektivt at transficere en punktlig region i hjernen. Efter passende inkubationstid, ekspressionen af de fluorescerende proteiner, der når sin maksimale satserne mellem 24 og 48time, kan visualiseres ved epifluorescens og konfokal mikroskopi. Disse fluorophorer tillade morfologisk analyse og lokalisering af de enkelte celler i biologisk relevante strukturer. Imidlertid kan regioselektive graduering af de organotypiske skiver af andre heterologe gener også blive overvåget af andre forsøg modtagelige for disse præparater. Mulige arbejder strategier for lokal levering af gener er vist i figur 2.
Protokollen beskriver metoder til at levere farvestoffer og genetisk materiale til voksne organotypiske skiver ved anvendelse af et forstærket gen pistol. Væsentlige, de typer af farvestoffer og de mange forskellige mulige gener gør denne metode mangesidet og medgørlige til at besvare en lang række biologiske spørgsmål. Den regioselektive levering anvendte metode i dette tilfælde til specifikke område af hjernen, åbner nye muligheder for eksperimenter som heterologt gen graduering af lokaliserede områder inden for en biologisk relevant arkitektur har ikke været let at gøre før. Vi har tidligere bestemt, at denne metode kan anvendes på voksne organotypiske skiver, hvor modne synapser er fuldt dannet, da det viste forbedret celleoverlevelse og heterolog genekspression i mange uger 13. Med fremkomsten af nye og forbedrede dyrkningsbetingelser for mammale hjerner samt andre væv, vil brugen af regioselektive genetiske modulationer blevet stadig mere anvendelige til en bred vifte af BiocheMICAL analyser.
Som vi skal fremhæve her og tidligere nævnt af andre 24, kan mange forskellige faktorer let påvirke nøjagtigheden og pålideligheden af biolistisk levering. For det første skal fremstillingen af guldpartikler bundet til farvestoffer eller DNA tilstrækkeligt afbalanceret til at forhindre aggregering og lette patronen last udvisning. Calcium og spermidin i DNA-guld mikropartikler løsning kan hjælpe binding af DNA-molekyler til nanopartiklerne af guld. Muligheden for nanopartikler til at trænge ind i cellerne under reduceret tryk blev bestemt tidligere 17. For det andet skal genkanonen monteres så stabil som muligt med den korrekte vinkel og afstand. En pålidelig trykmåler er også nødvendig for reproducerbarhed, for at opretholde væv integritet, og til korrekt accelerere guldpartiklerne til deres tilsigtede mål. Faktisk afstand, retning og stabilitet af udstyret er også en afgørende faktorer for targeting og præcision regioselektiv levering. Da disse hjernens strukturer er meget lille, kunne mindre variationer i affyringen vinkel nemt gøre hele proceduren mindre pålidelige. Og endelig, udarbejdelse og vedligeholdelse af levedygtige organotypiske skiver har været behæftet med vanskeligheder i mange årtier endnu rigelige og pålidelige protokoller for forskellige dyr, hjerne regioner, aldre og cokulturer er i øjeblikket tilgængelige 2,4,25,26. Disse procedurer bør være brugervenlig optimeret inden fremlæggelsen servietterne biolistiske procedurer. Dette vil lettere tillade brugeren at unbiasedly fastslå virkningen af biolistiske partikler og virkningen af det heterologe gen på deres egne kulturer. Til dette formål, kan brugen af fluorescerende gener, såsom EYFP og EGFP både tillade en ny bruger til at teste målretning præcision og også følge den cellulære levedygtighed ved heterolog genekspression i en længere periode 13. Mange af de kritiske trin for pålideligog reproducerbar brug af denne protokol, er fremhævet i de følgende tre stykker.
Til effektiv transfektion, skal DNA-koncentrationen være passende. Koncentrationer, der er for lavt vil kunne hindre transfektion udbytte, mens koncentrationer, der er for høj, kan forårsage agglomerering af nanopartikler. Aggregater af guld kan dramatisk reducere transfektionseffektivitet forårsage ujævne fordelinger, og kan føre til øget cytotoksicitet og oxidativ stress. Problemer med belægning effektivitet er sandsynligvis på grund af udløbet af spermidin opløsning (skal udskiftes hver 2 til 3 måneder). For en tilstrækkelig biolistisk spredning, skal mærkningen være endnu. En ikke-homogen mærkning af guld nanopartikel / DNA-suspensionen kan skyldes PVP opløsning. Det skal også udskiftes hver 2 til 3 måneder. Belægning af nanopartiklerne af guld kan ses på agarosegelelektroforese som en højere MW-bånd 27.
Hver biologisk System, der undersøges, samt hver anden instrument, der anvendes kan kræve små ændringer i gastryk at nå optimerede niveauer af transfektion og biolistisk spredning. Den kritiske parameter er trykket af helium puls kræves for at fratage mikro- eller nano-bærere fra plasten patron og drive dem ind i vævet. Et højt gastryk vil påvirke celleoverlevelse, fordi den vil skabe chokbølger over målet og forstyrre eller fjerne væv fra matricen 17. Sigter genet geværløbet og under apparatet nøjagtigt vinkelret på vævet er vigtig for nøjagtig biolistisk levering. Det valgte område skal placeres i direkte centrum af tønden på præcis 10 mm fra den ydre åbning. Dette resulterer i en diameter på 3 mm af guldpartikler levering omkring epicentret. Genet geværløbet skal rengøres med 70% ethanol efter hver brug. For at beskytte væv fra store partikelaggregater, cylinderen indeholder også et nylonnet, der shoULD udskiftes jævnligt for at opretholde optimal ydeevne. For at erstatte masken skru hætten derefter indsætte en ny nylonnet mellem hætten og O-ringen.
Fluorescens-mærkede celler skal være synlige mindst 1 – 2 dage efter transfektion omkring epicentret. Manglende eller forskydning af mærkningen kan skyldes utilstrækkelig forberedelse og ustabilitet genkanonen montering. Observationerne af celler ved hjælp af konfokal mikroskopi afhænger af en række faktorer: bølgelængden af excitation / emission lys, pinhole størrelse, NA i objektivlinsen, brydningsindeks af komponenter i strålegangen, dybde af vævet, og tilpasning af instrumentet. Disse faktorer bør optimeres for hvert system, der undersøges.
Nylige fremskridt i biolistik blev udnyttet for succes i denne metode. Genet geværløbet anvendt i denne undersøgelse blev ændret for at mindske presset nødvendig samt tragt biolistiskescatter mønster i et mere begrænset og bestemt område 17,19. Andre tønde modifikationer har forsøgt at begrænse biolistiske spredning og mindske udstrømningen tryk 28 endnu denne specialfremstillede genkanon tønde designet af Dr. O'Brien er en enkelt komponent monteret på standard Helios Gene pistol. Efterfølgende blev sub-mikrometer guldpartikler anvendes til at reducere invasiv mikrometer partikler, som vi tidligere havde bestemt forårsagede cellulær skade og i sidste ende tab af vedvarende heterolog genekspression. Disse ændringer i biolistiske procedure forbedret den samlede gennemførlighed og metodens reproducerbarhed 13. Andre forbedringer på skive forberedelse såsom dybdegående fejlfinding af udskæring procedure, ved hjælp af en DMEM-agarosematrix at bevare hjernen, og mange andre nyttige fremskridt i organotypisk hjerne skive forberedelse tidligere rapporterede 13 muligt for os at udforske brugen af voksne udsnit, har udviklet modnesynaptiske netværk.
I vores undersøgelse anvendes hovedsagelig vi farvestoffer og fluorescerende heterologe gener til at visualisere cellemorfologi som en udlæsning på transfektionseffektivitet og en evne til billede morfologiske karakteristika af neuroner i mus hjernevæv. Signal-støjforholdet af den stokastiske levering inden for en defineret radius for at aktiveret os til helt at isolere en enkelt celles dendritiske havn i sin native kontekst. Som mange bestræbelser er vant til at undersøge disse morfologiske kendetegn, at kortlægning 'connectomics «eller etiket enkelte celler til forskellige analyser, kan denne metode nemt kombineres med de eksisterende protokoller såsom elektrofysiologi og neurit målinger 29,30. Åbenbart kunne kombinationer af fluorescerende heterologe gener muliggøre en langt mere robust afgrænsning af enkelte celler som den stokastiske fordeling af fluorescerende proteiner, og deres kombination vil bestemme farven på de enkelte celler 31,32. Anvendelsen af cellespecifikke promotorer, såsom synapsin og glial fibrillært syreprotein opstrøms for det heterologe gen exon kan også begrænse udtrykket til subpopulationer 33. Faktisk kunne den endeløse række af genetisk materiale også leveres i en regioselektiv måde ved guld nanopartikler anvender samme procedure. De samlede transficeret regioner kan således analyseres med traditionelle metoder, såsom dissektion og afgiver denne region til vestlig immunblotting at analysere lokal virkning af det heterologe gen.
Forbedringer i organotypiske skive procedurer vil også muliggøre en bredere anvendelse af hjernevæv for langsigtet eksperimenter samt tillade brugen af andre væv og cokulturer og ville lette transfektionsfremgangsmåder procedurer. Lipid og polymer transfektion er tidligere blevet rapporteret at påvirke membranen homeostase, internalisering, protein permeabilitet 34 og ofte viser meget lav effektivitet til transfektion af terminally differentierede neuroner. Cellespecifik last målretning er også modtagelig kun til celler, der udtrykker celleoverfladereceptorer nødvendige for internalisering, og selv om denne metode kan være meget selektiv, kan det ikke har tilstrækkelige målrettet regioselektivitet 35. Virale vektorer ellers ofte er vanskeligt og dyrt at fremstille, kræver strenge regler og har til tider demonstreret sikkerhedsproblemer. Biolistisk levering har således en enestående evne til regioselektivt transficere neuroner og andre celletyper i levende væv. Da guld er ikke giftige, yderligere fremskridt i brugen af biolistik kunne bane vejen for biomedicinske anvendelser, såsom transdermal farmaceutisk levering, invasiv in vivo gen-levering, samt lokaliserede virale genterapi.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke MRC-LMB værksted til produktion af den forbedrede gen geværløbet. Vi vil også gerne takke Dr. David R. Hampson ved University of Toronto for brug af udstyr og ressourcer.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |