Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
Transfektion von DNA ist von unschätzbarem Wert für die biologische Wissenschaften und mit der jüngsten Fortschritte auf organotypischen Hirnschnittpräparaten, könnte die Wirkung von verschiedenen heterologen Genen somit leicht untersucht werden, während viele Aspekte der in-vivo-Biologie. Gab es eine wachsende Interesse terminal differenzierten Neuronen, bei denen konventionelle Methoden der Transfektion wurden mit Schwierigkeiten wie niedrige Renditen und erhebliche Verluste der Lebensfähigkeit transfizieren. Biolistischen Transfektion umgehen viele dieser Schwierigkeiten noch vor kurzem wurde diese Technik so modifiziert, dass sie zugänglich sind für die Verwendung in Säugetiergeweben.
Neue Modifikationen an der Beschleunigerkammer haben Brenn Genauigkeit der Gen-Kanone verbessert und erhöhte seine Eindringtiefen aber auch die Verwendung von niedrigeren Gasdruck (50 psi) ohne Verlust der Effizienz der Transfektion ermöglicht sowie Genehmigungs eine fokussierte regioselektive Ausbreitung der paRTIKELN innerhalb 3 mm. Darüber hinaus ist diese Technik geradlinig und schneller durchzuführen als mühsame Mikroinjektionen. Sowohl transiente und stabile Expression mit Nanopartikeln Beschuss möglich, wo die episomale Expression innerhalb von 24 Stunden nachgewiesen werden, und das Überleben der Zellen wurde gezeigt, besser als oder zumindest gleich zu herkömmlichen Methoden. Diese Technik hat allerdings einen entscheidenden Vorteil: Es ist die Transfektion innerhalb eines einzigen zurückhaltend Radius lokalisiert werden somit dem Benutzer ermöglicht, Auswirkungen der heterologen Gens anatomisch isolieren lässt. Hier präsentieren wir Ihnen eine ausführliche Protokoll, um lebensfähige Erwachsene organotypischen Scheiben und legt diese der Transfektion regioselektive Verwendung eines verbesserten Gen-Kanone.
Ursprünglich wurde für Partikel-vermittelten Gentransfer in Pflanzenzellen 1 das biolistische Technik, eine Turn-of-Phrase für "biologische Ballistik", etabliert. Diese physikalische Methode der Zelltransformation beschleunigt Mikro-oder Nanopartikel mit hoher Geschwindigkeit, um die physischen Barrieren der undurchlässigen Zellmembran, um Ladungen wie DNA-oder Farbstoffe liefern zu überwinden. Weil es nicht auf spezifische Liganden-Rezeptoren und / oder biochemischen Eigenschaften an den Zelloberflächenmembranen abhängen, können Teilchen-vermittelten Gentransfer ohne weiteres auf eine Vielzahl von biologischen Systemen angewandt werden, wie organotypischen Hirnschnitten.
Mit organotypischen Scheiben haben Vorteile gegenüber anderen In-vitro-Plattformen, da sie viele anatomische und biochemische Eigenschaften, die relevant für in vivo Biologie 2-4 zu halten. Die Scheiben meist zur Erhaltung der lokalen architektonischen Merkmale, von wo sie ihren Ursprung haben und preserve neurochemische Aktivität und Konnektivität der Synapsen. Die Verwendung von Gehirnscheiben für Grundlagenforschung, und in pharmazeutischen bemüht hat, die gleichzeitig mit der Anzahl der möglichen biotechnologische Manipulation zu messen und zu überwachen, die neurobiologischen Verhalten des Gehirns in einem in vivo-Kontext wie 3,5-7 erhöht. Die wesentlichen Vorteile für die Verwendung von organotypischen basierenden Assay-Systemen ist, dass es einfach experimentelle Kontrolle und ermöglicht eine präzise Manipulation der extrazellulären Umgebung.
Fruchtbar sind organotypischen Kultursystemen aus einer Vielzahl von Hirnregionen, wie festgestellt wurde, jedoch nicht beschränkt auf, den Kortex, das Rückenmark und Kleinhirn 8-10 beschränkt. Darüber hinaus wurde eine Reihe von Co-Kulturen nachgewiesen worden, die die Bewertung der interzellulären Kommunikation über distalen Hirnregionen sowie zwischen Neuronen und pathologische Zellen 11,12 ermöglichen. Viele Protokolle haben bereits zu s etabliertuccessfully Kultur organotypischen Slices und kann langfristige Lebensfähigkeit zu erhalten und viele neuere Studien jetzt nutzen die Membran Interface-Methoden und verschiedene Modifikationen, um es 13. Dieses Prinzip hält die organotypische Scheiben an der Grenzfläche zwischen dem Medium und feuchten Atmosphäre des Inkubators, indem die Scheiben auf einem porösen Membranfilter. Das Medium kann somit genügend Nährstoffe, um die organ Scheiben über Kapillare Bewegung zu ernähren. (; – 9 – 9 Tage alt P3 3) in der Regel Scheiben wurden aus der frühen postnatalen Tieren erstellt. , Hirngewebe von diesen Scheiben zeigen jedoch eine hohe zelluläre Plastizität und eine inhärente Widerstandsfähigkeit gegen mechanische Belastungen, die hilfreich ist, um lebensfähige Kulturen zu erhalten, noch nicht ausgereift Synapsen und neuroanatomische Schaltungen sind noch nicht vollständig in vivo bis 2 bis 3 Wochen alt entwickelt 14. Zum Beispiel hatten frühere Beobachtungen, dass Hippocampus von P0 erhalten gezeigt – 1 Neugeborenen, obwohl hoch VIABle nach der Herstellung, nach und nach verloren einige morphologische Merkmale. Im Wesentlichen haben sie gezeigt wurden für Langzeitkulturen hindeutet unreifen Zellen ungeeignet waren eher dedifferenzieren Vergleich zu organotypischen Kulturen von älteren Tieren 15,16. Aus diesem Grund hat unsere Methode für erwachsene organotypischen Hirnschnitten, bei der Reifung und architektonische Entwicklung haben ihren Endstadien 13,17-21 erreicht optimiert. Dennoch ist dieses Verfahren auch geeignet für Neugeborene und juvenile organotypischen Slices.
Sobald die lebensfähigen organotypischen Scheiben hergestellt worden die gesamte Platte mit den Slices können dem biolistischer Halterung gebracht und vorgelegt und Transfektion regioselektive werden. Ordnungsgemäße Montage der Genkanone (wie in Figur 1 beschrieben), die um 90 ° in einem Abstand von 10 mm direkt über die Scheiben (von der Öffnung zu dem Gewebe) ermöglicht die schnelle biolistische Abgabe der 40 nm gehenld Partikelladungen beschichtet. Diese Ladungen, wie Farbstoffe und fluoreszierende DNA-Vektoren, wie auch ein beliebiges Gen von Interesse sind, leicht in die lebensfähigen Schichten mit Leichtigkeit geliefert werden. Diese Methode beschreibt somit das Protokoll notwendig, um zu liefern, in einer regioselektive Weise, Fracht beschichteten Gold-Nanopartikel in lebensfähige organotypischen Hirnschnitten. Das Gen Gewehrlauf und optimale Montage ist in Abbildung 1 zu sehen ist. Für weitere Informationen zu den verbesserten Lauf und Nanopartikel-Ballistik, finden Sie O'Brien, et al. 17.
Nachfolgende Verfeinerungen sind ebenfalls angegeben, dass der Benutzer Bedingungen, wie die richtige Menge an Gold pro Zielgebiet geliefert, definiert als Mikro Wird geladen (MLQ) zu optimieren und die Menge an DNA pro mg Gold beladen, definiert als DNA-Loading-Verhältnis zu bestimmen (DLR). Vor der Fällung DNA auf Goldpartikel und dem Einlegen in den Tefzel Schläuche, die die eigentlichen Gen-Kanone "Patronen umfasst9 ;, ist es notwendig, die Menge an DNA und Gold für jede Transfektion benötigt, die unter Gewebebedingungen leicht abweichen kann berechnet (Verhältnis sollte zwischen 1 mg Gold und 1 ug DNA erhalten werden, 1: 5). Es ist wichtig, die richtige Anteil der MLQ vorbereiten, DLR, da sonst DNA beschichteten Goldpartikel könnten aneinander haften Bildung größer als erwartet Agglomeration, die die Homogenität des Gesamt biolistischer Verbreitung zu erhöhen sowie Gewebeschäden und Zytotoxizität reduzieren könnte.
Diese Methode zeigt die jüngsten Verbesserungen in biolistischer Lieferung, die als Test zugänglich für Neugeborene, jugendlichen und erwachsenen organotypischen Hirnschnitten zu sein. Ferner kann durch Nutzung der Genkanone Fasses verringert biolistische Ausbreitung ist der Benutzer nun in der Lage, eine punktuelle Bereich selektiv zu transfizieren im Gehirn. Nach der entsprechenden Inkubationszeit wurde die Expression von fluoreszierenden Proteinen, die ihre Maximalwerte zwischen 24 und 48 erreicht,hr, kann durch Epifluoreszenz und konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht werden. Diese Fluorophore erlauben die morphologische Analyse und Lokalisierung von einzelnen Zellen innerhalb biologisch relevanten Strukturen. Jedoch kann die regioselektive Modulation der organotypischen Scheiben durch andere heterologe Gene auch durch andere Tests zugänglich dieser Präparate beobachtet werden. Mögliche Arbeits Strategien zur lokalisierten Genübertragung sind in Abbildung 2 dargestellt.
Das Protokoll beschreibt Ansätze für Farbstoffe und genetischen Materialien in das Erwachsenen organotypischen Scheiben mittels eines erweiterten Gen-Kanone zu liefern. Im Wesentlichen machen die Arten von Farbstoffen und die Vielfalt der möglichen Gene dieses Verfahren vielfältig und offen für ein breites Spektrum an biologischen Fragen zu beantworten. Die regioselektive Liefermethode verwendet, in diesem Fall auf bestimmte Gehirnregion, eröffnet neue Wege für Experimente als heterologe Gen Modulation der lokalisierten Bereichen innerhalb einer biologisch relevanten Architektur ist nicht leicht möglich gewesen, bevor. Wir haben früher festgestellt, dass dieses Verfahren auf die Erwachsenen organotypischen Scheiben, wobei reifen Synapsen vollständig ausgebildet, wie es zeigte verbessertes Zellüberleben und die heterologe Genexpression für viele Wochen 13 verwendet werden. Mit dem Aufkommen von neuen und verbesserten Kulturbedingungen für Säugetier Gehirn und andere Gewebe, ist die Verwendung von regioselektive genetischen Modulationen immer nützlich für eine Vielzahl von Bioche werdenchemische Analysen.
Wie wir hier und sorgen für die Heraus zuvor von anderen 24 erwähnt, könnte viele verschiedene Faktoren leicht auf die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der biolistischer Lieferung. Erstens muss die Herstellung der Goldpartikel zu Farbstoffen oder DNA verknüpft ausreichend ausgeglichen werden, um eine Aggregation zu verhindern und um die Kassette Ladung Austreibung erleichtert. Calcium und Spermidin in der DNA-Goldmikropartikel-Lösung kann die Bindung von DNA-Molekülen an die Gold-Nanopartikel zu unterstützen. Die Fähigkeit der Nanopartikel, um die Zellen unter vermindertem Druck durchdringen vorher bestimmten 17 wurde. Zweitens muss der Genkanone möglichst konstant mit der richtigen Winkel und Abstand montiert werden. Eine zuverlässige Druckanzeige ist auch die Reproduzierbarkeit erforderlich, um die Gewebeintegrität zu halten und um richtig zu beschleunigen die Goldpartikel, um ihre beabsichtigten Ziele. Tatsächlich sind auch der Abstand, die Ausrichtung und Stabilität des Gerätes eine entscheidende Faktoren für die targeting und Präzision der regioselektiven Lieferung. Da diese Gehirnstrukturen sind sehr klein, könnten kleinere Variationen in der Zündwinkel leicht machen das gesamte Verfahren weniger zuverlässig. Und schließlich haben die Vorbereitung und Wartung von lebensfähigen organotypischen Scheiben mit Schwierigkeiten für viele Jahrzehnte voller wurden noch reichlich vorhanden und zuverlässige Protokolle für verschiedene Tiere, Hirnregionen, Alter und Co-Kulturen sind derzeit 2,4,25,26. Diese Verfahren sollten Benutzer-optimiert, bevor sie die Gewebe biolistischer Verfahren. Dies wird leichter erlauben dem Benutzer, festzustellen, unbefangen die Auswirkungen der biolistischen Teilchen und die Wirkung des heterologen Gens in ihrem eigenen Kulturen. Zu diesem Zweck kann die Verwendung von Fluoreszenzgene wie EYFP und EGFP beide ermöglichen eine neue Benutzer die Zielgenauigkeit testen und zusätzlich die zelluläre Lebensfähigkeit durch heterologe Genexpression über einen längeren Zeitraum 13. Viele der kritischen Schritte für eine zuverlässigeund reproduzierbare Verwendung dieses Protokolls sind in den folgenden drei Absätze hervorgehoben.
Für eine effiziente Transfektion, muss die DNA-Konzentration geeignet. Konzentrationen, die zu niedrig sind, würden die Transfektion Ausbeute behindern, während Konzentrationen, die zu hoch sind, können Agglomeration der Nanopartikel führen. Aggregate von Gold drastisch reduzieren können Transfektionseffizienz, zu einer ungleichmäßigen Verteilung und kann zu einer erhöhten Zytotoxizität und oxidativen Stress führen. Probleme mit Beschichtungseffizienz wahrscheinlich aufgrund des Ablaufs der Spermidin-Lösung (sollten alle 2 bis 3 Monate ersetzt werden). Für eine angemessene Verbreitung biolistischer, muss die Kennzeichnung auch sein. Eine nicht-homogene Markierung des Gold-Nanopartikel / DNA-Suspension kann durch die PVP-Lösung. Es sollte auch alle 2 bis 3 Monate ausgetauscht werden. Beschichtung der Gold-Nanopartikel können auf Agarose-Gelelektrophorese als eine Bande mit höherem Molekulargewicht 27 gesehen werden.
Jedes biologische Sysem untersucht sowie jedes andere Instrument könnten kleine Änderungen in der Gasdruck erfordern optimierte Ebenen der Transfektion und biolistischer Verbreitung zu erreichen. Der kritische Parameter ist der Druck des Heliumimpuls benötigt, um die Mikro-oder Nanoträger aus dem Kunststoff Kartuschenstreifen und treiben sie in das Gewebe. Ein hoher Gasdruck wird das Überleben der Zelle zu beeinflussen, weil sie Schockwellen in dem Ziel erstellen und unterbrechen und Abbau der Gewebe von der Matrix 17. Ziel der Genkanone Lauf und mit der Vorrichtung genau senkrecht zu dem Gewebe ist wichtig für eine genaue biolistischen Anlieferung. Der ausgewählte Bereich in der unmittelbaren Zentrum des Zylinders genau 10 mm von der äußeren Öffnung angeordnet werden. Dies führt zu einer 3 mm Durchmesser der Goldpartikelliefer um den Mittelpunkt. Das Gen Gewehrlauf sollte mit 70% Ethanol nach jeder Verwendung gereinigt werden. Um das Gewebe von großen Partikelaggregate zu schützen, enthält die Trommel auch ein Nylonnetz das ShoULD, um optimale Leistung zu erhalten regelmäßig ausgetauscht werden. Um ersetzen die Maschen schrauben Sie den Deckel legen dann eine neue Nylon-Mesh zwischen der Kappe und dem O-Ring.
2 Tage nach der Transfektion um das Epizentrum – fluoreszierend markierten Zellen sollten sichtbar mindestens 1 ist. Fehlen oder Fehlausrichtung der Markierung kann durch unzureichende Vorbereitung und Instabilität der Gen-Kanone Montage führen. Die Beobachtungen der Zellen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, hängt von einer Reihe von Faktoren ab: die Wellenlänge des Anregungs / Emissionslicht, Lochblendengröße, NA der Objektivlinse, der Brechungsindex der Komponenten in dem Lichtpfad, der Tiefe des Gewebes und der Ausrichtung das Instrument. Diese Faktoren sind für jedes untersuchte System optimiert werden.
Jüngste Fortschritte in der Biolistik wurden für den Erfolg dieser Methode ausgenutzt. Das Gen Geschützrohr in dieser Studie verwendet wurde, um den notwendigen Druck zu verringern sowie Trichter des biolistischen modifiziertenStreumuster in einer eingeschränkten und spezifischen Bereich 17,19. Andere Fass Änderungen haben versucht, die Ausbreitung zu begrenzen und biolistischer den Abfluss Druck 28 zu reduzieren noch diese kundenspezifische Gen Gewehrlauf von Dr. O'Brien entworfen ist eine einzelne Komponente der Standard Helios Gene Gun ausgestattet. Anschließend wurden Submikrometer-Goldpartikel verwendet werden, um die Invasivität der Mikropartikel, die wir zuvor bestimmt war verringern verursacht Zellschäden und letztlich Verlust der anhalt heterologe Genexpression. Diese Änderungen des biolistischen Verfahrens verbessert die allgemeine Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit des Verfahrens 13. Weitere Verbesserungen auf Schnittpräparat wie eingehende Fehlersuche an der Schneideverfahren mit einem DMEM-Agarose-Matrix, um das Gehirn zu erhalten, und zahlreiche andere nützliche Fortschritte in der organotypischen Hirnschnittpräparat bereits berichtet 13 konnten wir die Verwendung von adulten Scheiben zu erkunden, dass haben reife entwickeltsynaptischen Netzwerken.
In unserer Untersuchung haben wir hauptsächlich verwendeten Farbstoffe und fluoreszierende heterologe Gene Zellmorphologie als Auslese auf die Transfektionseffizienz und die Fähigkeit, Bild die morphologischen Eigenschaften von Neuronen im Gehirn der Maus Gewebe zu visualisieren. Das Signal-Rausch-Verhältnis des stochastischen Lieferung innerhalb eines definierten Radius konnten wir dendritischen Hafen einer einzelnen Zelle innerhalb seiner nativen Kontext vollständig zu isolieren. Zahlreiche Anstrengungen verwendet, um diese morphologischen Eigenschaften zu untersuchen, Mapping "connectomics" oder Einzelzellen für verschiedene Analysen zu markieren, kann dieses Verfahren leicht mit bestehenden Protokollen wie Elektrophysiologie und Neuriten Messungen 29,30 kombiniert werden. Offensichtlich könnten Kombinationen von fluoreszierenden heterologen Genen eine wesentlich stabilere Abgrenzung der einzelnen Zellen der stochastischen Verteilung von fluoreszierenden Proteinen zu ermöglichen, und deren Kombination würde die Farbe der einzelnen Zellen bestimmen 31,32. Die Verwendung von Zell-spezifische Promotoren wie Synapsin und gliale fibrilläre saure Protein stromaufwärts des heterologen Gen-Exon kann auch beschränken den Ausdruck Subpopulationen 33. Tatsächlich ist die unendliche Vielfalt des genetischen Materials könnte auch in einer regioselektive Weise durch Gold-Nanopartikel mit dem gleichen Verfahren geliefert werden. Die Gesamt transfiziert Regionen können so mit traditionellen Methoden, wie Präparation und Einreichung dieser Region Western-Immunoblotting, um die lokale Wirkung des heterologen Gens zu analysieren analysiert werden.
Verbesserungen in organotypischen Verfahren gestatten auch breitere Verwendung von Hirngewebe für die Langzeitversuche und erlauben die Verwendung von anderen Geweben und Mischkulturen und Transfektion erleichtern würde. Lipid und Polymer-Transfektion wurde bereits berichtet, um Membran Homöostase, Internalisierung, Proteindurchlässigkeit beeinflussen 34 und zeigen häufig sehr geringe Effizienz zu transfizieren terminally differenzierten Neuronen. Zellspezifischen Targeting Ladung ist auch zugänglich nur Zellen, die die Zelloberflächenrezeptoren für die Internalisierung benötigt exprimieren, und obwohl dieses Verfahren hochselektiv ist, kann sie gezielt Regioselektivität 35 Lack. Virale Vektoren sind sonst oft schwierig und teuer in der Herstellung, erfordern strengere Vorschriften und haben gelegentlich demonstriert Sicherheitsbedenken. Biolistic Lieferung hat somit eine einzigartige Möglichkeit, regioselektiv Transfektion von Neuronen und anderen Zelltypen innerhalb tragfähige Gewebe. Da Gold ist nicht toxisch, weitere Fortschritte bei der Verwendung von Biolistik den Weg für biomedizinische Anwendungen, wie transdermale Arzneimittelabgabephysiologischen in vivo Gentransfer sowie lokalisierten nichtvirale Gentherapie zu ebnen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten die MRC-LMB Werkstatt für die Herstellung der verbesserten Gen Gewehrlauf danken. Wir möchten auch Dr. David R. Hampson für die Verwendung von Geräten und Ressourcen danken an der Universität von Toronto.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |